抗cd40抗體、用途和方法

2023-05-21 00:07:21 2

抗cd40抗體、用途和方法
【專利摘要】本發明涉及對CD40具有多價結合特異性的抗體(及其片段、變體、融合體和衍生物)，其具有大於或等於對B細胞激活效力的對樹突細胞激活的效力，其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物對CD40的親和性(KD)小於1x10-10M，其可用於疾病如癌症的治療。本發明還涉及藥物組合物、用途、方法和包含這樣的抗體的試劑盒。
【專利說明】抗CD40抗體、用途和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及具有CD40結合特異性的基於抗體的多肽，其表現出改進的親和性和/或激動劑效力，具有治療如癌症的疾病的用途。本發明還涉及包含這種抗體的藥物組合物、用途、方法和藥劑盒。
【背景技術】
[0002]癌症佔發達國家死亡人數的30%以上。雖然在某些腫瘤的治療(霍奇金病，某些淋巴瘤/白血病，局部性皮膚癌)中已經取得了重大進展，但是傳統的療法如手術、化療和放療往往在治療播散的實體腫瘤中是無效的。
[0003]癌症的免疫療法(與生物療法同義)對治療幾種不同類型的癌症，包括播散的轉移性腫瘤具有很好的前景(Stagg 等人，2007，Immunol Rev.220:82-101 ；Melief, 2008，Immunity, 29:372-383，Melero 等人,2007, Nat Rev Cancer, 7:95-106 ；ffaldmann, 2006, Annu.Rev Med.57:65-81 ；Khawli 等人，2008，Handb.Exp.Pharmacol.181: 291-328 ;Berinstein,2007,Vaccine,25 增補 2:B72-B88 ;Mellor&Munn, 2008，Nat RevImmunol.8:74-80)。其目的在於動員患者自身免疫系統戰勝癌症，並長期消除腫瘤。
[0004]已經開發了幾種不同的用於癌症免疫療法的方法，包括以下:
[0005](I)單克隆抗體(Mab)療法可用於:i)使用裸露的或綴合至毒素(例如，利妥昔單抗)的抗體，靶向待破壞的癌細胞；和/或ii)阻斷生長因子受體(例如，赫賽汀)；和/或iii)刺激免疫系統。
[0006](2)癌症疫苗，其包含腫瘤細胞疫苗(自體的或異體的)、抗原疫苗和樹突細胞(DC)疫苗、DNA疫苗、和基於載體的疫苗(如，基於腺病毒的基因轉移)。
[0007](3)非特異性免疫療法和佐劑，其通過更廣泛地刺激免疫系統發揮作用，從而激活被腫瘤環境抑制的腫瘤特異性免疫細胞。這可以通過刺激或激活產生對腫瘤的免疫反應的免疫效應細胞(例如，效應T細胞或Trff細胞)實現，或通過抑制或失活具有抑制性表型的細胞(例如，調節性T細胞、或Treg細胞)實現。類似的方法包括活性分子，如細胞因子、細菌佐劑以及靶向免疫調節受體(例如，CTLA-4和CD40)的藥物(包括mAb)。其它的方法包括過繼T細胞轉移和TMg耗竭療法，其落在後兩組之間的範圍。
[0008]CD40是細胞表面表達的糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，並在免疫系統中起主要作用。其表達在多種免疫細胞，如B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞。當通過⑶40發生信號傳導時，專門的抗原提呈細胞(APC)被激活(Schonbeck和Libby, 2001, Cell Mol Life Sci, 58 (I): 4-43 的綜述)。
[0009]⑶40的天然配體，命名為⑶154或⑶40L，主要表達在成熟T淋巴細胞(Armitage等人，1992，Nature, 357:80-82 ;Schonbeck 等人，2001，Cell Mol Life Sc1.，58，40-43 ;van Kooten 等人，2000，J.Leuk.Biol.，67:2-17 ；Quezada 等人，2004，Annu.Rev.1mmunol.，22:3077-328)。⑶40L介導的信號傳導觸發一些生物事件，包括免疫細胞激活、增殖、和細胞因子和趨化因子的產生(Schonbeck等人，2001，Cell Mol Life Sc1., 58:40-43 ；van Kooten 等人,2000, J.Leuk., Biol., 67:2-17)。
[0010]CD40信號傳導對於T細胞依賴性和B細胞信賴性免疫應答是重要的，具有無功能的CD40或CD40L的患者是明顯免疫抑制的(Foy等人，1993，J Exp Med5:1567-1575 ；Siepmann等人，2001, Immunology3:263-272 ;Allen等人，1993, Science, 259:990-993)。刺激抗原提呈細胞，如具有重組⑶40L或抗⑶40抗體的人B細胞和樹突細胞，可誘導表面標記物，如⑶23、⑶80、⑶86、Fas和MHC II的上調，以及可溶性細胞因子，如IL_12、TNF_ Y和TNF- α 的分泌(van Kooten等人，2000，J Leucoc Biol, 67:2-17 ;Schonbeck等人，2001，同上)。在腫瘤背景中，CD40刺激的樹突細胞能夠激活腫瘤特異性效應T細胞，該腫瘤特異性效應T細胞具有根除腫瘤細胞的潛力((van Kooten等人，2000，J Leucoc Biol, 67:2-17 ；Sotomayor 等人,1999, Nature Medicine, 5:780-787)。
[0011]⑶40表達發生在許多正常細胞和腫瘤細胞中。例如，全部B淋巴細胞和30%至70%的實體腫瘤具有⑶40表達。黑色素瘤和癌屬於具有⑶40表達的腫瘤。已經公認CD40的激活有效地觸發抗腫瘤反應(Tong等人，2003, Cancer Gene Therapy, 10 (I): 1-13 ；Ottalano等人，2002, Tumori, 88(5):361-6)。0)40激活促進腫瘤生長損害的作用至少涉及以下機制:產生腫瘤特異性T細胞反應的免疫激活、對CD40陽性腫瘤直接的細胞凋亡作用和刺激導致ADCC的體液反應。已經報導了 CD40激活對CD40陰性腫瘤的抗腫瘤作用(Tutt 等人，2002，J Immunol., 168(6):2720-8 ；van Mierlo 等人，2002，Proc Natl AcadSci, USA, 99(8):5561-6)。此處，觀察到的腫瘤根除與CTL、腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞的出現強烈相關。
