快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法
2023-05-20 14:19:31
專利名稱:快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，以及使用該試劑盒快速檢測鯊魚弧菌的方法。
背景技術：
弧菌是海水養殖動物的主要病原，現已查明鯊魚弧菌是引起近江牡蠣大量死亡的病原之一，也能引起海水養殖魚類疾病，該菌亦存在於天然海水中。監測養殖動物和海水中的鯊魚弧菌是防治其引起疾病的重要措施。目前鑑定弧菌的技術有1、經典的生理生化鑑定方法，該法繁瑣、耗時、且要求操作人員有良好的專業素養；2、細菌快速自動鑑定系統，該法需要昂貴的儀器設備和技術熟練的操作人員；3、基於核酸的檢測技術，包括DNA探針和PCR技術(聚合酶鏈式反應技術)，相對上述檢測技術而言，具有快速、簡捷、靈敏等特點，但目前還未見檢測鯊魚弧菌的PCR技術及檢測試劑盒專利。
發明內容為了解決現有技術的不足之處，本發明的首要目的在於提供一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，特別是提供一對鯊魚弧菌特異性引物VcS和VcA，使用該試劑盒可快速檢測多種樣品中是否存在鯊魚弧菌，從而為健康養殖提供科學依據。本發明建立了快速靈敏準確檢測鯊魚弧菌的PCR檢測技術並研製了檢測試劑盒，以滿足生產中簡便、快捷和準確的需要。
本發明的另一目的在於提供上述檢測試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法。
本發明的目的是由下述技術方案實現的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，包括增菌培養基、聚合酶鏈式反應試劑、電泳和顯色試劑(a)試劑A即增菌培養基含胰化蛋白腖，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈式反應試劑包括反應預混試劑B和試劑C。
試劑B含有10倍聚合酶鏈式反應緩衝液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μM)、0.5～1.0μl(10μMeach)、0.5～1.0μl(5mg/ml)和19.375～38.75μl。
試劑CTaq酶，0.125～0.25μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩衝液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩衝液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％(W/V)瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
為了更好地實現本發明，所述特異引物對VcS和VcA如下特異引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC 3′；特異引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC 3′。
所述聚合酶鏈式反應試劑的優選組成為試劑B5.0μl10×PCR Buffer，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP(10mM each)，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；試劑C0.25μl Taq酶。
使用快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法，包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min後按常規方法製作細菌培養平板。
無菌操作取0.1～0.5克樣品(待檢水產動物組織或水樣等，要避免汙染)，勻漿(需要時)後塗布於用試劑A即增菌培養基所制平板，30℃培養12～18小時。
(b)PCR擴增挑取平板上各種菌苔於100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻後取1～2μl作為PCR擴增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環儀上通過95℃裂解細菌並解鏈5分鐘；然後用94℃變性30～60秒，55～58℃復性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環25～35次，最後在72℃保溫8～12分鐘，將鯊魚弧菌的特異片段增加到108mol以上。
(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴增後的樣品，與1～2μl試劑F(凝膠加樣緩衝液)混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有鯊魚弧菌。
本發明的主要原理為試劑B和C為多聚酶鏈式反應試劑，通過試劑B中所含鯊魚弧菌DNA片段特異引物和試劑C中的熱聚合酶等成分，對樣品釋放出的DNA進行特異性的擴增，由於本發明所設計引物為鯊魚弧菌特異性引物，因此，如果樣品中含有鯊魚弧菌，那麼它的DNA特異片段在經過擴增後，濃度將達到108mol(克分子)以上，這樣，在電泳和溴化乙錠染色後，紫外光檢測就可以探測到一定分子量的目的條帶。如果沒有鯊魚弧菌存在，則不能擴增到同樣分子量的目的條帶。
