一種人泛素偶聯酶UbcH10單克隆抗體雜交瘤DY02及單克隆抗體的製作方法
2023-05-20 06:30:36
專利名稱：一種人泛素偶聯酶UbcH10單克隆抗體雜交瘤DY02及單克隆抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞工程領域，具體涉及一種人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體雜交瘤DY02及單克隆抗體。
背景技術：
腫瘤的早期診斷對於腫瘤患者的治療和預後有著非常重要的意義，目前臨床常用的腫瘤標誌物諸如甲胎蛋白AFP和CEA缺乏足夠的檢測特異性和靈敏性，因此需要選擇更加特異性的檢測靶點。細胞內蛋白質降解主要有兩條途徑蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。多數短壽命的蛋白質通過蛋白酶體途徑降解。通過蛋白酶體途徑降解的蛋白質大部分首先要經過泛素化，然後由蛋白酶體降解。故該途徑又稱泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome pathway ；UPP)。WdcHIO屬於人類泛素蛋白酶體途徑中泛素偶聯酶家族成員之一，編碼與泛素依賴性蛋白降解有關的蛋白質——人類泛素偶聯酶E2C (ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C/UBCH10)，又稱細胞周期蛋白選擇性泛素載體蛋白(cyclin-selective ubiquitin carrier protein)，是泛素化途徑中細胞周期蛋白降解所必需的。近年來，由於該蛋白在細胞周期的調節、周期蛋白的降解、腫瘤的發生及腫瘤細胞的增殖、惡變、診斷及治療中的特殊地位而倍受關注。人類脅t^/O基因位於20號染色體，蛋白由179個胺基酸編碼而成，分子量在 19. 6kDa,由於WdcHIO在細胞周期的調節、周期蛋白的降解、腫瘤的發生及腫瘤細胞的增殖、惡變、診斷及治療中的特殊地位而倍受關注。近年來針對不同腫瘤的研究中，越來越多的數據顯示WdcHIO與腫瘤的關係十分密切，可促進細胞增殖和惡性轉化，但WDCHIO的特異性致瘤作用及致瘤機制仍需進一步研究。WdcHIO是一種與癌症相關的泛素偶聯酶，研究發現其在肺、胃、子宮、乳腺、卵巢、 膀胱等原發腫瘤組織中表達上調，且乳腺癌細胞中高表達WdcHIO可以促進乳腺癌細胞的增殖，抑制WdcHIO的表達可抑制乳腺癌細胞的生長。還有報導稱WDCHIO的表達與高侵襲性和惡性程度較高的甲狀腺癌相關，與卵巢癌的惡性程度也密切相關。同時消化道腫瘤肝癌、 食管癌、結腸癌以及結腸癌伴肝轉移都與泛素偶聯酶WdcHIO的高表達有聯繫，所有的臨床和實驗室研究均表明泛素偶聯酶WdcHIO有作為潛在的多種不同腫瘤的臨床診斷靶標的可能。因此製備泛素偶聯酶WdcHIO的單克隆抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研究奠定基礎，同時為其作為腫瘤標誌物的可行性提供實驗數據支持。由於人泛素偶聯酶WdcHIO屬於非分泌型表達蛋白，在臨床血清標本中含量較低， 基本很難檢測，通常在組織標本中表達量較高，具有臨床檢測和驗證的價值，目前報導的文獻不同腫瘤基本都是從基因水平或組織標本中檢測人泛素偶聯酶WdcHIO表達量升高。由此，製備能用於臨床標本免疫組化檢測的人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體進行大批量組織標本的驗證，可為其作為腫瘤臨床診斷靶標的驗證提供有力工具。本發明與現有的人泛素偶聯酶WdcHIO抗體相比具有以下的特點和優勢 目前尚未有國產化的人泛素偶聯酶WdcHIO的抗體，國外有一些公司有可以檢測
UbcHlO的抗體產品，但大多數是多抗產品，像Abnova Corporation公司是鼠源性的多抗，Boston Biochem, Inc.禾口 Millipore 公司是兔源性的多抗，Everest Biotech、 Novus Biologicals、Raybiotech, Inc.和 IMGENEX 公司是羊源性的多抗，另外 Santa Cruz Biotechnology, Inc.公司還有針對UbcHlO兩個不同片段的抗體產品，只有Novus Biologicals公司有針對人泛素偶聯酶E2C的鼠源性單抗產品，但其免疫原蛋白胺基酸序列為AAH50736包括180個胺基酸，且其單抗亞型為IgG3b 1型，只能用於ELISA和^festern。 同時，國外抗體的價格通常較昂貴，也限制了該蛋白作為臨床靶標驗證及其功能的研究。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能用於ELISA、western-blot、免疫螢光以及組織的免疫組化檢測的抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案
