識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統的製作方法

2023-05-20 08:11:16 1

識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統的製作方法
【專利摘要】本發明屬於納米材料包被技術在循環腫瘤細胞識別、捕獲和活性調控的應用領域，尤其針對癌症轉移的預警和預防方面，特別是涉及一種特異性識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統。該功能納米材料載藥系統由中心納米材料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預防癌症轉移的藥物組成。該功能納米材料載藥系統可用於體外對模擬和臨床病人血液樣本微量循環腫瘤細胞的特異性識別和捕獲研究，且可用於對所捕獲的循環腫瘤細胞活性進行調控，從而在腫瘤轉移的預警和預防方面開拓應用前景。
【專利說明】識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統

【技術領域】
[0001] 本發明屬於納米材料包被技術在循環腫瘤細胞識別、捕獲和活性調控的應用領 域，尤其針對癌症轉移的預警和預防方面，特別是涉及一種特異性識別、捕獲和抑制循環腫 瘤細胞的功能納米材料載藥系統。

【背景技術】
[0002] 50多年來，多種重大疾病（如心臟病）的死亡率已下降了> 60%，但癌症死亡率僅 減少約5%，其中絕大多數死於手術後腫瘤的再轉移。傳統的"抗癌藥"主要針對那些惡性 增殖的腫瘤細胞而非處於休眠狀態的循環腫瘤細胞，故不僅不能選擇性地殺死循環腫瘤細 胞，而且也擊垮了人體的免疫系統，使"疾病-人體自身抗病力"之間的平衡朝著不利方面 傾斜，甚至引起致突變、致癌。因此，抗癌藥物的研發走的是一條"癌症轉移後再抗癌"的遲 愚路線，收效甚微。當前納米技術在癌症方面的應用途徑也主要側重於將術後轉移的化學 藥物與單抗體包被的納米材料結合在一起，而這種方式由於其毒性和非特異性問題，並不 能有效地幹預由循環腫瘤細胞引起的癌症轉移過程。故研發能特異性識別和捕獲血中微量 循環腫瘤細胞並下調其活性的功能化納米材料載藥系統，可有效預防因循環腫瘤細胞激活 後誘發的腫瘤轉移，進而消除手術後腫瘤再轉移和復發的隱患。
[0003] 發明目的 本發明的目的在於避免了傳統納米技術檢測和捕獲循環腫瘤細胞的非特異性問題，進 而提供了一種特異性識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統，該類納米 材料載藥系統因可特異性地捕獲並抑制所捕獲的循環腫瘤細胞，有望應用於癌症轉移的預 警和預防方面。
[0004] 本發明的一種功能納米材料載藥系統，所述功能納米材料載藥系統由中心納米材 料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預防癌症轉移的藥物組成。
[0005] 所述的中心納米材料載體為PAMAM dendrimers、金納米顆粒AuNPs、娃納米顆粒 SiNPs、磁性納米顆粒MNPs或氧化石墨烯graphene oxide。
[0006] 所述的表面靶向靶向抗體或適配體由兩種或兩種以上能特異性識別和結合循 環腫瘤細胞表面生物標記物的靶向抗體或適配體組成，所述生物標記物為EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDHl 或 CD44。
[0007] 所述的抗癌或預防癌症轉移的藥物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生 物、卡託普利及其衍生物、大黃素及其衍生物。
[0008] 所述的中心納米材料載體與表面靶向抗體或適配體採用共價連接方式進行，所述 共價連接方式為1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽/ N-羥基丁二醯亞胺法、 親和素/生物素法或N-羥基丁二醯亞胺/順丁烯二醯亞胺化學法。
