因子viii蛋白向血小板的靶向遞送的製作方法
2023-05-19 16:06:31
專利名稱：因子viii蛋白向血小板的靶向遞送的製作方法
技術領域：
本文描述的發明涉及包含至少一個與人因子VIII或其生物活性部分具有顯著同一性(同源性)的胺基酸序列的多肽、有關的分子(諸如編碼這樣的多肽的核酸)、包含這樣的多肽的組合物(諸如藥物製劑)、以及製備和使用這樣的多肽和有關的生物分子的方法。
背景技術：
凝血因子VIII (「因子VIII」或「FVIII」)是一種重要的凝結因子。正常的FVIII 的缺少會造成A型血友病，即一種遺傳性出血障礙。因子VIII參與血液凝結的內源性途徑。 具體地，因子VIII是將因子X轉化成活化的因子fe (在Cf2和磷脂存在下)的因子IXa 的輔因子。因子VIII基因生成2種可選地剪接的轉錄物。轉錄物變體1編碼大糖蛋白同種型a，其在血漿中循環，且與von Willebrand因子(「vWF」)結合成非共價複合物。該蛋白經歷多個切割事件。轉錄物變體2編碼認為的小蛋白同種型b，其主要由因子VIIIc的磷脂結合域組成。該結合域是促凝劑活性所必需的。FVIII的結構是眾所周知的(參見，例如， Thompson, Semin Thromb Hemost. 2003 Feb；29(1)11-22)。在被凝血酶(因子IIa)活化後，因子Villa (FVIIIa)從FVIII vWF複合物解離， 以與因子Ixa相互作用，造成確定地表徵的事件鏈，導致更多凝血酶的生成。凝血酶會將纖維蛋白原切割成纖維蛋白，其聚合併交聯(使用因子XIII)成血塊。FVIIIa在該過程中被活化的蛋白C ( 「aPC」)和因子Ixa蛋白水解地滅活，並迅速從血流中清除。可以將從捐獻的血漿濃縮的FVIII或可選地重組的FVIII施用給血友病患者，以恢復止血。因而，FVIII也稱作抗血友病因子。FVIII在體內具有約10-12小時的循環半衰期，因此非常希望提供具有延長的半衰期的FVIII類似物，以便降低治療性/預防性靜脈內FVIII輸注的頻率。W02009140598公開了包括雜種分子的概念，所述雜種分子包含FVIII和GPIIb/ IIIa特異性的抗體。但是，該概念可能導致GPIIb/IIIa受體的結合纖維蛋白原的能力的抑制，因而在施用這樣的雜種FVIII分子以後，會降低形成初級血塊(primary clot)的能力。 因而，本領域需要生物活性的因子VIII分子，其具有以高親和力結合血小板的能力。此外， 本領域需要生物活性的因子VIII分子，其具有結合血小板的能力，同時基本上保留血小板的聚集並從而形成初級血塊的能力。發明概述
本發明提供了靶向分子，例如包含非抑制性的GPIIb/IIIa特異性的抗體的因子VIII (FVIII)分子，以及有關的分子、組合物，製備這樣的分子的方法，和使用這樣的分子和組合物的方法(例如，在A型血友病的治療或調節中)。在本文中將更完整地描述本發明的這些和其它方面、特徵和優點。
fil圖釋了可能的方法，通過所述方法，可以將SCFv化學地連接到FVIII或 FVIII類似物胺基酸序列上，或作為含有FVIII或FVIII類似物胺基酸序列的多肽的一部分順式地表達，從而得到修飾的FVIII分子。具體地顯示了用於生產這樣的分子的糖綴合、 化學綴合和融合蛋白方法。在適用時，這些方法可以類似地用於製備本發明的其它FVIII 分子。12 圖釋了血小板聚集。條顯示了用 F8-500 AP3-LC-HC scFV - Δ a3 (AP3-N8) 或ReoPro 預處理的、SFLLRN (10 μΜ)活化的血小板中的聚集。顯示的數據是雙份測定的平均值士平均值標準差，其中將單獨的SFLLRN (10 μΜ)設定為100%。Ml圖釋了最終的靶向載體。Mi圖釋了 ΑΡ3-Ν8 2097 (A)和ΑΡ3-Ν8 MZl (C)以劑量-依賴性的方式結合人血小板。用過量的AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEQ ID NO 22)，可以幾乎完全競爭兩種化合物
的結合。發明詳述
在本發明的卜.下f中，因子VIII蛋白(或FVIII蛋白)是這樣的蛋白，其包含與選自下述的胺基酸序列表現出至少約70%胺基酸序列同一性的胺基酸序列人因子VIII (SEQ ID N0:1)、或其成熟部分(即，其殘基20-2351)、或其凝血酶活化部分、或其B結構域缺失/ 截短形式，如下所示。因子 VIII (SEQ ID N0:1) MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE
FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFV匪ERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLI^KNNAIEPRSFSQNS RHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPG AIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDN TSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKR AHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDK NATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVS LGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQEN VVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTK QIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEK GAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAK KNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFK KKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISV EMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPL YRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMA PTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRA PCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNL YPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHY SGSINAffSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDS SGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTWFATWSPSKAR LHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGN QDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
因子VIII B-結構域缺失形式(SEQ ID NO:2)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYffYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNP PVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHV LRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEE DQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQV TVQEFALFFTIFDETKSWYFTE匪ERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMG SNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPL GMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFI IMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLG MESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMY VKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY
因子VIII B-結構域截短形式(「N8」)(SEQ ID NO:3)
MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSffDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVE FTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFP GGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKS WHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQA SLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFD DDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKT REAIQHESGILGPLLYGEV⑶TLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTV
5TVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQ RFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLT LFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTCDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNS RHPSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYG MSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYS SLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLN PAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIR WYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYS NKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSS LYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLN SCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVK SLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGC EAQDLY
在一個更具體的方面，本發明涉及靶向的FVIII衍生物，其與SEQ ID N0:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B結構域缺失/截短形式表現出至少約75%、至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%同一性。在一個再更具體的方面，本發明涉及靶向的FVIII衍生物，其與SEQ ID NOiUSEQ ID NO: 2、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B結構域缺失/截短形式表現出至少約90%同一性(諸如至少約93%同一性)。在另一個方面，本發明提供了靶向的FVIII衍生物，其與SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分表現出至少約95%同一性。在更具體的方面，本發明提供了靶向的FVIII衍生物，其與SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B結構域缺失/截短形式表現出至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約98. 5%、至少約99%、至少約99. 5%、或至少約99. 7%、至少約99. 8%、或甚至至少約99. 9%同一性。換而言之，在一個方面，本發明提供了靶向的FVIII衍生物，其特徵在於，包含這樣的胺基酸序列，該序列相對於SEQ ID NO: 1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B結構域缺失/截短形式，被缺失、插入和/或置換了至少1個、通常至少2-3個、經常至少1-5、通常至少1-20個(諸如 1-15、1-12、1-10、1-7、1-3、2-20、2-15、2-12、2-10、2-7、2-5、3-20、3-15、3-12、3-10、3-7、 3-5、4-20、4-15、4-12、4-10、4-7、5-20、5-15、5-12、5-10 或 5-7 個)胺基酸殘基。通常，將FVII 「類似物」序列中至少約50%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、諸如約75%或更多、約80%或更多、約85%或更多、約90%%或更多、或甚至約95%或更多(諸如至少約97%、98%、99%、99. 3%,99. 5%,99. 7%,99. 8%)的置換表徵為「保守置換」。通過在下述 3個胺基酸分類表中的一個或多個中反映出的胺基酸類別內的置換，可以定義保守置換
表1 -保守置換的胺基酸殘基類別 _
權利要求
1.一種FVIII分子，其包括與選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的成熟部分具有至少約95%同一性的胺基酸序列，所述分子共價地結合到血小板-特異性的分子上，其中所述血小板-特異性的分子是非抑制性的GPIIb/IIIa抗體。
2.根據權利要求1所述的FVIII分子，其中所述分子具有降低的vWF結合能力。
3.根據權利要求1-2中任一項所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa 抗體選自AP3抗體、Tab抗體或SZ22抗體。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的FVIII分子，其中所述分子是融合蛋白。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa 抗體通過連接物共價地連接到FVIII上。
6.根據權利要求5所述的FVIII分子，其中所述連接物包含在FVIII分子上的N-連接的或0-連接的聚糖。
7.根據權利要求6所述的FVIII分子，其中所述聚糖位於B結構域中。
8.根據權利要求4所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗體融合到 B結構域截短的因子VIII分子的B-結構域上。
9.根據權利要求4所述的FVIII分子，其中FVIII分子的a3結構域被非抑制性的 GPIIb/IIIa抗體替換。
10.根據權利要求7所述的因子FVIII分子，其中所述FVIII分子包含如在SEQID NO 3中所述的序列，且其中所述連接物包含位於B結構域中的0-連接的聚糖。
11.一種核酸，其編碼根據權利要求8或9中任一項所述的FVIII分子。
12.—種宿主細胞，其包含根據權利要求11所述的核酸。
13.—種生產FVIII分子的方法，所述方法包括在根據權利要求12所述的宿主細胞中，表達根據權利要求11所述的核酸。
14.一種生產根據權利要求5、6、7和10中任一項所述的FVIII分子的方法，其中所述方法包括將FVIII分子與非抑制性的GPIIb/IIIa抗體綴合。
15.一種藥物組合物，其包含根據權利要求1-10中任一項所述的FVIII分子。
16.根據權利要求1-10中任一項所述的FVIII分子作為用於治療A型血友病的藥物的用途。
17.一種治療哺乳動物宿主中的A型血友病的方法，所述方法包括給所述宿主施用治療有效量的根據權利要求1-10中任一項所述的分子。
全文摘要
本文描述的發明涉及包含至少一個與人因子VIII或其生物活性部分具有顯著同一性(同源性)的胺基酸序列的新穎分子和多肽、有關的分子(諸如編碼這樣的多肽的核酸)、包含這樣的多肽的組合物(諸如藥物製劑)、以及製備和使用這樣的多肽的方法。
文檔編號C07K19/00GK102482340SQ201080015319
公開日2012年5月30日 申請日期2010年4月6日 優先權日2009年4月6日
發明者A.E.普薩特裡, 佩施克 B., 貝倫斯 C., H. N. 奧爾森 E., 奧斯特加爾德 H., 斯特尼克 H., 布夏特 J., A. 曾德爾 M., 科福德-漢森 M., R. 巴內特 T. 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司