本發明所述的檢測人泛素偶聯酶W3CHlO的抗體都是用原核重組表達的人泛素偶聯酶 WdcHIO蛋白作為抗原免疫小鼠獲得，並用細胞融合技術獲得產生這種抗體的雜交瘤細胞株 DY02，雜交瘤細胞為IgGl陽性，輕鏈均為κ型。所述抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體雜交瘤DY02，於2010年11月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 43；35。本發明中人泛素偶聯酶WdcHIO的胺基酸序列為AAH16^2，如SEQ ID NO :1所示。 本發明中人泛素偶聯酶WdcHIO的基因序列為NM_007019，如SEQ ID NO 2所示。本發明中WdcHIO的全長基因是由肝癌細胞H印G2中由RT-PCR的方法釣取。擴增人泛素偶聯酶WdcHIO基因的引物序列為上遊引物5』 - GTCGGATCCATGGCTTCCCAAAACCG -3，(SEQ ID NO :3)，下遊引物5' - ATTGCGGCCGCTTAGGGCTCCTGGCTGG -3，(SEQ ID NO :4)。 上遊弓I入BamH I內切酶位點，下遊引入Not I內切酶位點。原核表達載體選擇pET_22b (+ )。所述的保藏號為CGMCC No. 4335的雜交瘤細胞株DY02的製備方法是取血清效價大於1 :104的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用50%PEG_4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用重組表達的人泛素偶聯酶WdcHIO蛋白包被ELISA板，進行ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最後獲得穩定分泌抗人WdcHIO單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為DY02。應用此株雜交瘤細胞以IXlO6/只的量注入石蠟預處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察10-14天後小鼠腹部膨大時抽取腹水。採用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，並通 a^pharose S-200分子篩脫鹽，PBS洗脫，以SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到 90%以上。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明以重組人泛素偶聯酶WdcHIO蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的
4陽性，並用此純化抗體對肝癌細胞H印G2和SMMC7721進行flfestern-blot證明該抗體可以識別天然變性的人泛素偶聯酶WdcHIO蛋白。本發明將此純化抗體用於進行肝癌細胞SMMC7721的免疫螢光染色以及肝癌組織的免疫組化染色證明其能識別天然的人泛素偶聯酶WdcHIO蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體為進一步研究人泛素偶聯酶WdcHIO的功能和開發人泛素偶聯酶WDCHIO的臨床診斷試劑奠定了基礎，為其作為腫瘤臨床診斷和治療靶標的驗證提供有力的工具。本發明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達人泛素偶聯酶WdcHIO全長蛋白， 其胺基酸序列為AAH16^2，全長179個胺基酸。與國外現有抗體僅能用於ELISA和狗計吐！! 檢測變性WdcHIO蛋白以及價格昂貴等特點相比，本發明的單克隆抗體除了能應用於ELISA 和Wfestern檢測變性WdcHIO蛋白以外還可以應用於細胞免疫螢光和臨床腫瘤組織標本免疫組化研究檢測未變性的天然WdcHIO蛋白，同時降低了應用成本。國外現有WDCHIO抗體大多數都是多克隆抗體，特異性和靈敏度與本發明的WdcHIO單克隆抗體相比要低，並且國外現有的單克隆抗體只能與失去了高級結構的變性蛋白結合，而本發明的抗體不僅能與變性蛋白結合，還能與具有高級結構的天然蛋白結合，從而能應用於免疫螢光和免疫組化實驗。 本發明針對人泛素偶聯酶WdcHIO全長蛋白製備出的單克隆抗體對檢測該蛋白具有較高的特異性和靈敏度，該抗體的應用將為人泛素偶聯酶WdcHIO功能研究和其作為腫瘤標誌物的臨床標本驗證工作提供支持。
圖1是本發明單抗DY02亞型鑑定結果；
圖2是本發明單抗DY02對肝癌細胞!fepG2和SMMC7721免疫印跡的結果以及陰性對照結果，其結合條帶的分子量為^kDa附近；
圖3是本發明單抗DY02對肝癌細胞SMMC7721免疫螢光染色的結果以及普通光鏡下的對照結果(顯微鏡放大倍數200倍)；
圖4是本發明單抗DY02對肝癌組織免疫組織化學染色的結果以及陰性對照結果(顯微鏡放大倍數100倍)。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例1本發明單克隆抗體的製備和鑑定 1、單抗DY02的製備
1)重組人泛素偶聯酶WdcHIO抗原製備
從肝癌細胞H印G2中調取WdcHIO基因，構建原核重組表達載體pET22b (+) /UbcHlO在大腸桿菌fecAericAia coli BL21中表達，利用Ni kpharose親和層析純化柱進行純化， 獲得純度達90%以上的重組人WdcHIO蛋白。2)免疫小鼠
以純化的重組抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。第一次免疫取重組抗原與等體積的弗氏完全佐劑混勻後，以每隻50 μ g/500 μ L 的量多點皮下注射BALB/c小鼠；第二次免疫隔2周後，取重組抗原與等體積的弗氏不完全佐劑混勻後，以每隻 50 μ g/500 μ L的量多點皮下注射BALB/c小鼠；
第三次免疫再隔2周後，取重組抗原與等體積的PBS混勻後，以每隻50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天後小鼠尾靜脈取血，以重組抗原包被，ELISA檢測血清效價，取效價大於1:104的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合； 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均使用商品化產品。3)免疫血清效價測定
