發酵生產d-核糖新菌株及用該菌株製備d-核糖的方法

2023-05-20 10:49:21 1

專利名稱：發酵生產d-核糖新菌株及用該菌株製備d-核糖的方法
技術領域：
本發明涉及用微生物發酵法生產D—核糖的微生物菌種以及D—核糖生產方法，屬於微生物技術領域。
D—核糖是微生物體內核糖核酸的組成成份，又是還原型誘導物，在生理上是十分重要的物質。D—核糖在工業上一直是維生素B2的重要合成原料。近來，D—核糖作為調味品，調味品香料等合成原料，在食品工業上有廣闊的應用前景。製造廉價的D—核糖，在工業上有廣泛深遠的意義。
D—核糖的製造方法，有從天然物中抽提分離的方法，也有使用化學合成的方法製造。有機化學合成法製造核糖時，最早是採用一種汞極進行電解還原反應製得，此法會引起汞的汙染。化學合成法經不斷改進後，從葡萄糖經氧化、置換、轉化、內酯化、還原等七步反應後獲得D—核糖。這種化學合成法反應時間長，操作步驟複雜，所用設備多，製造成本高，收率低，並且會造成環境汙染。
在本發明完成前所公開一份技術中，用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)突變珠的D—核糖生產菌，在其發酵原料上要採用特定的方法製備玉米漿，因為芳香族胺基酸的量控制著菌株的發酵。這種發酵方法工藝複雜，成本高。
本發明的目的是採用紫外線、甲基磺酸乙酯等化學、物理誘變因子作為誘變源，對親株進行定向誘變選育，獲得莽草酸營養缺陷型突變株，改變了糖代謝途徑。
本發明的另一個目的是提供一種工藝簡單、製造成本低，採用上述菌株製備D—核糖的發酵方法。
本發明通過下列方案來實現本發明首先涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株菌種。其特徵是以Bacillus subtilis為出發菌株，用化學、物理等誘變劑處理細胞，獲得莽草酸缺陷型突變株。該菌株在培養過程中菌體呈彎曲型、數字型及鎖狀結構。發明中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株菌種，已於1995年9月19日保芷在中國微生物菌種保芷管理委員會普通微生物中心、登記入冊的編號CGMCC NO.0238一、D—核糖產生菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)JSIM—1018突變株的獲得。
1、菌種從28株不同類型的細菌Bacillus，Brevibacterium，Cory—nebacterium，Psendmonas，Arthrobacter中，經篩選有三株Bac—illus sp.菌株具有積累D—核糖的能力，最高的一株SM—18菌株，D—核糖積累量6.35mg/ml，其餘均在3mg/ml以下。
2、菌種誘變過程從三株積累D—核糖的B.subtilis菌株中，選擇B.subtilisSM—18為親株，將菌株在斜面上溫度為25—32℃下，培養12—24小時製成菌懸液，細胞數為1×109個/ml，按常規誘變方法，用紫外線、甲基磺酸乙酯等物理、化學透變劑相間或連續處理。紫外照射時間0.5—3.0分鐘，甲基磺酸乙酯最終濃度為0.5—2.0％，處理時間20—45分鐘，經處理的細胞分別移種到含有和不含有莽草酸的基本培養基上，在溫度為25—32℃下培養2—5天，檢出含有莽草酸的基本培養基上生長，而無莽草酸的基本培養基上不生長的菌落，編號B．subtilis JSIM—1018冰箱保藏。
基本培養基組成(％)．葡萄糖0.1—0.5；硫酸銨0.2；磷酸氫二鉀1.4；磷酸二氫鉀0.6；硫酸鎂0.02；硫酸錳0.001；硫酸亞鐵0.001；腺嘌呤40—60ug/ml；組氨酸40—60ug/ml；含莽草酸的基本培養基莽草酸含量40—60ug/ml。
3、誘變選育獲得的莽草酸營養缺陷型突變株，D—核糖積累量比親株有極大地提高。然後經多次紫外線和甲基磺酸乙酯反覆誘變處理，從突變株中不斷選優，再經菌株的營養要求、培養條件多個方面的研究，獲得了B.subtilis JSIM—1018菌株。
