一種去除流感病毒原液中內毒素的方法

2023-05-20 13:36:01

專利名稱：一種去除流感病毒原液中內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及一種去除內毒素的方法，尤其是一種在流感病毒原液生產過 程中，從流感病毒原液中去除內毒素的方法，屬於生物技術領域。
背景技術：
隨著對生物製品安全性的重視，對其熱原的控制越來越嚴格。在生物制 品的生產過程中，常會因原輔材料、生產環境以及個人操作等因素而造成 內毒素汙染，因此產生環節是內毒素產生的一大來源，而要防止內毒素汙 染，必須在生產環節中採取有效的工藝控制及嚴格的預防措施。
現有的方法大多根據內毒素分子的特性來破壞或去除內毒素。具體包 括用常規的超濾膜、離子交換色譜或親和色譜等。其中
由於內毒素分子通常以聚合狀態存在，具有較大的相對分子質量，因 此可選用超濾膜去除內毒素。Czermak P等人(Czermak P, Ebrahimi M， Catapano G. New generation ceramic membranes have the potential of removing endotoxins from dialysis water and dialysate [J]. Int J Artif Organs. 2005 Jul, 28 (7) :694-700.)發現疏水合成的超濾膜能有效地去除 內毒素，但是反覆的除菌會破壞膜的分離性，限制其使用，且在去除蛋白 製品中的內毒素時，由於超濾過程中的壓力較高，會導致蛋白損壞，因此 超濾膜不適合於從蛋白中去除內毒素。
內毒素分子的pKl值約為1.3，在生理條件下帶有部分負電荷，根據內 毒素的這一性質，可用陰離子交換色譜去除蛋白製品中的內毒素。歐洲專 利(EP0800862)採用含有磺酸基的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，利用離子 交換的原理，來去除重組蛋白質腫瘤壞死因子或白介素中的內毒素的，它 主要是吸附重組蛋白質。但在離子交換中，遇到鹼性蛋白時，有可能與內 毒素一起被洗脫而引起蛋白的損失，而遇到酸性蛋白時，則其能和內毒素形成複合物將其從柱上脫離，從而不能達到蛋白質與內毒素的完全分離。
(Friedrich Birger Anspach and Oliver Hilbeck. Removal of endotoxins by affinity sorbents [J].Journal of Chromatography A， 1995 S印tember:81-92)。
另外，使用親和色譜體系來選擇性去除內毒素，就載體費用而言，這 些體系中載體價格昂貴，且難於再生，造成載體的壽命短，同時色譜體系 中存在著容量小的問題。美國專利(US4885168)採用低分子量殼聚糖，利 用殼聚糖上帶正電荷的氨基來與帶負電荷的核酸與內毒素作用，達到除去 核酸與內毒素的目的，但殼聚糖的利用率低。D.Petsch， T.C.Beeskow等 (1997， Journal of Chromatography B. 693， 79-91)採用去氧膽酸鈉，或己 二胺作為親和配基，以微孔尼龍膜為介質，製成親和膜；採用單張親和膜， 可以去除緩衝液或牛血清白蛋白中的內毒素；但是流速低，阻力高，處理 量少，不易放大。
由於內毒素固有的如帶電性與部分蛋白相同，雙性分子以及易形成微 囊結構等特性，使得上述常用的從蛋白質溶液中去除內毒素的方法，很難 將其與蛋白質徹底分離，且操作繁瑣，成本高。
流感裂解滅活病毒疫苗是通過雞胚培養法獲得病毒尿囊液，再經過一系 列病毒裂解滅活和純化過程製得的一種用於預防流感的發生和傳播的生物 製品，其病毒原液由於雞胚帶有潛在的病原菌，而SPF雞胚的獲得較為困 難，以及後處理分離純化過程複雜，易造成內毒素的汙染。

發明內容
本發明的目的在於提供一種從流感病毒原液中去除內毒素的方法，且該 方法既可去除內毒素，又能最大限度地保持病毒原液質量。
本發明通過下列技術方案完成 一種從流感病毒原液中去除內毒素的方
法，包括萃取分離，其特徵在於在流感病毒原液中加入終濃度為0.5 5%
(體積百分濃度)的介質——聚乙二醇單辛基酚醚，用於萃取分離流感病 毒原液中的蛋白質和內毒素。所述聚乙二醇單辛基酚醚介質是一種聚乙二醇單辛基酚醚表面活性劑
-Triton X-114。
所述流感病毒原液為流感病毒疫苗製備過程中的半成品，屬公知公用產
口
叩o
本發明提供的一種從流感病毒原液中去除內毒素的方法，具體經過下列
步驟
A、 在流感病毒原液中加入終濃度為0.5 5% (體積百分濃度)的聚乙 二醇單辛基酚醚表面活性劑一Triton X-114,混勻；
B、 置於溫度為37士0.5。C的水浴中孵育5-IO分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質與流感病毒原液形成一相，20 30分鐘 溶液明顯分層後取出；
C、 於室溫、10000rpm 15000rpm條件下離心分離3 8分鐘，吸取上 清液；
D、 在步驟C的上清液中，加入終濃度為1% (體積百分濃度)的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質，並重複A步驟一C歩驟2 3 次，收集所得上清液，即為去除內毒素的流感病毒原液。
本發明具有下列優點和效果採用上述方案，可在不改變流感病毒原液 原有性質的條件下，有效去除流感病毒原液中的內毒素，使內毒素含量降 低到< 0. 25EU/mL，並保留流感病毒原液中的有效成分，達到優化質量的效 果，本發明操作簡單，內毒素去除率高，蛋白質總量回收率高達85%以上， 血凝效價不變，血凝素含量回收率達99%以上，所得流感病毒原液安全、可
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明做進一步描述。 實施例1
A、在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為1%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質0.5ml，混勻；B、 置於溫度為37士0.5t:的水浴鍋內孵育10分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質與流感病毒原液形成一相，30分鐘溶 液明顯分層後取出；
C、 於室溫、15000rpm條件下離心分離8分鐘，吸取上清液轉至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為1%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質，並重複A步驟一C步驟3次，收集所得上清液， 即為去除內毒素的流感病毒原液。
採用現有技術的常規檢驗方法，即採用鱟試劑凝膠法檢測內毒素含量， 採用Lowry法檢測蛋白質含量，採用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 採用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結果該流感病毒原液中 的內毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質總量回收率為 85.02%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99.87%。
實施例2
A、 在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為2%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質lml，混勻；
B、 置於溫度為37士0.5。C的水浴鍋內孵育5分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質與流感病毒原液形成一相，20分鐘溶液 明顯分層後取出；
C、 於室溫、12000rpm條件下離心分離3分鐘，吸取上清液轉至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為2%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質，並重複A步驟一C步驟2次，收集所得上清液， 即為去除內毒素的流感病毒原液。
採用現有技術的常規檢驗方法，即採用鱟試劑凝膠法檢測內毒素含量， 採用Lowry法檢測蛋白質含量，採用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 採用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結果該流感病毒原液中
6的內毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質總量回收率為 85.22%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99. 57%。 實施例3
A、 在裝有50ml的流感病毒原液的離心管中加入終濃度為3%的聚乙二 醇單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質1. 5ml，混勻；
B、 置於溫度為37士0.5。C的水浴鍋內孵育8分鐘，使聚乙二醇單辛基 酚醚表面活性劑Triton X-114介質與流感病毒原液形成一相，25分鐘溶液 明顯分層後取出；
C、 於室溫、10000rpm條件下離心分離5分鐘，吸取上清液轉至另一離 心管中；
D、 再步驟C的離心管中，加入終濃度為3%的聚乙二醇單辛基酚醚表面 活性劑Triton X-114介質，並重複A步驟一C步驟2次，收集所得上清液， 即為去除內毒素的流感病毒原液。
採用現有技術的常規檢驗方法，即採用鱟試劑凝膠法檢測內毒素含量， 採用Lowry法檢測蛋白質含量，採用紅細胞凝集試驗法檢測血凝素效價， 採用單向免疫擴散法檢測血凝素含量，得到下列結果該流感病毒原液中 的內毒素從200-400EU/mL降低到< 0. 25EU/mL，蛋白質總量回收率為 85.08%，血凝效價不變，血凝素含量回收率為99.67%。
權利要求
1、一種從流感病毒原液中去除內毒素的方法，包括萃取分離，其特徵在於在流感病毒原液中加入終濃度為0.5-5％體積百分濃度的介質——聚乙二醇單辛基酚醚，用於萃取分離流感病毒原液中的蛋白質和內毒素。
2、 根據權利要求l所述的從流感病毒原液中去除內毒素的方法，其特 徵在於所述聚乙二醇單辛基酚醚介質是一種聚乙二醇單辛基酚醚表面活性 劑——Triton X-114。
3、 根據權利要求l所述的從流感病毒原液中去除內毒素的方法，其特 徵在於經過下列步驟A、 在流感病毒原液中加入終濃度為0. 5 5%體積百分濃度的聚乙二醇 單辛基酚醚表面活性劑一Triton X-114，混勻；B、 置於溫度為37士0. 5。C的水浴中孵育5 10分鐘，使聚乙二醇單辛 基酚醚表面活性劑Triton X-114介質與流感病毒原液形成一相，20 30分 鍾溶液明顯分層後取出；C、 於室溫、10000rpm 15000rpm條件下離心分離3 8分鐘，吸取上 清液；D、 在步驟C的上清液中，加入終濃度為1%體積百分濃度的聚乙二醇 單辛基酚醚表面活性劑Triton X-114介質，並重複A步驟一C步驟2 3次， 收集所得上清液，即為去除內毒素的流感病毒原液。
全文摘要
本發明提供一種從流感病毒原液中去除內毒素的方法，包括萃取分離，其特徵在於在流感病毒原液中加入終濃度為0.5-5％(體積百分濃度)的介質——聚乙二醇單辛基酚醚，用於萃取分離流感病毒原液中的蛋白質和內毒素。可在不改變流感病毒原液原有性質的條件下，有效去除流感病毒原液中的內毒素，使內毒素含量降低到＜0.25EU/mL，並保留流感病毒原液中的有效成分，達到優化質量的效果，本發明操作簡單，內毒素去除率高，蛋白質總量回收率高達85％以上，血凝效價不變，血凝素含量回收率達99％以上，所得流感病毒原液安全、可靠。
文檔編號C07K14/11GK101503462SQ20091009419
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月11日 優先權日2009年3月11日
發明者澤 劉, 姚忠萍, 姜述德, 張新文, 李映波, 畢湖冰, 瑋 蔡, 高菁霞, 黃秋香 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所