一種檢測慶大黴素殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法
2023-05-20 11:32:36 1
專利名稱：一種檢測慶大黴素殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測乳製品中抗生素殘留試劑板的製備方法，具體涉及一種檢測
慶大黴素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法。
背景技術：
慶大黴素屬於氨基糖苷類抗生素，主要作用於革蘭氏陰性細菌，由於其抗菌譜廣、 療效佳、價格低廉而廣泛應用於獸醫臨床和動物飼料添加劑。但是慶大黴素在應用過程中 易產生毒副作用，大劑量不規範使用導致動物性食品中的藥物殘留超標會對人體健康造成 嚴重危害，產生腎毒性，耳毒性，肌肉阻滯，過敏反應等一系列毒副作用。我國農業部第235 號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定慶大黴素在乳製品中的殘留限量標準為 100ng/mL。 目前，對於慶大黴素藥物殘留的檢測方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化 分析法常用的有高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜/質譜聯用分析法(LC-MS)，特異性好、 準確率高，是各大檢測機構對檢測樣本進行確證的首選方法。但理化分析法存在對設備、環 境、操作技能等要求，不利於大規模樣本篩選，因而不適用於廣大基層部門。免疫分析法常 用的有酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫層析法(GICA)， ELISA法檢測量大，操作相對簡單， 越來越多地被用於動物性食品中抗生素殘留的檢測，但是整個操作時間仍需要l-2h，且需 用到特殊儀器設備，具有一定局限性。GICA法靈敏、快速、特異、簡便，近年來倍受國內外學 者關注，是今後慶大黴素殘留快速檢測的發展方向。
發明內容
本發明的目的在於提供一種靈敏度高，特異性好，簡便快速，生產成本低的慶大黴 素免疫膠體金試劑板的製備方法。 本發明試劑板由上下兩塊塑料模板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品 墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成。 其中樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l-2mm的重 疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣 品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩衝體系可以中和樣品溶液的酸鹼度，保證 樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。 膠體金結合墊上包被有抗慶大黴素單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜 上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有慶大黴素_載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為 檢測線和質控線。偶聯慶大黴素的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血 藍蛋白(KLH)等。抗慶大黴素克隆抗體為可以識別慶大黴素的免疫球蛋白或其片段。
本發明試劑板的各部分組成成分與功能如下 塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用 背襯為一面塗有不乾膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。 樣品墊由玻璃纖維製成，起吸收樣品溶液與緩衝樣品溶液pH值的作用。 膠體金結合墊由聚酯膜製成，其上標記有抗慶大黴素單克隆抗體與膠體金的結合
物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。 硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表徵出來。
吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多餘的溶液吸收。
本發明試劑板具有如下有益效果 (1)特異性好。本發明試劑板對慶大黴素的交叉反應率為100%，對其他種類的抗 生素包括鏈黴素、雙氫鏈黴素、新黴素的交叉反應率均低於1 % ，可見，本發明試劑板對慶大
黴素有高度專一性。 (2)靈敏度高。本發明試劑板對原奶中慶大黴素的檢出限為50ppb(ng/mL)，可以 滿足我國農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對慶大黴素在乳製品 中最高殘留限量100ng/mL的規定要求。 (3)操作簡單快捷，不依賴任何實驗設備，不需任何專業培訓。本發明試劑板將反 應所需的大部分原料整合到試劑條中，滴樣後抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮 短了檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣後5-10分鐘內即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素 膜上的檢測線和質控線的顏色深淺讀取結果，檢測過程無需特殊儀器輔助，普通人員均可 操作，不需要專業培訓，極易推廣使用。 (4)成本低，效益好。本發明試劑板生產工藝成熟、流程簡單，生產成本低廉，投資 少，收效快。
圖1為慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖，其中1為樣品墊，2為膠 體金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為質控線，6為吸水墊，7為不乾膠，8為PVC板。 圖2為慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控 制區，T為檢測區。 圖3為慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區，T 為檢測區。 具體實施方法 本發明試劑板的製備包括慶大黴素-BSA偶聯物的製備，抗慶大黴素單克隆抗體
的製備，膠體金溶液的製備，膠體金標記抗慶大黴素單克隆抗體的製備和慶大黴素免疫膠
體金快速檢測試劑板的組裝。 1.慶大黴素與載體蛋白的偶聯 採用碳二亞胺(EDC HC1)法將慶大黴素與載體蛋白偶聯製備免疫抗原及包被抗 原。稱取20mgBSA，加入lmL蒸餾水。另外用lmL蒸餾水溶解20mg EDC HC1和20mg慶大 黴素，加入到上述溶液中。將溶液混勻後，置於4t:下避光反應12小時(期間可顛倒混勻)。 用PBS緩衝液透析4天，期間每間隔8小時換液1次。之後將溶液離心，收集上清液，-20°C 下凍存備用。
2.抗慶大黴素單克隆抗體的製備 取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的慶大黴素_BSA偶聯物與等體積 的弗氏完全佐劑乳化，按100 g/只劑量皮下注射，之後每隔3周加強免疫1次，用不完全 佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫l次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規方法進行 將Sp2/0多發性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 : 10的比例混合，在50XPEG作用下融合， HAT培養基懸浮，分種於96孔培養板中，371\5% C02培養箱中培養。 融合後，待細胞生長到培養孔面積的1/4時，採用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初 篩選擇10mg/L慶大黴素載體蛋白(OVA)偶聯物包被酶聯板，被測孔加培養上清，孵育、清洗 後，加入羊抗鼠IgG-HRP(l : 1000) ， OPD顯色。篩選出的陽性孔再用慶大黴素-OVA包被的 酶聯板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養上清與2X10—^Ql/L慶大黴素溶液等量混合，37t: 感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS(O. 01mol/L、 pH7. 4)替代慶大黴素溶液作對 照，其餘步驟同上。若慶大黴素阻斷後的0D值降至對照孔的50X以下，則判為陽性孔。經 2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。 體外培養將克隆化的細胞株擴大培養，細胞濃度達5X 105/mL時停止換液，細胞 全部死亡後收集培養液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天後的小鼠腹腔注射克隆 化細胞株107個細胞，7天後抽取腹水。
3.膠體金溶液的製備 膠體金顆粒的平均大小為30nm，其製備方法為在lOOmL去離子水中加入lmL 1% 檸檬酸三鈉，煮沸後迅速加入lmL 1%氯金酸，繼續煮沸10min，冷卻後，4t:下保存備用。
4.膠體金標記抗慶大黴素單克隆抗體的製備 取已製備好的膠體金溶液lOOmL，用O. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8.0。邊攪 拌邊加入2mg抗慶大黴素單抗，攪拌20min，逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，攪拌15min。 20， OOOrpm離心15min，棄上清液，加入10mL pH 7. 4的PBS緩衝液 (含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉澱用10mL含2% BSA的PBS緩衝液(pH 7. 4)溶解，用 0. 22 ii m無菌過濾器過濾後，4t:保存備用。
5.慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝 參照圖l，用點膜機把適當濃度的慶大黴素-載體蛋白偶聯物及羊抗鼠IgG噴在硝 酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，37t:烘箱乾燥8h。以同樣方法，將製備好的金標 記慶大黴素單克隆抗體包被在膠體金結合墊上。 檢測試劑組成為一個PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖 維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中製成檢測試 劑板，再放入帶乾燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。
6.慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測原理 當待檢樣品溶液滴入試劑板加樣孔後，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細管作 用向另一端擴散。在移動的過程中，會發生相應的抗原抗體反應，並通過免疫膠體金的顏色 顯示出來。如果樣品溶液含有慶大黴素殘留，慶大黴素先和膠體金顆粒上的抗體反應，因此 當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中 的慶大黴素佔據而無法與檢測線上慶大黴素特異性抗原結合；當樣品中的慶大黴素含量超 過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中慶大黴素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相 近或偏深，判定為陰性。 7.慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施例操作方法
7. l樣品製備 取400ii L慶大黴素專用PBST緩衝液加入潔淨的1. 5mL離心管中，用滴管吸取3 滴(約lOOyL)原奶加入離心管中，混合均勻，吸取混合溶液待檢。
7. 2檢測步驟 從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 L)， 加樣後開始計時，結果應在3 5分鐘讀取，其他時間判讀無效。
7. 3結果判斷 讀取結果時，將試劑板水平置於觀察者正面，如圖2右側所示。 陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中慶大黴素藥物濃度低於50ng/
mL或無慶大黴素藥物殘留。如圖3.a所示。 陽性(+) :T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表明樣品中慶大黴素藥物濃度高於 50ng/mL ;T線比C線越淺，表明樣品中慶大黴素藥物濃度越高。如圖3. b所示。
無效未出現C線，可能操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，並用新試 劑板重新測試。如圖3.c所示。
權利要求
一種慶大黴素免疫膠體金試劑板的製備方法，其特徵在於醋酸纖維膜上的膠體金結合墊上包被有抗慶大黴素單克隆抗體-膠體金標記物，從樣品墊到吸水墊方向依次是檢測線和質控線，包被有慶大黴素-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG。
2. 如權利要求1所說的標記物，其特徵在於將膠體金與抗慶大黴素單克隆抗體按一定 比例混勻，使膠體金與抗慶大黴素單克隆抗體形成穩定的膠體金顆粒，通過濃縮形成抗慶 大黴素單克隆抗體_膠體金標記物。
3. 如權利要求書l所說的檢測線，其特徵在於偶聯慶大黴素的載體蛋白可為牛血清白 蛋白(BSA)、卵清蛋白(0VA)、血藍蛋白(KLH)等。
4. 如權利要求1所說的製備方法，其特徵在於樣品中的慶大黴素含量超過試劑板檢出 限時，試劑板上的檢測線顯色較控制線淺甚至無顯色，判定為陽性；反之，當樣品中慶大黴 素含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色與控制線相近或偏深，判 定為陰性。
5. 如權利要求1所說的製備方法，其特徵在於工藝流程包括製備慶大黴素-BSA偶聯 物、製備抗慶大黴素單克隆抗體、製備膠體金溶液、製備膠體金標記抗慶大黴素單克隆抗體 和組裝慶大黴素免疫膠體金快速檢測試劑板。
全文摘要
本發明涉及一種檢測乳製品中慶大黴素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的製備方法。該試劑板由上下兩塊塑料模板和試紙條組成。在試紙條背襯上依次緊密粘貼有樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有1-2mm的重疊。膠體金結合墊上包被有抗慶大黴素單克隆抗體與膠體金的結合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有慶大黴素-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。該試劑可半定量直觀檢測樣品中的慶大黴素殘留，整個檢測過程需5～10分鐘，無需任何實驗設備，利於大規模樣本篩選，適合於廣大基層部門對乳製品中的慶大黴素進行大規模快速檢測。
文檔編號G01N33/577GK101726598SQ200910154330
公開日2010年6月9日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者卜令傑, 張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司