[0012]已經提議了一種參與⑶40刺激的癌症疫苗佐劑。臨床前驗證性概念證實了激動 CD40 抗體用於一些類型的癌症(Kalbashi 等人,2010, J Immunotherapy, 33:810-816 ；Loskog 等人，2009，Semin Immunology, 21:301-307 ；French 等人，1999，NatureMedicine, 548-553 ；Sotomayor 等人，1999，Nature Medicine, 5:780-787 ；Staveley等人，2003, Nature Medicine, 171:697-707)。對於激動 CD40 抗體，包括 SGN-40 (具有部分和弱激動特性的人源化抗體)、和CP-870，893 (全人以及選擇性CD40激動單克隆抗體)，已經進行了臨床試驗(Khalil 和 Vonderheide, 2007, Update on CancerTherapeutics, 2:61-65 ；Hussein 等人,2010, Haematologica, 95:845-848)。
[0013]但是，全身施用CD40抗體與副作用相關，如休克症候群和細胞因子釋放症候群(van Mierlo 等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 99:5561-5566 ;van Mierlo 等A,2004, J Immunol173:6753-6759)。
[0014]由於以上，仍然需要一種改進的抗腫瘤療法，特別是適合於臨床應用的抗CD40激動抗體。

【發明內容】

[0015] 在第一方面，本發明提供了一種對CD40具有多價結合特異性的抗體或其抗原結合片段，或所述抗體或抗原結合片段的變體、融合體或衍生物，或所述變體的融合體或其衍生物，其保留了對CD40的多價結合特異性，其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物對樹突細胞激活的效力高於、或等於其對B細胞激活的效力，其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物對CD40的親和性(KD)小於ΙχΙΟ,ΙΚ 即，0.1nM)。[0016]可選擇地，或另外地，本發明的第一方面提供了一種對CD40具有多價結合特異性的抗體或其抗原結合片段，或所述抗體或抗原結合片段的變體、融合體或衍生物，或所述變體的融合體或其衍生物，其保留了對CD40的多價結合特異性，其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物能夠發揮對CD40+腫瘤細胞的雙重細胞毒性作用(優選在體內)。通過「雙重細胞毒性作用」，我們包括對腫瘤細胞直接的細胞凋亡作用和對腫瘤細胞間接的免疫細胞介導的細胞毒性(例如，ADCC)作用。
[0017]通過「效力」，在樹突細胞激活和B細胞激活方面，我們指由抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物引起的該細胞激活的EC50。本領域技術人員將理解對於樹突細胞激活和B細胞激活的效力可以通過不同的方法測量，包括但不局限於以下實施例中描述的那些方法。
[0018]在一個實施方案中，通過引用FACS分析測量的對⑶80表達的刺激的EC50定義樹突細胞激活(如實施例4)，通過引用對增殖B細胞的EC50定義B細胞激活(如實施例6)。
[0019]已知Pfizer開發的抗CD40抗體，CP-870,893,對B細胞激活比對樹突細胞激活具有高大約20倍的效力(Gladue等人，2011，Cancer ImmunolImmunotherapy(7)，1009-1017)。還證實了用CP-870，893治療的主要藥效學作用之一是快速降低外周血淋巴細胞中的B細胞百分比(Vonderheide等人，2007，Journal ofClinical 0ncology25, 7，876-883)。對B細胞的作用可能導致了在治療劑量上的劑量限制性細胞毒性，該治療劑量不足以激活樹突細胞。本發明人相信樹突細胞的激活比B細胞激活具有更高的臨床相關性。癌症的CD40激動劑療法與T細胞激活密切相關(French等人，1999，Nature Medicine, 548-553 ；van Kooten 等人，2000，J Leucoc Biol, 67:2-17 ；Sotomayor等人，1999，Nature Medicine, 5:780-787),該T細胞激活依賴於專門的抗原提呈細胞的激活，特別是樹突細胞的激活(Melief等人，2000，75:235-282)。
[0020]本發明人開發了激動型抗CD40抗體克隆，其具有改進的激活樹突細胞的能力。
[0021]在一個實施方案中，本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物具有對樹突細胞激活的效力，該效力高於或等於其對B細胞激活的效力。或者,換言之,本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物具有對B細胞激活的效力，該效力低於或等於其對樹突細胞激活的效力，高於或等於其對樹突細胞激活的效力。
[0022]通過「結合特異性」，我們包括本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物以比對任何其它多肽強至少10倍地結合⑶40的能力；優選強至少50倍，以及更優選強至少100倍。優選地，本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物在生理條件下選擇性地結合CD40(例如，在體內；和例如，當CD40存在於細胞表面時)。