本發明與其它弧菌病原檢測技術相比，具有如下優點和有益效果(1)本發明方法檢測方便，省去了通常方法中要提取細菌DNA的步驟；(2)本發明方法檢測靈敏度極高，檢測下限低至10～102個細菌；(3)本發明提供的引物對於不含鯊魚弧菌的檢測樣本均無擴增信號，說明其具有良好的特異性；(4)本發明可以應用於多種樣品的檢測，可以檢測養殖動物受鯊魚弧菌感染情況，也可以監測養殖水體環境中鯊魚弧菌。
圖1為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特徵引物特異性檢驗實驗結果圖。
圖2為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實驗結果圖。
具體實施方式下面實施例對進一步對本發明的說明，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1 按以下配方製作快速檢測溶藻弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養基)含有胰化蛋白腖，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈式反應(25μl體系)試劑包括反應預混試劑B和試劑C，試劑B含有10倍聚合酶鏈式反應緩衝液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5μl、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM)、0.5μl(10μM each)、0.5μl(5mg/ml)和19.375μl。
試劑CTaq酶，0.125μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩衝液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩衝液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測鯊魚弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min後按常規方法製作細菌培養平板。
無菌操作取近江牡蠣消化盲囊組織約0.1克，勻漿後塗布於所制平板，30℃培養16小時；(b)PCR擴增取23.875μl試劑B與0.125μl試劑C混合；用滅菌牙籤挑取平板上各種菌苔於100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取1μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環儀上對進行擴增，通過95℃裂解細菌並解鏈5分鐘，然後用94℃變性20秒，57℃復性40秒，72℃延伸45秒鐘，如此循環30次，最後在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取5μl擴增後的樣品，與1μl試劑F(凝膠加樣緩衝液)混合，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有。
實施例2 按以下配方製作快速檢測溶藻弧菌的試劑盒(a)試劑A(增菌培養基)含有胰化蛋白腖，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18。
(b)聚合酶鏈式反應(50μl體系)試劑包括反應預混試劑B和試劑C。
試劑B含有10倍聚合酶鏈式反應緩衝液(含MgCl215mM)、特異引物對VcS和VcA、dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為5.0μl、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM)、1.0μl(10μM each)、1.0μl(5mg/ml)和38.75μl。
試劑CTaq酶，0.25μl(5個單位/μl)。
(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。
試劑D為50倍TAE(電泳緩衝液)，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；
試劑E為凝膠加樣緩衝液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍及二甲苯青FF；試劑F1％(W/V)瓊脂糖+0.5μg/ml溴化乙錠。
按照以下程序快速檢測鯊魚弧菌的方法(a)樣品增菌處理取2.7g試劑A加過濾海水至1L，調PH值為7.2～7.4，121℃滅菌20min後按常規方法製作細菌培養平板。
無菌操作取牡蠣血液約0.1克，塗布於所制平板，30℃培養16小時。
(b)PCR擴增取47.75μl試劑B與0.25μl試劑C混合；用滅菌牙籤挑取平板上各種菌苔於100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻，取2μl作為PCR模板加入上述混合液中；在熱循環儀上通過95℃裂解細菌並解鏈5分鐘；然後用94℃變性30秒，57℃復性45秒，72℃延伸60秒鐘，如此循環30次，最後在72℃保溫10分鐘。
(c)電泳和顯色檢測取8μl擴增後的樣品，與2μl試劑F(凝膠加樣緩衝液)，1％瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有。