[0009] 所述的功能納米材料載藥系統通過將所述抗癌或預防癌症轉移的藥物與中心納 米材料載體進行化學偶聯、靜電吸附、物理包埋的方式來製備。
[0010] 所述的中心納米材料載體表面具有反應官能團，所述反應官能團 為-OH、-NH2、-COOH 或-SH。 toon] 所述的中心納米材料載體與表面靶向抗體或適配體採用中間連接體進行連接， 所述中間連接體為羧基化的聚乙二醇、巰基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 0PSS-PEG-NHS 。
[0012] 本發明的一種特異性識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統， 由中心納米材料載體、表面靶向抗體或適配體及抗癌或預防癌症轉移的藥物組成，其中中 心部分是由具有多價絡合效應、良好尺寸效應、高度負載能力及表面官能團豐富的納米材 料支架構成；外圍部分則是由能特異性識別和結合循環腫瘤細胞（CTCs)表面生物標記物 的兩種或兩種以上靶向抗體或適配體構成；抗癌或預防癌症轉移的藥物則是由抗癌或預防 癌症轉移的低毒高效的小分子量化學藥物構成。本發明得到的納米材料載藥系統，不僅結 構穩定，並能同時保持納米材料和靶向抗體或適配體本身的優良特性，還可用於體外對模 擬和臨床病人血液樣本中微量CTCs的特異性識別和捕獲研究，且可用於對所捕獲的CTCs 活性進行調控，從而在腫瘤轉移的預警和預防方面開拓應用前景。
[0013] 本發明詳細描述如下： 可用於本發明的納米材料應有多價絡合效應、良好的尺寸效應和生物穩定性及高度的 負載能力，可採用但不局限於下列物質：樹狀物（dendrimers )、金納米顆粒（AuNPs )、娃納 米顆粒（SiNPs)、磁性納米顆粒（MNPs)、氧化石墨烯（graphene oxide)。優先用於本發明 的為聚醯胺-胺型樹枝狀大分子（PAMM dendrimers)，除了具有普通納米材料共有的特性 (外部規整精細的球狀結構，內部呈疏水性空腔特性，可為疏水性藥物以及無機探針分子的 負載提供場所，達到藥物的控釋和緩釋及無機探針的靶向遞送等目的）外，其表面還有大量 可控功能基團(氨基)，可以對其進行化學修飾、多價絡合靶向抗體、配體及藥物分子等，從 而構建安全有效的生物複合物（bioconjugate)。
[0014] 可用於本發明的靶向抗體選擇針對那些能在腫瘤細胞尤其是循環腫瘤細胞表面 高度表達，而在正常細胞尤其是血細胞和白細胞上低表達或不表達的生物標記物，可採用 但不局限於下列標記物：EpCAM、Sialyl Lewis 乂、冊1?246?1?40)!11、0)44。優先用於本發明 的為針對上皮循環腫瘤細胞高表達的EpCAM和Sialyl Lewis X的抗體，其中EpCAM又稱為 CD326, TACSTD1，C017-1A，GA733-2和KSA等，屬單次跨膜I型糖蛋白，分子質量為30?40 kD，由3部分構成，即胞外結構域、單次跨膜結構域和胞內結構域。胞外結構域以一個信號 序列開始，其後緊接著一個上皮生長因子樣重複序列、一個人類甲狀腺球蛋白序列和一個 缺乏半胱氨酸的結構域，上皮生長因子樣重複序列和人類甲狀腺球蛋白序列形成一個球狀 結構，負責EpCAM分子的同源細胞黏附特性。胞內結構域為一個具有26個胺基酸的短鏈，含 有2個a-輔肌動蛋白（a-actinin)結合位點，可以與肌動蛋白結合，從而和細胞骨架相互 作用。生理情況下EpCAM不同程度地表達於除鱗狀上皮之外所有的正常上皮中，且多位於 細胞間緊密連接。在結締組織及造血系統來源的細胞、腦組織和血管內皮細胞中缺乏明顯 的EpCAM的表達。病理情況下EpCAM幾乎表達於所有的腺癌中，包括結直腸腺癌、胃腺癌、 乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細胞癌和視網膜母細胞瘤。因此，EpCAM 常作為癌症早期檢測和診斷的指標。另外一個抗體是針對抗原Sialy Lewis X (Slex)。 Slex又稱為⑶15s，是腫瘤標誌物單唾液酸神經節糖苷脂CA19-9的同分異構體，也是黏附 分子選擇素（E-selectin，即⑶62)所識別的比較確定的配基之一，由半乳糖（Gal)、葡萄糖 (61(3)、唾液酸（他1^(：)、^乙醯基（嫩(3)、巖藻糖斤11(3)5個分子結合而成。