採用間接ELISA法測定免疫血清效價。取50 μ g重組人泛素偶聯酶蛋白溶解於IOml 0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩衝液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。次日，使用PBS (含有 0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用 IOmM PBS 含 1 % BSA 封閉液 150 μ 1/ 孔，37°C 封閉lh，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，小鼠於第三次免疫後15天眼眶採血，鼠免疫血清用含1 % BSA IOmM PBS以10—1 10_8倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔 370C lh, PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次後，加入1 1000倍稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG (Sigma, INC. )，100 μ 1/孔37°C lh,同上洗板後，TMB顯色，100 μ 1/ 孔，室溫避光lOmin，加100 μ 1/孔2Μ H2SO2終止反應，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價。3)雜交瘤的製備
取血清效價大於1: IO4的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻後，以每隻50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進行加強免疫。無菌取小鼠脾臟，製成脾細胞懸液與對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0按1 :1的比例混合，500Xg室溫離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉澱鬆散，離心管置於37°C水浴中，將在37°C 水浴保溫的50%聚乙二醇(PEG, MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊搖動離心管，Imin內滴完，滴完後靜置2min，每隔1分鐘加入37°C預熱的無血清1640培養基1ml、 2ml,3ml,4ml,5ml和IOml來終止聚乙二醇的作用，細胞混合物500Xg室溫離心5min，棄上清，加入HAT培養液(次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) (HAT, Sigma))輕輕重懸細胞，將細胞分至96孔板中，每孔200 μ 1。培養三天後，觀察細胞融合情況，更換一半 HAT培養液，連續數日，直至有克隆形成，更換HT培養液(次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma))培養一天，更換1640完全培養基。4)篩選分泌抗人泛素偶聯酶單克隆抗體的雜交瘤細胞
間接ELISA法篩選細胞培養上清，選擇效價較高的陽性克隆雜交瘤細胞進行亞克隆化，並用有限稀釋法連續克隆化2-3次，直至到100%細胞陽性率，最後獲得穩定分泌抗 UbcHlO單克隆抗體細胞株，標記為DY02。將克隆化後陽性率達100%的細胞擴增培養後液氮凍存。5)腹水的製備和純化
將DY02雜交瘤細胞株以1 X IO6/只的量注入液體石蠟預處理的8-10周齡的Balb/c雌性小鼠腹腔，飼養觀察10-14天後小鼠腹部膨大時抽取腹水。採用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，並通過kpharose S-200分子篩脫鹽，PBS洗脫， 以SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達到90%以上。2、本發明單克隆抗體的特性鑑定1)抗體濃度的測定經雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的腹水經純化後獲得人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體DY02，分別使用BIO-RAD公司生產的Smart Spec plus核酸蛋白測定儀測定，其濃度分別為0. 71mg/ml。2)抗體亞型鑑定採用Hbt公司的鼠單抗亞型鑑定試劑盒鑑定雜交瘤細胞株的亞型，DY02分泌抗體的亞型均為IgGl型，輕鏈均為κ鏈，如圖1所示。3)純化抗體的效價鑑定50 μ g重組UbcHlO抗原溶於IOml pH9. 6的0. 05M碳酸鹽包被緩衝液中，加入96孔板每孔100 μ L，4°C過夜。PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20) 洗板三次，用IOmM PBS含BSA封閉液150 μ 1/孔，37°C封閉lh，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1純化抗體，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體為二抗，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1 TMB顯色，37°C孵育 15min後，加入2M H2SO4溶液終止反應，酶標儀在吸光度值450 nm處檢測。