如圖1所示，為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特徵引物特異性檢驗實驗結果，其中MDNA marker，1副溶血弧菌，2哈維氏弧菌，3、4、5三株不同來源的溶藻弧菌，6鯊魚弧菌，7解蛋白弧菌，8需鈉弧菌，9坎氏弧菌，10燦爛弧菌，11河流弧菌，12創傷弧菌，圖1顯示鯊魚弧菌快速檢測試劑盒特徵引物只能對鯊魚弧菌PCR擴增出目的片段，其特異性是非常高的。
如圖2所示，為鯊魚弧菌快速檢測試劑盒靈敏度實驗結果，其中MDNAmarker，1～825μl體系PCR結果，每管加入模板量(鯊魚弧菌數/管，平板計數法)；15×107，25×106，35×105，45×104，55×103，65×102，75×101，85×100，圖2顯示鯊魚弧菌快速檢測試劑盒在101級時就可以檢測出結果，結合增菌步驟一般在所取檢測樣品中只要含有數個鯊魚弧菌就可檢出。
SEQUENCE LISTING110暨南大學120快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法130201602170PatentIn version 3.2210121119212DNA213Artficial sequence220
223鯊魚弧菌特異引物VcS4001atccggcaat gcagtgttc 19210221120212DNA213Artificial sequence220
223鯊魚弧菌特異引物VcA4002acctacccgc ctccttacgc 20
權利要求
1.一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特徵在於包括增菌培養基、聚合酶鏈式反應試劑、電泳和顯色試劑(a)增菌培養基即試劑A含胰化蛋白腖，牛肉膏，酵母提取物和瓊脂粉，其重量比為5∶3∶1∶18；(b)聚合酶鏈式反應試劑包括反應預混試劑B和試劑C；試劑B含有10倍聚合酶鏈式反應緩衝液、特異引物對VcS和VcA、dNTP、小牛血清蛋白和滅菌雙蒸水，含量分別為2.5～5.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl、0.5～1.0μl和19.375～38.75μl；試劑CTaq酶，0.125～0.25μl；(c)電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F；試劑D為50倍TAE，含三羥基甲基氨基甲烷-乙酸和乙二胺四乙酸，濃度分別為0.04M和0.001M；試劑E為凝膠加樣緩衝液，含w/v為40％的蔗糖和0.25％的溴酚藍和二甲苯青FF；試劑F0.8～2％瓊脂糖+0.5～1μg/ml溴化乙錠。
2.根據權利要求
1所述的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特徵在於所述特異引物對VcS和VcA如下特異引物VcS指5′ATCCGGCAATGCAGTGTTC 3′；特異引物VcA指5′ACCTACCCGCCTCCTTACGC 3′。
3.根據權利要求
1所述的一種快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒，其特徵在於所述聚合酶鏈式反應試劑的組成為試劑B5.0μl 10×PCR Buffer，1.0μl VcS，1.0μl VcA，1.0μl dNTP，1.0μl BSA，38.75μl ddH2O；試劑 C0.25μl Taq酶。
4.一種使用快速檢測鯊魚弧菌的試劑盒檢測鯊魚弧菌的方法，其特徵在於包括如下步驟(a)增菌取2.7g試劑A加過濾海水至100ml，調PH值為7.2～7.4，121℃滅菌15～20min後按常規方法製作細菌培養平板；無菌操作取0.1～0.5克樣品，勻漿後塗布於用試劑A即增菌培養基所制平板，30℃培養12～18小時；(b)PCR擴增挑取平板上各種菌苔於100μl滅菌蒸餾水中重懸混勻後取1～2μl作為PCR擴增的模板；取23.875～47.75μl試劑B與0.125～0.25μl試劑C混合；在熱循環儀上通過95℃裂解細菌並解鏈5分鐘；然後用94℃變性30～60秒，55～58℃復性30～60秒鐘，72℃延伸30～90秒鐘，如此循環25～35次，最後在72℃保溫8～12分鐘，將鯊魚弧菌的特異片段增加到108mol以上；(c)電泳和顯色檢測取5～10μl擴增後的樣品，與1～2μl試劑F混合，W/V為0.8～1.2％的瓊脂糖電泳和顯色，在紫外光下檢測是否有一條470核苷酸對的條帶，如果有一條470bp的條帶，說明樣品中含有鯊魚弧菌，反之則沒有鯊角弧菌。
專利摘要
本發明提供了一種檢測鯊魚弧菌的試劑盒及其檢測方法，該試劑盒包括增菌培養基即試劑A；聚合酶鏈式反應試劑包括反應預混試劑B和試劑C；電泳和顯色試劑，包括試劑D、試劑E和試劑F。本發明還提供使用這種試劑盒快速檢測鯊魚弧菌的方法，其優點是快速，準確，靈敏度高；本發明提供的引物對於不含鯊魚弧菌的檢測樣本均無擴增信號，說明其具有良好的特異性。本發明可以應用於多種樣品的檢測，可以檢測養殖動物受鯊魚弧菌感染的情況，也可以監測養殖水體環境中病原鯊魚弧菌。
文檔編號G01N21/31GK1995372SQ200610123591
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月16日
發明者張其中, 張佔會 申請人:暨南大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan