用於檢測bla_NDM-1基因的引物、探針、試劑盒及其檢測方法

2023-05-20 14:09:11

專利名稱：用於檢測blaNDM-1基因的引物、探針、試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及用於檢測bla ^泛耐藥腸桿菌科細菌的引物、探針、試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
細菌產生能水解β -內醯胺類抗菌藥物的β -內醯胺酶，是細菌對β -內醯胺類抗菌藥物耐藥的主要機制。臨床分離的細菌大多能產生β-內醯胺酶，已經確定的β-內醯胺酶有數百種。各種酶的分子結構和對內醯胺類水解能力存在較大差異，一般根據分子結構分為Α、B、C、D四大類，其中B類酶在其活性部位結合有鋅離子，因此又稱為金屬 β -內醯胺酶。其水解底物包括青黴素類、頭孢菌素類和碳青黴烯類等，表現為產酶細菌對這些藥物的廣泛耐藥性。金屬內醯胺酶首先在銅綠假單胞菌、不動桿菌中發現。近年來，在腸桿菌科細菌，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等中也有發現。近期一種產生NDM-I的可抗絕大多數抗生素的耐藥性超級細菌在英美印度等國家小規模爆發，NDM-I的全稱為New Delhi metallo-0-lactamase-l，即新德裡金屬β -內醯胺酶1，NDM-1是ndm基因編碼的產物，能水解幾乎所有的β內醯胺類抗菌藥物，從而導致其廣泛的耐藥性。採用「、.工基因特異引物進行PCR擴增及產物測序，即可確定菌株是否攜帶Wamw基因。實時螢光定量PCR技術，是在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR汙染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。現有技術中對耐藥基因的檢測主要採用宿主耐藥實驗，時間長、操作複雜繁瑣。而 Wamw基因作為新發的耐藥基因，目前還沒有一種合適的檢測方法，也沒有利用螢光定量 PCR技術檢測Wamw基因的檢測方法或試劑盒。

發明內容
本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種用於檢測bla^H基因的擴增引物、探針、試劑盒及其檢測方法，通過採用實時螢光定量PCR技術及專用探針和引物檢測bla^H基因的核酸，具有特異性檢測、靈敏度高、操作簡便的優點。為了實現上述目的本發明採取的技術方案是提供用於檢測產NDM-I的泛耐藥腸桿菌科細菌的引物和探針，包括以下序列擴增bla^H基因的正向引物，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 1 ；擴增bla^H基因的正向引物，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 2 ；bla^基因的探針，其序列為序列表中的SEQ ID NO. 3。本發明還提供用於檢測NDM-I泛耐藥腸桿菌科細菌的試劑盒，該試劑盒含有(I)PCR反應酶，為熱啟動Taq酶；
(2)PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNIPs、Taq Buffer、擴增Wamw基因的正向引物、擴增bla^H基因的反向引物、bla^H基因的探針；其中擴增bIbndm^1基因的正向引物序列為=SEQ ID NO. 1，擴增bIbndm^1基因的反向引物序列為=SEQ ID NO. 2，Wamw基因的探針序列為SEQ ID NO. 3 ；(3)陰性質控品，為DEPC處理水；(4)陽性質控品，採用包含擴增片段序列的克隆質粒。所述探針5'端標記FAM螢光報告基團，3'端標記ECLIPSE螢光淬滅基團。本發明又一技術方案是一種利用所述的試劑盒檢測Wamw基因的檢測方法，包括下列步驟(I)DNA提取採用商業化提取試劑進行待測樣本的DNA提取；(2) PCR Mix配製及分裝按22 μ L 1 μ L的比例，分別吸取PCR反應液和PCR反應酶，室溫融化並振蕩混勻後，12，OOOrpm離心10s，配製成PCR Mix，取出PCR反應管，給每個PCR反應管中加入23 μ L上述配製的PCR Mix ；(3)加樣向上述的PCR反應管中分別加入提取的樣本DNA，陽性質控品及陰性質控品 2 μ L，12，OOOrpm 離心 IOs ；G)PCR擴增將各反應管放入螢光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記螢光基團種類、樣本名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；第一步，42°C45min ；第二步，95°C2min ；第三步，95°C 10S，60°C30S;(40個循環)在反應程序的第三步的結束讀取螢光值；(5)分析判斷Ct值小於等於35的為陽性；Ct值大於37的為陰性；Ct值在35-37 之間的為灰區，需要進行重複試驗，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽性，否則為陰性。本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是本發明試劑盒的研製成功，極大提高臨床對bla·—病原體的甄別與診斷能力，對指導公共衛生部門的幹預和臨床決策， 控制耐藥菌暴發流行發揮巨大的作用。本發明通過採用實時螢光定量PCR技術及專用探針和引物檢測bla ^基因的核酸，向醫院、疾病預防控制中心等機構提供快速簡便的診斷方法。本發明的方法具有特異性檢測、靈敏度高、操作簡便的優點。


圖1是本發明實施例1中提供的實驗結果圖；圖2是本發明實施例2中提供的實驗結果圖。圖1和圖2中的橫坐標為「循環數」，縱坐標為「螢光強度」。
具體實施例方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明實施方式作進一步地詳細描述。
本發明提供了用於檢測產NDM-I的泛耐藥腸桿菌科細菌的試劑盒，該試劑盒含有PCR反應酶，為熱啟動Taq酶；PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、Taq Buffer、 擴增bla^H基因的正向引物、擴增bla^H基因的反向引物、wamw基因的探針；陰性質控品，為DEPC處理水；陽性質控品，採用包含靶序列的克隆質粒。試劑盒的製造1.試齊[J本試劑盒製造過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司 (Takara), TE Buffer, 1 X (pH 7.9-8. 1)購自普洛麥格公司，材料及儀器通過市售均可以購買。2. PCR反應液製備(1)引物及探針設計與合成從Genbank上下載「、^^基因組序列，通過生物學軟體Align X進行多序列比對， 在基因區選擇一段保守序列，如序列表中的SEQ ID NO. 4所示。
權利要求
1.用於檢測bla^H基因的引物和探針，其序列如下(1)擴增bla^H基因的正向引物，其序列為SEQID NO. 1 ；(2)擴增bla^H基因的反向引物，其序列為SEQID NO. 2 ；(3)1^1 ^基因的探針，其序列為SEQID NO. 3。
2.用於檢測bla^H基因的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒含有(1)PCR反應酶，為熱啟動Taq酶；(2)PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNIPs、Taq Buffer、擴增Wamw基因的正向引物、擴增bla^H基因的反向引物、bla^H基因的探針；其中擴增「^^基因的正向引物序列為=SEQ ID NO. 1，擴增「^^基因的反向引物序列為=SEQ ID NO. 2，bIbndm^1基因的探針序列為=SEQ ID NO. 3 ；(3)陰性質控品，為DEPC處理水；(4)陽性質控品，採用包含靶序列的克隆質粒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述探針5'端標記FAM螢光報告基團，3'端標記ECLIPSE螢光淬滅基團。
4.一種利用權利要求2或3所述的試劑盒檢測bla ^基因的檢測方法，其特徵在於， 包括下列步驟(1)DNA提取採用商業化提取試劑進行待測樣本的DNA提取；(2)PCR Mix配製及分裝按22 μ L 1 μ L的比例，分別吸取PCR反應液和PCR反應酶， 室溫融化並振蕩混勻後，12，OOOrpm離心10s，配製成PCR Mix，取出PCR反應管，在每個PCR 反應管中加入23 μ L上述配製的PCR Mix ；(3)加樣向上述的PCR反應管中分別加入提取的樣本DNA，陽性質控品及陰性質控品 2μ L, 12，OOOrpm 離心 IOs ；(4)PCR擴增將各反應管放入螢光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記螢光基團種類、 樣本名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；第一步，42°C 45min ；第二步，95°C 2min ；第三步，95°C 10s，60°C 30s ； (40個循環)在反應程序的第三步的結束讀取螢光值；(5)分析判斷Ct值小於等於35的為陽性；Ct值大於37的為陰性；Ct值在35-37之間的為灰區，需要進行重複試驗，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測blaNDM-1基因的引物、探針、試劑盒及其檢測方法，其中的引物包括擴增blaNDM-1基因的正向引物、反向引物；探針為blaNDM-1基因的探針；該試劑盒包括PCR反應酶(熱啟動Taq酶)、PCR反應液，其中PCR反應液包括DEPC處理水、dNTPs、Taq Buffer、擴增blaNDM-1基因的正向引物、反向引物及其探針；陰性質控品為DEPC處理水；陽性質控品採用包含擴增片段序列的克隆質粒。本發明採用實時螢光定量PCR技術檢測blaNDM-1基因的方法，具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優點。
文檔編號C12Q1/68GK102181543SQ20111008805
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月8日 優先權日2011年4月8日
發明者周騁, 姚志建, 王濤, 逄鍵濤 申請人:北京愛普益生物科技有限公司