[0023]通過「多價」，我們包括本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物包含兩個或多個對CD40具有結合特異性的抗原結合位點。例如，抗體可以包含兩個或三個或四個或五個或六個或更多該抗原結合位點。在一個實施方案中，抗體是完整、二價的IgG抗體。
[0024]CD40是細胞表面表達的糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，並在免疫系統中起核心作用。其表達在多種免疫細胞，如B細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞上，當通過CD40發生信號傳導時，專門的APC被激活(Tasci等人，2001，Cell Mol LifeSci, 58:4-43的綜述)。⑶40表達發生在許多正常細胞和腫瘤細胞中，如B淋巴細胞、實體腫瘤、黑色素瘤和癌症中。已經公認⑶40的激活有效地觸發抗腫瘤反應，且⑶40的激活至少通過以下機制促進腫瘤生長損害:免疫激活、對CD40陽性腫瘤直接的細胞凋亡作用和刺激導致ADCC和⑶C的體液反應。
[0025]ADCC和⑶C的發生依賴於與由重鏈恆定結構域決定的抗體Fe部分相互作用的宿主免疫系統。在天然發生的恆定結構域中，Yl是最有效引起ADCC和⑶C的同種型(Janeway, s Immunobiology, 2008,第七版，Garland Science)。因而，對於本發明抗體的優選Fe是Y IFc,其使抗⑶40抗體是IgGl的同種型。還可能使用許多已知的方法進一步增加這些作用，如Fe工程化(點突變)和聚糖修飾(Carter, Nature ReviewsImmunology, 2006 (6)，343-357 的綜述)。
[0026]抗體激活樹突細胞和B細胞上的⑶40的機制依賴於其所結合的⑶40上的表位，以及受體多聚化。由本發明示例性二價抗體(IgGl)引起的CD40受體二聚化對其激動作用是有利的。
[0027]通過「⑶40」，我們包括具有與文中定義的人⑶40蛋白相同結構和/或功能的任何天然或合成的蛋白，和/或其天然變體。
[0028]優選地，CD40是人 CD40，如 UniProt 登錄號 P25942 和 GenBank 登錄號 AAH12419。
[0029]但是，技術人員將理解，CD40來自任何哺乳動物，如馴養的哺乳動物(優選有農業或商業意義的，包括馬 、豬、牛、羊、狗和貓)。通過「哺乳動物蛋白」，我們包括存在於、來源於和/或分離自一個或多個哺乳動物細胞的任何蛋白；例如，術語「人蛋白」包括存在於、來源於和/或分離自一個或多個人細胞的蛋白。
[0030]如以上所討論的，本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物能夠激活B細胞和樹突細胞。
[0031]當通過CD40發生信號傳導時，如樹突細胞的專門APC被激活，該信號傳導觸發一些生物事件，包括免疫細胞激活、增殖、和細胞因子和趨化因子的產生。用於確定與CD 4 O相關的樹突細胞激活的方法是本領域公知的(例如，在以下文獻中討論的:Schonbeck 等人，2001，Cell Mol Life Sc1., 58:40-43 ；van Kooten 等人，2000，J.Leuk.，Biol.，67:2-17)，以及在附加實施例中描述的。
[0032]用重組⑶40L或抗⑶40抗體刺激人B細胞誘導了如⑶23、⑶30、⑶80、⑶86、Fas和MHC II的表面標記物的上調，可溶性細胞因子如IL-6、TNF-Y和TNF-α的分泌，和同型聚集。用於確定與CD40相關B細胞激活的方法是本領域公知的(例如在Schonbeck等人，2001中討論的，同上)，以及在附加實施例中描述的。
[0033]為了提供改進的激活樹突細胞的效力，優化了本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物。在一個實施方案中，相對於激活B細胞的效力，激活樹突細胞的效力選擇性地增加了。
[0034]用於確定抗體激活樹突細胞和B細胞效力的方法和試驗是本領域公知的。
[0035]例如，可通過測量細胞表面標記物如⑶86和⑶80的上調(參見實施例3)，和/或通過測量抗⑶40抗體誘導的T細胞分泌IFN Y (參見如下實施例4)評估樹突細胞的激活。
[0036]同樣地,可通過測量細胞表面標記物(如⑶86 ;參見Gladue等人，2011，同上)的上調和/或通過測量抗CD40抗體誘導的B細胞增殖(參見以下的實施例6)評估B細胞的激活。[0037]本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物至少以與激活B細胞相同的效力激活樹突細胞(例如，如在之後通過測量CD80和/或CD86的上調所確定的)。因而，本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體及衍生物相對於B細胞的激活，可具有高2倍的激活樹突細胞的效力，例如，至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高激活樹突細胞的效力。
[0038]通過「抗體」，我們包括基本上完整的抗體分子、以及嵌合抗體、人源化抗體、人抗體(其中至少一個胺基酸相對於天然存在的人抗體是突變的)、單鏈抗體、雙特異抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同二聚體和異二聚體、及其抗原結合片段和衍生物。該術語還包括抗體樣分子，可由分子的噬菌體展示技術或其它的隨機選擇技術生成所述抗體樣分子。該術語還包括所有類型的抗體，包括:IgG、IgA、IgM、IgDjP IgE。
[0039]如以下進一步討論的，本發明還包括抗體片段，如Fab、F(ab』)2、Fv和其它保留抗原結合位點的其片段。相似地，術語「抗體」包括抗體遺傳工程化的衍生物，如單鏈Fv分子(scFv)和單鏈結構域抗體(dAb)。通過多聚化使得該片段和衍生物成為對CD40多價的，如scFv-scFV 或 dAb-dAb 二聚體。
[0040]抗體的可變重(Vh)和可變輕(VJ結構域參與抗原識別，該事實首次被早期蛋白酶消化實驗發現。通過齧齒動物抗體「人源化」找到了進一步的確認。齧齒動物來源的可變結構域可融合至人來源的恆定結構域，從而獲得的抗體保留了齧齒動物親本抗體的抗原特異性(Morrison 等人(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81, 6851-6855)。
[0041]本發明涵蓋了本發明抗體和抗原結合片段的變體、融合體和衍生物，以及所述變體的融合體或衍生物，只要這種變體、融合體和衍生物具有CD40的結合特異性、以及高於或等於激活B細胞效力的激活樹突細胞的效力。
[0042]由於抗體及其抗原結合片段包含一個或多個多肽組分，可以使用重組多核苷酸，應用本領域公知的蛋白質工程化和定點誘變的方法製備文中所定義的抗體及其抗原結合片段的合適變體、融合體及衍生物(參見例如，參見Molecular Cloning:a LaboratoryManual,第三版，Sambrook&Russell, 2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press,併入此處作為參考)。
[0043]因而，可以根據抗體或其抗原結合片段的多肽組分製備如文中所定義的抗體或其抗原結合片段的變體、融合體和衍生物。
[0044]通過「融合體」，我們包括融合於任何其它多肽的所述多肽。例如，為了有助於所述多肽的純化，所述多肽可融合至如穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)或蛋白A的多肽。該融合體的例子是本領域技術人員公知的。類似地，所述多肽可以融合至寡組氨酸標籤，如His6或被抗體識別的表位，如公知的Myc標籤表位。所述多肽至任何變體或衍生物的融合體也包括在本發明的範圍內。
[0045]融合體可以包括或由賦予所述多肽期望特性的另外的部分組成；例如，該部分可用於檢測或分離多肽，或促進多肽的細胞攝取。該部分可以是，例如生物素半簇、放射性半簇、螢光半簇、例如小螢光團或綠色螢光蛋白(GFP)螢光團，以及本領域技術人員公知的那些。如本領域技術人員公知的，該半簇可以是免疫原性的標籤，例如Myc-標籤，或者可以是如本領域技術人員公知的能夠促進多肽的細胞攝取的親脂性分子或多肽結構域。
[0046]通過所述多肽的「變體」，我們包括保守或非保守的插入、刪除和取代。特別是，我們包括多肽的變體，其中所述變化基本上不改變所述多肽的活性。變體可以包括，例如，典型地只有一個或兩個或三個，和典型地不多於10個或20個胺基酸殘基不同於給定序列的等位基因變體。通常，變體具有保守取代。
[0047]多肽變體可以具有這樣的胺基酸序列，其與一個或多個以上給定的胺基酸序列具有至少75%的同一性，例如與一個或多個文中特定的胺基酸序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
[0048]例如，文中定義的多肽變體包含多肽，所述多肽包含與選自以下的胺基酸序列具有至少 60% 同一性的序列:SEQ ID NO: 19 ；SEQ ID NO:20 ；SEQ ID NO: 21 ；SEQ ID NO: 22 ；SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25 ；SEQ ID NO:26 ；SEQ ID N0:27;和 SEQ IDNO:28 ；SEQ ID NO:32 ；SEQ ID NO:33 ；SEQ ID NO:34 ；SEQ ID NO:35 ；SEQ ID NO:36 ；SEQ IDNO:37 ；SEQ ID N0:38;和SEQ ID NO:39 ;優選與所述序列具有至少70%或80%或85%或90 %同一性，更優選與所述序列具有至少95 %、96 %、97 %、98 %、或99 %同一性。
[0049]可通過例如LALIGN 程序(Huang 和 Miller, Adv.Appl.Math.(1991) 12:337-357)在 Expasy 設備網站上(http://www.ch.embnet.0rg/software/LALIGN_form.html)使用作為參數的全局比對選項、評分矩陣BL0SUM62、開放缺口罰分-14、延伸缺口罰分_4確定同一性百分比。可選擇地，兩個多肽間的序列同一性百分比可使用適當的電腦程式確定，例如威斯康辛大學遺傳計算機組的GAP程序，可以理解計算與序列已被優化比對的多肽有關的同一性百分比。
[0050]可選擇地，使用 Clustal W 程序(如 Thompson 等人，1994，Nucl.AcidRes.22:4673-4680中描述的，其併入文中引作參考)進行比對。使用的參數如下:
[0051]-快速配對比對參數:K-數組(tuple)(代碼)的大小；1，窗口大小；5，缺口罰分；3，頂對角線的數目；5，評分方法:百分之X。
[0052]-多元比對的參數:缺口開放罰分；10，缺口延伸罰分；0.05。
[0053]-評分矩陣:BLOSUM。
[0054]可選擇地，BESTFIT程序可用於確定局部序列比對。
[0055]本發明的抗體、抗原結合片段、變體、融合體或衍生物可包含或由一個或多個被修飾的或衍生的胺基酸組成。
[0056]一個或多個胺基酸的化學衍生物可以通過與功能性側基反應獲得。該衍生的分子包括，例如其中游離氨基被衍生化形成鹽酸胺、P-甲苯磺醯基、羧基苯氧基、t_ 丁氧羰基、氯乙醯基或甲醯基的那些分子。游離羧基可以被衍生化形成鹽、甲基和乙基酯或其它類型的酯和醯肼。游離羥基可被衍生化形成O-醯基或O-烷基衍生物。作為化學衍生物，本發明還包括含有20種標準胺基酸的天然存在的胺基酸衍生物的那些肽。例如:4_羥基脯氨酸可取代脯氨酸，5-羥基賴氨酸可以取代賴氨酸；3_甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；以及鳥氨酸取代賴氨酸。衍生物還包括含有一個或多個添加或缺失的肽，只要保留了所需的活性。其它包括的修飾是醯胺化、氨基端醯化(例如乙醯化或巰基乙酸醯胺化)、末端羧基醯胺化(例如與氨或甲胺)等末端修飾。
[0057]本領域技術人員將進一步地理解擬肽化合物也是有用的。術語「擬肽」指模擬作為治療劑的特定肽的構象和想要特性的化合物。
[0058]例如，所述多肽不僅僅包括胺基酸殘基通過肽鍵(-C0-NH-)連接的分子，還包括肽鍵被反轉的分子。這樣的逆反轉(retro-1nverso)擬肽可以通過本領域已知的方法製備，例如，如Meziere等人(1997) J.1mmunol.159，3230-3237中描述的，在此併入引做參考。該方法包括製備假肽，所述假肽包含涉及骨架而非側鏈方向的改變。含有NH-CO鍵，而不是CO-NH肽鍵的逆反轉的肽更能抵抗蛋白水解。可選擇地，所述多肽可以是這樣的擬肽化合物，其中一個或多個胺基酸殘基被_y (CH2NH)-鍵連接，而不是常規的醯胺鍵。
[0059]進一步可選擇地，如果使用了合適的接頭半簇，所述接頭半簇保留了胺基酸殘基碳原子間的間距，那麼可以完全省去肽鍵；對於接頭半簇，有利地是與肽鍵具有基本上相同的電荷分布和基本上相同的平面性。
[0060]將理解所述多肽可以在其N或C端被便利地阻斷，從而幫助降低對外蛋白水解消化的易感性。
[0061]還使用了多種非編碼的或修飾的胺基酸(如D胺基酸和N甲基胺基酸)來修飾哺乳動物肽。另外，可通過共價鍵修飾穩定推測的生物活性構象，如通過環化或併入內醯胺或其它類型的橋，例如參見 Veber 等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:2636 和 Thursell等人,1983, Biochem.Biophys.Res.Comm.111:166,其在文中併入引做參考。
[0062]在眾多合成策略中共有的主題是向基於肽的框架導入某些環狀半簇。環狀半簇限制肽結構的構象空間，這經常導致肽對特定生物受體的特異性增加。該策略額外的優點是向肽中導入環狀半簇還可以產生具有對細胞肽酶敏感性減小的肽。
[0063]因而，本發明示例的多肽包含或由末端半胱氨酸胺基酸組成。該多肽可通過末端半胱氨酸胺基酸中巰基 二硫鍵的形成以雜環(heterodetic cyclic)形式存在、或通過末端胺基酸間醯胺肽鍵的形成以純環(homodetic)形式存在。如以上指出的,通過N端和C端半胱氨酸之間二硫鍵或醯胺鍵形成的環化小肽可防止有時在線性肽觀察到的特異性和半衰期的問題，該環化小肽通過降低蛋白水解和增加結構剛性，可以產生特異性更高的化合物。通過二硫鍵環化形成的多肽具有游離的氨基和羧基端，其仍然對蛋白水解降解易感，然而由N端胺和C端羧基間的醯胺鍵環化形成的肽，因此不再含有游離氨基或羧基端。因而，該肽可由C-N鍵或由二硫鍵連接。
[0064]本發明不局限於肽環化方法的任何方式，但是本發明涵蓋通過任何適當的合成方法實現其環狀結構的肽。因而，雜環鍵可以包括但不局限於通過二硫、亞烷或亞硫橋形成。包括二硫、亞硫和亞烷橋的合成環狀純環肽和環狀雜環肽的方法，公開於US5，643，872中，其在此併入引做參考。其它環化方法的實例在US6，008，058中討論並公開了，其在此併入引做參考。
[0065]環狀穩定擬肽化合物的進一步的合成方法是閉環複分解(RCM)。該方法包括合成肽前體以及使其與RCM催化劑接觸產生構象限制性肽的步驟。適當的肽前體可以包含兩個或多個不飽和C-C鍵。可以使用固相肽合成技術執行該方法。在該實施方案中，錨定於固體支持物的前體與RCM催化劑接觸，然後從所述固體支持物切下以產生構象限制性肽。
[0066]在此併入引做參考的D.H.Rich in Protease Inhibitors, Barrett 和 Selveson,編輯，Elsevier (1986)中公開了另一種方法，該方法通過應用酶抑制劑設計中的過渡態類似物概念設計了肽模擬物。例如，已知staline (無對應中譯文)的仲醇模擬胃蛋白酶底物易斷裂的醯胺鍵的四面體過渡態。
[0067]總之，如公知的，末端修飾可用於降低對蛋白酶消化的易感性，從而延長溶液中、特別是有蛋白酶存在的生物液體中肽的半衰期。由於環化形成的穩定結構以及考慮到對環狀肽觀察到的生物活性，多肽環化也是一種有用的修飾。
[0068]因而，在一個實施方案中，所述多肽是環狀的。但是，在一個替代的實施方案中，所述多肽是線性的。
[0069]優選地，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物比已知的抗CD40抗體「B44」(其胺基酸序列在以下實施例10中表示)具有更高的樹突細胞激活效力。
[0070]B44激動型抗體來源自n-CoDeRR文庫，該文庫是人抗體片段展示文庫，是 BioInvent International AB 公司的財產(Sodcriind 等人,2000, NatureBiotechnol.，18:852-6 ;W098/32845)。如在體外確定的，B44抗體具有中等到低的親和性常數(KD)，為 1.7nM,以及中等的效力(Ellmark 等人，2002，Immunology, 106:456-463 ；Ellmark 等人., 2008, AIDS Research and Human Retroviruses, 243, 367-372)。B44 激動型抗體的親和性和效力使其不適合作為臨床和治療相關的抗CD40激動劑抗體。
[0071]更優選地，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物對樹突細胞激活的效力是至少0.5 μ g/ml (如實施例4所述，測量為EC50)(即EC50小於或等於0.5 μ g/ml)。例如，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物刺激CD80的EC50 (如實施例4所測量的)小於 0.5 μ g/ml,例如小於 0.4 μ g/ml、0.3 μ g/ml、0.2 μ g/ml、0.1 μ g/ml、或小於 0.05 μ g/ml ο
[0072]在本發明的一個實施方案中，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物相對於B44抗體具有改進的CD40結合特異性。
[0073]關於抗體的結合特異性，最常引用的動力學參數是整體親和性，其通常表示為解離常數(KD)。該靜態參數反映了在平衡狀態下細胞受體的相對佔據(relativeoccupancy)，且與全身施用有關。但是，在局部施用期間，抗體可能漏出局部腫瘤區域，因而反應時間有限。所以，在局部施用期間的高結合速率(高ka)對臨床效果非常重要，理由是其決定了抗體達到平衡需要的時間(Katakura等人，Journal of MolecularCatalysis, (28)，191-200，2004)。另外，緩慢的解離速率(低kd)影響治療的持續時間，可用於將抗體限制於腫瘤區域，從而降低全身的暴露和毒性。
[0074]用於測量相互作用(如抗體和配體間的相互作用)的整體親和性(KD)和結合速率(ka)和解離速率(kd)的方法是本領域公知的。體外的示例性方法描述於隨附實施例中。還可以考慮使用基於流式細胞術的方法(Sklar等人，Annu Rev Biophys BiomolStruct, (31)，97-119，2002)。
[0075]本發明的抗體、或其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物對CD40的親和性(KD)小於 1.0xlO-10M,例如 KD 小於 9.0χ10-ηΜ、8.0χ10-ηΜ、7.0χ10-ηΜ、6.0χ10-ηΜ、5.0xlO-nM,4.0χ10-ηΜ、3.0χ10-ηΜ、2.0χ10-ηΜ 或小於 1.0xIO-11M0
[0076]在另一個優選的實施方案中，因而，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物對CD40的結合速率高於Β44抗體，例如結合速率(ka)大於2.7xl06Ms，優選地結合速率(ka)大於 3.0xlO6Ms ；或 4.0xlO6Ms ；或 5.0xlO6Ms ；或 6.0xlO6Ms ；或 7.0xlO6Ms ；或8.0xlO6Ms ;或 9.0xlO6Ms ;或 1.0xlO7Ms?
[0077]在另一個優選的實施方案中，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物對CD40具有較低的解離速率，所述解離速率低於B44抗體，例如解離速率(kd)低於4.5xlCT3s,優選地解離速率低於 3.0xlCT3S ；或 2.0xlCT3S ；或 1.0xlCT3S ；或 9.0xlCT4S ；或 8.0xlCT4S ；或 7.0xlCT4S ；或 6.0xlCT4S ；或 5.0xlCT4S ；或 3.0xlCT4S ；或 2.0xlCT4S ；或 1.0xKT4S ；或 9.0xKT5S ；或 8.0xlO-5S ；或 7.0xlO-5S ；或 6.0xlO-5S ；或 5.0xlO-5S ；或4.0xlCT5S ;或 3.0xlCT5S ;或 2.0xlCT5S ;或 1.0xlO-6S0
[0078]在一個優選的實施方案中，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物對CD40的親和性(KD)在1.0xlO-10M至IxlO-11M的範圍內，對CD40的結合速率(ka)在2.7106至IxlO7Ms的範圍內。
[0079]典型地，本發明提供了一種抗體、或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，其對位於細胞表面的CD40具有親和性。
[0080]通過「位於細胞表面」，我們包括⑶40與細胞相關，從而⑶40的一個或多個區域存在於細胞表面外面的含義。例如，CD40可以插入細胞質膜(即，作為跨膜蛋白定位)，其一個或多個區域存在於細胞外表面。或者，CD40可在細胞外，以共價和/或離子相互作用使其位於細胞表面的特定區域。
[0081]因此,通過「癌症細胞表面」,我們包括⑶40以與源自癌症細胞或腫瘤、或具有癌症細胞或腫瘤特徵的一個或多個細胞相關的方式定位的含義。
[0082]在一個實施方案中，抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物包含或由完整的抗體組成。 [0083]可選擇地，抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物包含或由抗原結合片段組成，所述抗原結合片段選自=Fv片段(如單鏈Fv片段、或二硫鍵連的Fv片段)和Fab樣片段(如Fab片段;Fab，片段或F (ab)2片段)。
[0084]例如，抗原結合片段、或其變體、融合體或衍生物可包含scFv。
[0085]通過「ScFv分子」，我們包括其中Vh和\伴侶結構域通過柔韌的寡肽連接的分子。
[0086]使用抗體片段，而不是全長抗體的潛在優點是多方面的。片段的較小尺寸可引起改進的藥學特性，如向靶位點較好的穿透性。去除了全長抗體的效應功能，如補體結合。Fab、Fv、scFv和dAb抗體片段均可以表達在大腸桿菌中，並從大腸桿菌分泌,從而允許容易地大量產生所述片段。
[0087]優選，本發明的抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物是重組分子。
[0088]儘管抗體可以是多克隆抗體，或者如果其是單克隆抗體，優選其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物源自單克隆抗體。
[0089]可以使用公知的技術製備合適的單克隆抗體,例如在「Monoclonal Antibodies ；Amanual of techniques」，H Zola(CRC Press, 1988)和在「Monoclonal HybridomaAntibodies: Techniques and Application」，SGR Hurrell (CRC Press, 1982)中公開的那些。多克隆抗體可以製備成多特異性或單特異性的抗體。優選其為單特異性的。
[0090]優選，抗體、其抗原結合片段、變體、融合體或衍生物是人或人源化的。