二、B.subtilis新菌株製備D—核糖的方法B.subtilis發酵生產D—核糖方法主要是通過下列步驟來實現的(1)、斜面培養基(％)取葡萄糖0.1—0.5；蛋白腖0.5—1.0；酵母膏0.1—0.4；氯化鈉0.1—0.4；瓊脂1.5—2.5；PH為7.0—7.5，此培養基可按不同需要製作成試管斜面或茄子瓶大斜面。將冰箱保藏的菌種移種到斜面上，在溫度30—34℃下培養24—48小時。
(2)、種子培養基(％)取葡萄糖0.5—2.0；玉米漿0.5—2.0；磷酸氫二鉀0.1—0.5；磷酸二氫鉀0.1—0.5；硫酸鎂0.1—0.5；硫酸錳0.005—0.01；PH為7.0—7.5。
種子罐可以是碳鋼或不鏽鋼製，最好為標準型。容量300升，裝液量150—210升。轉速250—350轉/分。常規滅菌，發酵罐冷卻至32—35℃，接入從大斜面上用無菌水洗下的菌種，所用的大斜面茄子瓶4—10隻，在溫度為28—36℃下，培養16—24小時。風量1∶0.25—0.5。
(3)發酵培養基(％)取用玉米澱粉水解糖或玉米粉經澱粉酶、糖化酶雙酶法製得的糖18—20；玉米漿0.5—2.0；硫酸銨0.5—1.0；酵母粉0.1—0.5；硫酸鎂0.05—0.1；硫酸錳0.05—0.1；碳酸鈣1—2.5；PH為7.5—8.0，發酵罐可以是不鏽鋼或碳鋼製，最好為標準型。攪拌轉速160—240轉/分，容量3000升，裝液量為1500—2100升。
培養基滅菌可以把糖質原料單獨分開消毒後與其它成份合併。也可混在一起直接消毒。時間4—8分鐘，冷卻至32—35℃接入種子罐中的全部種子，接種量5—10％。在溫度為34—38℃下通風攪拌培養60—80小時，風量1∶0.4—0.8。發酵過程中測定的項目，D—核糖、葡萄糖、PH、O.D、CO2。每隔6小時測定。葡萄糖基本耗盡，D—核糖不再增長，CO2降至1以下，即可放罐。
(4)、提取放罐後的發酵液調PH為7.5—10.5，加絮凝劑脫乙醯甲殼素或甲殼素，絮凝劑用量為發酵液總量的100—600PPM，此時，發酵液中的菌體顆粒、雜質變大，連結成絮狀物，易與清液分開。經沉澱後用壓濾，抽濾或離心除去菌體雜質得到發酵清液。清液上陽離子和陰離子交換樹脂柱，除去發酵液中的鹽類。用活性炭脫色，脫色液減壓濃縮，濃縮溫度不高於55℃，濃縮至30％以上的D—核糖糖漿備用。或者在濃縮後添加濃縮液4倍量的乙醇得到D—核糖結晶。
下面的實施例對本發明作詳細說明
實例11、培養基配製(1)、斜面培養基(％)取葡萄糖0.5，蛋白腖1.0，酵母膏0.4，氯化鈉0.1，瓊脂2.0，定容到100毫升，PH7.2。
(2)、種子培養基(％)玉米粉酶解糖2.0；玉米漿1.0；磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.2；硫酸鎂0.1；硫酸錳0.005，定容到200升，PH7.2。
(3).發酵培養基(％)玉米粉酶解糖18；玉米漿0.6；硫酸銨1.0；酵母粉0.2；硫酸鎂0.1；硫酸錳0.01；碳酸鈣2.0；定容到2000升，PH7.5。
(4)、發酵將保藏的Bacillus subtilis JSIM—1018菌株接種至5隻茄子瓶斜面上，30℃培養48小時，用無菌生理鹽水，將斜面上菌苔洗下，在無菌條件下合併入血清瓶中，用壓差法接入種子罐中。種子罐容積300升，裝液量200升。轉速250轉/分，風量1∶0.5，在溫度為35℃±1℃下，培養22小時，接入盛有發酵培養基2000升的發酵罐中，轉速160轉/分，風量1∶0.8，接種量10％，在溫度為38±1℃發酵70小時，發酵液中D—核糖含量81.75克/升。
將發酵液調PH8.0，加脫乙醯甲殼素300PPM。發酵液經沉澱後，將上清液與沉澱分開，沉澱部分用壓濾法除去沉澱，合併上清液。上清液經陽柱、陰柱脫鹽，活性炭脫色，50℃減壓濃縮至35％的D—核糖漿，實際得純D—核糖124.5公斤。
實例2(1)、斜面培養基同實例1(2).種子培養基(％)