細胞粘附分子 作為介導細胞與細胞或細胞與基質的相互識別和作用的分子基礎，在腫瘤侵襲、轉移過程 中發揮著重要作用。糖抗原的高表達，反映了腫瘤細胞膜糖抗原糖鏈的變化。通過化學修 飾作用產生的糖鏈異質性改變及分布，可能掩蓋某些腫瘤抗原，降低腫瘤細胞免疫原性，增 加分子的淨負電荷，減弱淋巴細胞和巨噬細胞結合與殺傷腫瘤細胞的作用，促使腫瘤細胞 發生免疫逃避。由於細胞表面相互間的排斥力增大，吸附和結合能力降低，因而使腫瘤細胞 易於從組織脫落轉移。粘附分子在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發揮著雙重作用，一方面 腫瘤細胞必須先通過細胞粘附分子下調，從原發灶脫落；另一方面又需要通過細胞外基質 受體或內皮細胞配體的上調，與細胞外基質或血管內皮細胞粘附而移動，才能形成轉移灶。 ⑶15s高表達與灶性去分化是腫瘤轉移傾向的重要標誌。因此，⑶15s也作為CTCs研究的 革巴點之一。
[0015] 可用於本發明的構成功能納米材料載藥系統的藥物，通常指那些高效低毒的抗癌 或預防癌症轉移的化學藥物，可採用但不局限於下列化合物：熊果酸及其衍生物、米非司酮 及其衍生物、卡託普利及其衍生物、大黃素及其衍生物。優先推薦用於本發明的米非司酮及 其衍生物。因它們可抑制血液中循環腫瘤細胞對血管內膜的粘附及對外周組織的侵襲，故 可在癌症轉移的預防中發揮重要作用。
[0016] 可用於本發明的中心納米材料與表面靶向抗體或適配體的共價連接方式，可採用 但不局限於下列方法：1-乙基-(3-甲基氨基丙基）碳醯二亞胺鹽酸鹽（EDC)/ N-羥基丁 二醯亞胺（NHS)法、親和素（avidin) /生物素（biotin)法和N-羥基丁二醯亞胺（NHS) / 順丁烯二醯亞胺（maleimide)化學法。優先用於本發明的EDC/NHS催化法，不僅可使雙抗 體（anti-EpCAM、anti_Slex)依次共價連接在PAMAM dendrimers表面，還可減少抗體在材 料表面的物理吸附（anti-fouling effect)，降低納米材料本身的毒性，增加納米材料-抗 體絡合物在生物環境中的穩定性。
[0017] 可用於本發明的功能納米材料載藥系統的製備，可採用但不局限於下列方法實 現：將化學藥物共價偶聯在納米材料表面、將化學藥物靜電吸附在納米材料表面、將化學藥 物包埋在納米材料空腔中。優先推薦用於本發明的物理包埋法，即將化學藥物米非司酮及 其衍生物在一定環境中包埋到PAMAM dendrimers的3D空腔結構中。該方法既避免了化學 藥物與抗體共同連接在PAMAM dendrimers表面所產生的空間位阻效應，又最大程度地利用 了 PAMAM dendrimers的空間結構，提高了藥物裝載量。
[0018] 可用於本發明的中心納米材料，表面應具有反應官能團，便於與靶向抗體的共價 連接，可選用但不局限於下列基團：-0H、-NH 2、-C00H、-SH。
[0019] 可用於本發明的納米材料與靶向抗體進行連接時，減少空間位阻效應的中 間體，可採用但不局限於下列物質：羧基化的聚乙二醇、巰基化的聚乙二醇（PEG-SH)、 hydrazide-polyethylene glycol-dithiol Λ orthopyridyl-disulfide-polyethyleneglyc ol-N-hydroxy-succinimide (OPSS-PEG-NHS)。
[0020] 可用於本發明的中心納米材料與表面靶向抗體，為了實現最大多價絡合效應，靶 向抗體的用量要遠比納米材料本身多，具體多少要依據納米材料表面裸露的反應官能團而 定。
[0021 ] 可用於本發明的體外循環腫瘤細胞模型應選取那些研究集中、術後轉移和復發程 度中高的癌細胞株，可採用但不局限於下列癌細胞株：乳腺癌細胞株、前列腺癌細胞株、結 腸癌細胞株、肝癌細胞株、宮頸癌細胞株、胃癌細胞株、肺癌細胞株。優先推薦選用人結腸癌 細胞株HT29作為體外循環腫瘤細胞模型。因結腸癌細胞株HT29的轉移和復發程度適中， 風險性較小；且生物標記物EpCAM和Slex在該細胞表面穩定性高度表達，故選取HT29為體 外CTCs模型，將會有助於本研究的順利開展。