4)抗體的Wfestern blot鑑定收集肝癌細胞(H印G2和SMMC7721 )，用1 X SDS裂解緩衝液裂解後上樣，經12%SDS-PAGE後用Bio-Rad電轉移裝置將蛋白轉移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉過夜，PH7. 4的Tris-HCl緩衝液(含有0. 1% (V/V) Tween-20)洗膜3次，每次 lOmin，1:800加入經純化的雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體DY02，室溫孵育Ih後，pH7. 4的Tris-HCl緩衝液(含有0. 1% (V/V) Tween-20)洗膜 3次，每次lOmin，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG多克隆抗體(Sigma)為二抗，室溫孵育lh， TTBS洗膜3次，用濾紙吸去多餘的溶液，平鋪於乾淨的保鮮紙上，加入1. 4ml SuperSignal 系列Western化學發光底物反應液(A:B=1:1)，使膜完全浸潤於反應液中，迅速取出，用濾紙吸去多餘液體，鋪於另一張保鮮紙上，用保鮮紙把膜包好，放入X射線攝影暗盒，在暗房中顯影。雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗WdcHIO單克隆抗體DY02均出現單一的特異性條帶，結果如圖2所示。5)抗體的免疫螢光鑑定收集肝癌細胞SMMC7721，鋪於玻璃片上生長過夜，PBS 洗滌細胞，使用預冷的多聚甲醛固定細胞，分別加入雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗WdcHIO單克隆抗體DY02 (1 500稀釋)，37°C孵育lh，以PBS為陰性對照。PBS洗片後 1 1000加入螢光標記羊抗鼠二抗(Sigma)，37°C孵育lh，PBS洗片後，螢光顯微鏡下觀察，經抗WdcHIO單克隆抗體DY02染色的細胞均觀察到紅色螢光，如圖3所示。結果證明雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗WdcHIO單克隆抗體DY02可識別天然的人WdcHIO蛋白。6)抗體的免疫組化鑑定從南方醫院收集石蠟包埋的肝癌組織，利用純化後的雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗WdcHIO單克隆抗體DY02 (1:500稀釋)進行免疫組化染色，使用福建邁新公司的免疫組化試劑盒，染色方法參照邁新試劑盒說明書，DAB顯色，陰性對照組以PBS代替一抗，結果發現經抗WdcHIO單克隆抗體DY02染色的組織標本上在細胞質中均發現棕色顆粒，如圖4所示。肝癌細胞的免疫組化染色結果證明雜交瘤細胞CGMCC No. 4335製備的抗WdcHIO單克隆抗體DY02可識別天然的人WdcHIO蛋白。
權利要求
1.一種抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體雜交瘤DY02，於2010年11月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4335。
2.一種抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體DY02，其特徵是由權利要求1所述雜交瘤 DY02分泌所得。
3.權利要求1所述抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體雜交瘤DY02的製備方法，其特徵是取血清效價大於1 :104的BALB/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按常規方法用 50%PEG-4000進行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養基篩選融合細胞，用重組表達的人WdcHIO包被ELISA板，進行ELISA篩選；經過多次有限稀釋，最後獲得穩定分泌抗人WdcHIO單克隆抗體的雜交瘤細胞株，標記為DY02。
4.一種檢測人泛素偶聯酶WdcHIO表達情況的免疫檢測試劑，其特徵是含有權利要求2 所述抗人泛素偶聯酶WdcHIO單克隆抗體DY02。
全文摘要
本發明公開了一種人泛素偶聯酶UbcH10單克隆抗體雜交瘤DY02及單克隆抗體。抗人泛素偶聯酶UbcH10單克隆抗體雜交瘤DY02，於2010年11月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.4335。其產生的單克隆抗體，能特異性的結合重組和天然的人泛素偶聯酶UbcH10蛋白，本發明所述的抗體可用於ELISA、western-blot、細胞免疫螢光以及臨床組織標本的免疫組織化學染色研究。同時本發明所述抗體可製備成實驗室和臨床檢測人泛素偶聯酶UbcH10表達情況的免疫檢測試劑。
文檔編號C07K16/40GK102234633SQ20111011040
公開日2011年11月9日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者姚小豔, 徐偉文, 李明, 杜紅延 申請人:南方醫科大學