取葡萄糖2.0；玉米漿2.0；磷酸氫二鉀0.5；磷酸二氫鉀0.5；硫酸鎂0.2；硫酸錳0.005，定容量到200升，PH7.5。
(3)、發酵培養基(％)取工業葡萄20；玉米漿2.0；硫酸銨0.6；酵母粉0.5；硫酸鎂0.05；硫酸錳0.05；碳酸鈣1.5；定容2000升，PH7.5。發酵與提取條件均與實例1相同，發酵78小時，發酵液中D—核糖含量70.75克/升，經提取實得純D—核糖107公斤。
實例3在發酵中除用澱汾水解糖18％；玉米漿1.5％以外，其餘均與實例1相同，發酵78小時，發酵中D—核糖含量60.04克/升，提取後實得純D—核糖90公斤。
本發明與已有技術相比，具有以下優點1、採用發酵法生產D—核糖在常溫常壓下進行，原材料來源廣，價格低廉。
2、本發明所用的菌種是枯草芽孢桿菌突變株，營養要求粗放，對原材料中所含的芳香族胺基酸量、玉米漿製作方法沒有嚴格的要求。
3、可以直接以玉米粉等粗原料進行D—核糖發酵生產，生產成本降低。
4、微生物發酵生產D—核糖的方法，改善了化學合成法對環境造成的汙染，根本改變了勞動條件。
權利要求
1.一種發酵生產D—核糖新菌株，其特徵是以Bacillus sub—titis為出發菌株，採用化學、物理等誘變劑處理細胞，獲得莽草酸營養缺陷型突變株。
2.根據權利要求1所述的發酵生產D—核糖的新菌株，其特徵是所述的誘變劑為紫外線、甲基磺酸乙酯連續或相間對出發菌株進行誘變育種，紫外線照射時間為0.5—3分鐘，甲基磺酸乙酯的濃度為0.5—2％，處理時間為20—45分鐘。
3.根據權利要求1所述的發酵生產D—核糖的新菌株，其特徵是所述的突變株，在培養過程中菌體形態特徵呈彎曲型，數字型、鎖狀型等。
4.一種新菌株製備D—核糖的方法，其特徵是前述1—3權利所述的新菌株，將獲得的新菌株移種到斜面培養基上，在溫度為30—34℃下，培養24—48小時後，轉接到種子培養基中，在種子罐中進行培養，並在溫度為28—36℃下通風培養16—24小時，風量為1∶0.25—0.5，將培養好的種子液，以5—10％的接種量，轉接到發酵培養基中，在溫度為34—38℃下，在發酵罐中進行通風攪拌培養60—80小時，通風量為1∶0.4—0.8，攪拌轉速為160—240轉/分，得到D—核糖發酵液，將發酵結束後的發酵液調PH7.5—10.5，加絮凝劑脫乙醯甲殼素100—600PPM，發酵液經絮凝、沉澱、抽濾後得到清液，發酵清液上陽離子和陰離子交換樹脂脫鹽，用活性炭脫色，脫色液經減壓濃縮得D—核糖糖漿。
5.根據權利要求4所述的新菌株製備D—核糖的方法，其特徵是所述的斜面培養基包括葡萄糖0.1—0.5％，蛋白腖0.5—1.0；酵母膏0.1—0.4％；氯化鈉0.1—0.4％；瓊脂1.5—2.5％；PH為7.0—7.5。
6.根據權利要求4所述的新菌株製備D—核糖的方法，其特徵是所述的斜面菌種培養基包括葡萄糖0.5—2.0％，玉米漿0.5—2.0％；磷酸氫二鉀0.1—0.5％；硫酸錳；0.005—0.01％；硫酸鎂0.1—0.5％；PH為7.0—7.5。
7.根據權利要求4所述的新菌株製備D—核糖的方法，其特徵是所述的發酵培養基包括玉米粉(澱粉)製得的糖18—20％，玉米漿0.5—2.0％；硫酸銨0.5—1.0％；酵母粉0.1—0.5％；硫酸鎂0.05—0.1％；硫酸錳0.05—0.1％，碳酸鈣1—2.5％；PH為7.8—8.0。
全文摘要
本發明涉及用微生物發酵生產D-核糖的微生物菌株以及用該菌株製備D-核糖的方法，屬於微生物技術領域。其特徵是以B.subtilis為出發菌株，採用化學、物理等誘變劑處理細胞，獲得莽草酸營養缺陷型突變株。用該突變株發酵生產D-核糖。本發明採用發酵法生產D-核糖在常溫常壓下進行，原材料來源廣，價格低廉，對原材料中所含的芳香族胺基酸量，玉米漿製作方法無嚴格要求，並可改善化學合成法對環境造成的汙染。
文檔編號C12N1/20GK1122833SQ9511273
公開日1996年5月22日 申請日期1995年10月25日 優先權日1995年10月25日
發明者鄧崇亮, 柏建新 申請人:江蘇省微生物研究所