[0022] 可用於本發明的體外含有循環腫瘤細胞的血液樣本取自那些研究集中、術後轉移 和復發程度中高的中晚期癌症病人，可選取並不局限於下列癌症病人：結腸癌病人、乳腺癌 病人、肝癌病人、前列腺癌病人、宮頸癌病人、胃癌病人、肺癌病人。
[0023] 可用於本發明的功能納米材料載藥系統的理化性質表徵手段，可採用但不局限於 下列方法：核磁共振譜（ 1H NMR)、紅外光譜（FTIR)、紫外可見光譜（UV-Vis)、螢光光譜或圖 譜、雷射粒度（DLS)/ Zeta電位、場發射掃描電鏡（FSEM)圖、原子力顯微鏡（AFM)圖、投射 電鏡圖、電泳圖。
[0024] 可用於本發明的功能納米材料載藥系統體外CTCs捕獲研究的手段，可採取但不 局限於下列方法：按照病人血液中CTCs含量（1/10 3_106)，首先向大量的幹擾細胞(諸如白 細胞、紅細胞、生物標記物不表達的正常細胞或其它腫瘤細胞）中添加一定量的目標腫瘤 細胞或向全血中添加一定量的目標腫瘤細胞，後加入定量的納米材料-雙/多靶向抗體或 適配體絡合物開展捕獲研究。優先推薦使用本發明中通過單獨考察PAMAM dendriemrs-雙 抗絡合物對懸浮和貼壁HT29細胞的識別和捕獲作用，或考察在大量幹擾細胞（白血病細胞 HL-60或紅細胞RBCs)存在下，對少量HT29細胞的捕獲情況，採用螢光拍照和流式細胞儀分 析法評估雙抗絡合物體外在模擬血液樣本中對CTCs模型的特異性捕獲效果。
[0025] 可用於本發明的功能納米材料載藥系統對臨床病人血液樣本中CTCs的捕獲研究 手段，可採用但不局限於本方法：獲取術後或化療後腫瘤病人的血液樣本，經處理獲取淋巴 細胞層後，加入納米材料-雙/多靶向抗體或適配體絡合物共孵育或直接全血中加入納米 材料-雙/多靶向抗體或適配體絡合物開展捕獲研究。優先推薦使用本發明中通過獲取腫 瘤醫院的術後結腸癌血液樣本，添加定量的PAMAM dendrimers-雙抗絡合物進行捕獲實驗， 血液後期處理後，流式定量分析其捕獲CTCs數目，雷射共聚焦分析其捕獲情況。
[0026] 可用於本發明的功能納米材料載藥系統對捕獲CTCs的活性調控研究手段，可採 用但不局限於下列評估措施：用MTT、XTT、LDH法測試納米材料-雙/多靶向抗體絡合物的 細胞毒性，用PI染色法、BrdU摻入法等測試絡合物影響細胞周期的分布情況，用Annexin V-FITC/PI、TUNEL、Annexin V-PE/7-AAD、DAPI、AO/EB、Caspase 3/8/9 等染色法評估細胞 的凋亡狀況。優先推薦本發明中採用MTT法、形態學染色觀察法、流式細胞儀分析細胞周期 和細胞凋亡法深入探索PAMAM dendrimers-雙抗絡合物對捕獲CTCs活性的抑制機理。
[0027] 本發明的有益效果： (1) 本發明提供了一種特異性識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料絡合物 載藥系統，該載藥系統可特異性地識別、捕獲和抑制血中的循環腫瘤細胞，從而有望在癌症 轉移的預警和預防領域發揮重要作用； (2) 本發明提供了將兩種或兩種以上抗體或適配體偶聯到同一種納米材料表面的技術 信息，該製備方法簡單，易於操作，反應條件溫和，對設備的要求低，且具有產業化實施的前 旦 -5^ 〇

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為識別、捕獲和抑制循環腫瘤細胞的功能納米材料載藥系統的發明示意 圖。i,納米材料PAMAM dendrimers表面進行羧基化修飾；ii,修飾的dendrimers表面 共價連接兩種抗體（aEpCAM和aSlex); iii-v,所製備的dendrimers-雙抗體載藥系統 在有無幹擾細胞存在下對目標結腸癌細胞株HT29的特異性識別和捕獲；vi，所製備的 dendrimers-雙抗體載藥系統對捕獲的癌細胞進行活性抑制作用。
[0029] 圖2為實施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對應衍生物（CC G6)及抗體絡合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的氫核磁圖譜。
[0030] 圖3為實施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對應衍生物（CC G6)及抗體絡合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的紅外圖譜。
[0031] 圖4為實施例1、2所得的G6 PAMAM dendrimers對應衍生物（CC G6)及抗體絡合 物（G6-5aEpCAM-5aSlex)的紫外吸收圖譜。
[0032] 圖5為實施例1、2所得的雙抗絡合物G6-5aEpCAM-5aSlex的掃描電鏡圖。
[0033] 圖6為實施例3所得到的螢光標記雙抗絡合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC體外 對貼壁HT29細胞的識別和結合螢光圖譜。
[0034] 圖7為實施例3所得到的螢光標記雙抗絡合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC體外 對非貼壁HT29細胞的識別和捕獲螢光圖譜。
[0035] 圖8為實施例3所得到的螢光標記雙抗絡合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC在大 量RBCs幹擾下對微量目標HT29細胞的捕獲效率流式分析。
[0036] 圖9為實施例4所得到的螢光標記雙抗絡合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC對術 後結腸癌病人血樣中微量CTCs的捕獲螢光圖譜。
[0037] 圖10為實施例4所得到的螢光標記雙抗絡合物PE-5aEpCAM-G6-3aSlex_FITC對 術後結腸癌病人血樣中微量CTCs的捕獲流式圖譜。
[0038] 圖11為實施例5所得的不同濃度的雙抗絡合物G6-5aEpCAM_3aSlex對HT29細胞 的周期分布影響。**表示同等條件下與空白對照組的比較，/7〈0. 01。
[0039] 圖12為實施例5所得的不同濃度的雙抗絡合物G6-5aEpCAM_3aSlex對HT29細胞 的凋亡影響。*和**表示同等條件下與空白對照組的比較， #和##表示同等條件下同一樣 品不同濃度間的比較；當為*或#時，/?〈〇. 05 ;當為**或##時，/?〈0. 01。

【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。
[0041] 實施例1 :雙抗體包被的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子絡合物的製備 有無螢光標記抗體包被的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子絡合物可通過將抗體與聚醯 胺-胺型樹枝狀大分子共價連接而獲得，從而用於體外對CTCs的特異性識別、捕獲和活性 調控，具體製備過程如圖1所示。
[0042] ( I)聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的完全羧基化修飾： 取甲醇溶解的含有60 mg末端為氨基的第6代聚醯胺-胺型樹枝狀大分子（G6 PAMM dendrimers)，旋轉蒸發掉甲醇溶液後，用2 ml DMSO溶液溶解完全，後加入246 mg琥珀醯 酐，室溫下避光強磁力攪拌反應24 h，隨後將反應產物用截留分子量為8, 000?14, 000的 纖維素透析膜在超純水中500 ml X 3中透析24 h，待完全純化後，最後冷凍乾燥得到樹狀 大分子表面氨基完全羧酸化的產物CC G6 (G6 -(COOH) 256); (2) 聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的部分乙醯化修飾： 將G6 -(COOH) 256溶於pH 7. 4的磷酸鹽緩衝溶液中，使其濃度為0.276 μ g/ml，取8 ml 濃度為0·276 μg/ml的G6-(C00H) 256，加入EDC 302 ng和NHS18L5ng，室溫避光攪拌 活化I h，從而得到樹狀大分子表面部分乙醯化的中間產物； (3) 聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM)和（aSlex)修飾 取活化後的中間產物溶液lml，加入118.6 μ?濃度為50 yg/ml的aEpCAM溶液和 7. 12 μ 1濃度為500 μ g/ml的aSlex溶液，室溫下避光攪拌過夜，然後經透析純化，冷凍 乾燥得到樹狀大分子表面偶聯抗體aEpCAM和aSlex的G6-5aEpCAM-3aSle X雙抗絡合物； (4) 聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM)和（aSlex)修飾 取活化後的中間產物溶液lml，加入118.6 μ 1濃度為50 μ g/ml的aEpCAM溶液和 11.86 μ 1濃度為500 μ g/ml的aSlex溶液，室溫下避光攪拌過夜，然後經透析純化，冷凍 乾燥得到樹狀大分子表面偶聯抗體aEpCAM和aSlex的G6 -5aEpCAM-5aSleX雙抗絡合物。
[0043] (5)螢光標記的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM和aSlex)修飾 取Iml上述活化的產物CC G6,先加入3.56 μ?的aSlex及3.56 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室溫下避光反應12 h，後加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液繼續反應12 h，然後經產物 透析純化24 h，最後冷凍乾燥得到雙螢光標記的PE-5aEpCAM-G6-3aSlex-FITC絡合物。
[0044] (6)螢光標記的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的雙抗體（aEpCAM和aSlex)修飾 取Iml上述活化的產物CC G6,先加入5.93 μ?的aSlex及5.93 μ?的二抗IgG-FITC 溶液室溫下避光反應12 h，後加入15 μ 1的aEpCAM-ΡΕ溶液繼續反應12 h，然後經產物 透析純化24 h，最後冷凍乾燥得到雙螢光標記的PE-5aEpCAM-G6-5aSlex-FITC絡合物。
[0045] 實施例2:雙抗體包被的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子絡合物的表徵 (1)取新製備的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物質，分別用700 μ 1的D2O溶 解充分後放置在核磁管中，後用400 MHz超導核磁共振儀做1H NMR分析。（2)取新製備的 一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex物質，用I3BS (pH 7. 4)溶解充分後，經超聲波處理5 min,經0.22 μ m的一次性水溶性過濾器過濾後，於DLS/Zeta potential儀測定各自的水 溶性粒徑及電勢分布。（3)取新製備的一定量的CC G6、G6-5aEpCAM-5aSleX物質，用適量 KBr粉末混勻經壓片後，於紅外儀中分別測試其FTIR圖譜。
[0046] (4)取新製備的一定量的 CC G6、G6-5aEpCAM-5aSlex 物質，用 PBS (pH 7.4)將其 溶解配製成一定濃度後，並以PBS (pH 7. 4)為基準，於Q5000超微量分光光度計上分別測 定這些物質在波長210-600 nm的紫外吸收圖譜。
[0047] (5)取新製備的G6-5aEpCAM-5aSlex絡合物，先將導電膠粘結在樣品座上，後用 毛細管吸取超聲分散的0.1% (W/W)的該絡合物水溶液，逐滴滴加在導電膠上，風乾後放入 掃描電鏡中觀察。
[0048] 表徵結果分析知，CC G6和G6-5aEpCAM_5aSlex的1H NMR圖譜差異（如圖2所 示）顯示出抗體連接前後物質結構的不同，尤其是酯峰的出現，說明了抗體在G6 PAMM dendrimers表面的存在。FTIR圖譜(如圖3所示)中，當CCG6連接上抗體aEpCAM和aSlex 後,雖保持在1680-1630 cnT1處的C=O伸縮振動，但在1420-1400 cnT1處的C-N伸縮的醯 胺鍵特徵吸收峰增強，可見物質表面基團的差別也反映出雙抗體在納米材料表面的成功偶 聯。因 CC G6本身在220 nm處沒有紫外吸收，而抗體aEpCAM和aSlex均在220 nm處有 特徵紫外吸收值，故選擇220 nm的吸收峰作為判斷抗體是否連接到納米材料上的指標。UV 圖譜顯示(如圖4所示)，雖是低濃度的G6-5aEpCAM-5aSlex絡合物，但在220 nm處仍有特 徵吸收峰，可見納米材料表面已成功包被了抗體。所製備的雙抗絡合物G6-5aEpCAM-5aSlex 有何理化特性呢，將其單分散的水溶液粒子進行粒徑和電勢測定表明（見表1)，當納米材料 CC G6共價連接雙抗體後，雖電負特性未有明顯變化，但其水溶性粒徑急劇增大，可見抗體 的存在會造成一定的聚集趨勢。掃描電鏡圖譜(如圖5所示)也進一步確定了所製備雙抗絡 合物的形貌和直徑，該絡合物表面近似球形，水平直徑在100 nm左右。
[0049] 表1為G6 PAMAM dendrimers對應的衍生物（CC G6)及抗體絡合物 (G6-5aEpCAM_5aSlex)的水溶性直徑和Zeta電勢。

【權利要求】
1. 一種功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述功能納米材料載藥系統由中心納米 材料載體、表面靶向抗體或適配體、抗癌或預防癌症轉移的藥物組成。
2. 根據權利要求1所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的中心納米材料 載體為PAMAM dendrimers、金納米顆粒AuNPs、娃納米顆粒SiNPs、磁性納米顆粒MNPs或氧 化石墨烯 graphene oxide。
3. 根據權利要求1所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的表面靶向靶向 抗體或適配體由兩種或兩種以上能特異性識別和結合循環腫瘤細胞表面生物標記物的靶 向抗體或適配體組成，所述生物標記物為EpCAM、Sialyl Lewis X、HER2、EGFR、ALDH1或 CD44。
4. 根據權利要求1所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的抗癌或預防癌 症轉移的藥物包括熊果酸及其衍生物、米非司酮及其衍生物、卡託普利及其衍生物、大黃素 及其衍生物。
5. 根據權利要求1所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的中心納米 材料載體與表面靶向抗體或適配體採用共價連接方式進行，所述共價連接方式為1-乙 基-(3-甲基氨基丙基）碳醯二亞胺鹽酸鹽/ N-羥基丁二醯亞胺法、親和素/生物素法或 N-羥基丁二醯亞胺/順丁烯二醯亞胺化學法。
6. 根據權利要求1所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的功能納米材料 載藥系統通過將所述抗癌或預防癌症轉移的藥物與中心納米材料載體進行化學偶聯、靜電 吸附、物理包埋的方式來製備。
7. 根據權利要求2所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的中心納米材料 載體表面具有反應官能團，所述反應官能團為-〇H、_NH2、-C00H或-SH。
8. 根據權利要求5所述的功能納米材料載藥系統，其特徵在於：所述的中心納米材料 載體與表面靶向抗體或適配體採用中間連接體進行連接，所述中間連接體為羧基化的聚乙 二醇、疏基化的聚乙二醇、hydrazide-polyethylene glycol-dithiol 或 OPSS-PEG-NHS。
【文檔編號】A61K47/34GK104353082SQ201410639414
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】賈力, 謝靜靜, 陳紅寧 申請人:福州大學