[0091]在具有此處定義的CD40蛋白特異性的人抗體胺基酸序列的意義上，抗體可以是人抗體，但是應當理解可以使用本領域中已知的不需要免疫人的方法製備這些抗體。例如，所述抗體多肽可以在體外人或非人細胞系中產生。或者，可獲得在本質上含有人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠(參見 Vaughan 等人(1998)Nature Biotechnol.16，535-539)。
[0092]適當製備的非人抗體可以用已知方法進行「人源化」，例如通過將小鼠抗體的⑶R區插入人抗體的框架。
[0093]嵌合抗體由Neuberger等人(1998年，第8屆國際生物技術研討會第2部分，792-799)討論。
[0094]本領域技術人員將理解抗體或其抗原結合片段的結合特異性由組成的重鏈和輕鏈的可變區中存在的互補性決定區(CDR)賦予。如下面討論的，在一個特別優選的此處所定義的抗體和其抗原結合片段、變體、融合體和衍生物的具體實施方案中，存在一個或多個此處定義的CDR胺基酸序列賦予CD40的結合特異性。
[0095]如此處所用，術語「胺基酸」包括標準的20個遺傳編碼的胺基酸和其相應的「D」型立體異構體(相比於天然「L」型)，ω-胺基酸的其它天然存在的胺基酸，非常規的胺基酸(例如α，α - 二取代胺基酸、N-烷基胺基酸等)和化學衍生的胺基酸(參見下面)。
[0096]當胺基酸被明確列舉時，如「丙氨酸」或「Ala」或「A」，該術語指的是L-丙氨酸和D-丙氨酸二者，除非另有明確說明。只要多肽保留所希望的功能性質，其它非常規胺基酸也可以是用於本發明多肽的合適組分。對於所示的肽，每一個編碼的胺基酸殘基，在適當情況下由對應 於常規胺基酸俗名的一個單字母命名來表示。
[0097]在一個實施方案中，文中定義的多肽包含或由L-胺基酸組成。
[0098]在一個優選的實施方案中，所述抗體、片段、變體、融合體或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDRl包含或由以下胺基酸序列組成:
[0099]CTGSX1SNIGX2VYtSEQ ID NO:1]
[0100]其中:
[0101]X1 是 S 或 TjP
[0102]X2是1(或H或D或G或N。
[0103]在一個優選的實施方案中，所述抗體、片段、變體、融合體或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDR2包含或由以下胺基酸序列組成:
[0104]X3NINRPS[SEQ ID NO:2]
[0105]其中:
[0106]X3 是 G 或 R。
[0107]在一個優選的實施方案中，所述抗體、片段、變體、融合體或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDR3包含或由以下胺基酸序列組成:
[0108]CAAffDX4X5X6X7GLX8[SEQ ID NO:3]
[0109]其中:
[0110]X4是0或S或E或G或K ;和
[0111]X5是S或T或G ;和
[0112]X6是!^或S或T或L或I ;和
[0113]X7 是 S 或 T 或 LjP
[0114]父8是￥或1^。
[0115]更優選地，所述抗體、片段、變體、融合體或衍生物包含可變輕鏈(')，其中⑶Rl包含或由選自以下胺基酸序列組成:
[0116]CTGSTSNIGAGYKVY[SEQ ID NO:4];和
[0117]CTGSSSNIGAGYHVY[SEQ ID NO:5];和
【權利要求】
1.一種對CD40具有多價結合特異性的抗體或其抗原結合片段，或所述抗體或抗原結合片段的變體、融合體或衍生物，或所述變體的融合體或其衍生物，其保留了對CD40的多價結合特異性，其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物對樹突細胞激活的效力高於、或等於其對B細胞激活的效力，和/或其中所述抗體、其抗原結合片段、或融合體、變體或衍生物對⑶40的親和性(KD)小於1x10-10M。
2.根據權利要求1所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物能夠對CD40+腫瘤細胞發揮雙重細胞毒性作用。
3.根據權利要求1所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物能夠對腫瘤細胞具有直接的細胞凋亡作用和對腫瘤細胞具有間接的免疫細胞介導的細胞毒性作用。
4.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物相對於B細胞的激活，對樹突細胞的激活具有2倍的效力，例如，至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更高的樹突細胞激活效力。
5.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物具有比Β44抗體高的對樹突細胞的激活效力。
6.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物對樹突細胞激活的效力(測定為 EC50)是至少 0.5μ g/ml。
7.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物相對於B44抗體，對CD40具有改進的結合特異性。
8.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中改進的結合特異性是對CD40較高的親和性，親和性小於1.0xlO-10M,例如KD小於9.0xl0_nM、8.0xl0_nM、7.0xl0_nM、6.0xl0_nM、5.0xl0_nM、4.0xl0_nM、3.0xl0_nM、2.0xKT11M或小於 1.0xl(TnM。
9.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中改進的結合特異性是與B44抗體相比對CD40較高的結合速率，例如結合速率(ka)大於 2.7x106Ms ;或 3.0xlO6Ms ;或 4.0xlO6Ms ;或 5.0xlO6Ms ;或 6.0xlO6Ms ;或 7.0xlO6Ms ;或8.0xlO6Ms ;或 9.0xlO6Ms ;或 1.0xlO7Ms?
10.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中改進的結合特異性是與B44抗體相比對CD40較低的解離速率，例如，解離速率(kd)低於 4.5xlCT3s,或 3.0xlCT3S ;或 2.0xlCT3S ;或 1.0xlCT3S ;或 9.0xlCT4S ;或 8.0xlCT4S ；或 7.0xKT4S ；或 6.0xKT4S ；或 5.0xlO-4S ；或 3.0xlO-4S ；或 2.0xlO-4S ；或 1.0xlO-4S ；或 9.0xKT5S ；或 8.0xKT5S ；或 7.0xlO-5S ；或 6.0xlO-5S ；或 5.0xlO-5S ；或 4.0xlO-5S ；或3.0xlCT5S ;或 2.0xlCT5S ;或 1.0xlO-6S0
11.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物對CD40的親和性(KD)在.1.0xKT10M至1xKT11M的範圍內，對CD40的結合速率(ka)在2.7106至1xlO7Ms的範圍內。
12.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中⑶40位於細胞表面。
13.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物包含或由完整的抗體組成。
14.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物包含或由抗原結合片段組成，所述抗原結合片段選自:Fv片段(如單鏈Fv片段、或二硫鍵連的Fv片段)和Fab樣片段(如Fab片段;Fab，片段或F (ab) 2片段)。
15.根據權利要求14所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗原結合片段、或其變體、融合體、或衍生物包含scFv。
16.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體或其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物是重組分子。
17.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體是單克隆抗體。
18.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其抗原結合片段、變體、融合體、或衍生物是人或人源化的。
19.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDRl包含或由以下胺基酸序列組成:
CTGSX1SNIGX2VYtSEQ ID NO:1] 其中: X1是S或T ;和 X2是1(或H或D或G或N。
20.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDR2包含或由以下胺基酸序列組成:
X3NINRPS[SEQ ID NO:2] 其中: X3是G或R。
21.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(')，其中CDR3包含或由以下胺基酸序列組成:
CAAffDX4X5X6X7GLX8 [SEQ ID NO:3] 其中: X4是0或S或E或G或K;和 X5是S或T或G ;和 X6是L或S或T或L或I ;和X7是S或T或L ;和 X8是V或L。
22.根據權利要求19所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(\)，其中CDRl包含或由選自以下胺基酸序列組成:
23.根據權利要求20所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(\)，其中CDR2包含或由選自以下的胺基酸序列組成:
24.根據權利要求21所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(\)，其中CDR3包含或由選自以下的胺基酸序列組成:
25.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(')，所述可變輕鏈包含以下的⑶R:
26.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(')，所述可變輕鏈包含選自以下的胺基酸序列:
27.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變重鏈(Vh)，其中CDRl包含或由以下胺基酸序列組成:
GFTFSTYGMH[SEQ ID NO:28]。
28.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變重鏈(Vh)，其中CDR2包含或由以下胺基酸序列組成:
GKGLEffLSYISGGSSYIFYADSVRGR[SEQ ID NO:29]。
29.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變重鏈(Vh)，其中CDR3包含或由以下胺基酸序列組成:
CARILRGGSGMDL[SEQ ID NO:30]。
30.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變重鏈(Vh)，所述可變重鏈包含SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID N0:30 的 CDR。
31.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變重鏈(Vh)，所述可變重鏈包含選自以下的胺基酸序列:
32.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含以下的CDR:
33.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物包含可變輕鏈(\)和可變重鏈(Vh)，所述可變輕鏈和可變重鏈包含以下胺基酸序列:
34.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物結合CD40第一結構域(Dl)內的表位。
35.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中所述抗體、其片段、變體、融合體、或衍生物與本發明的一個或多個示例性抗體(如表A所列)競爭結合⑶40。
36.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其包含抗體Fe區。
37.根據權利要求36所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中Fe區來自IgGl抗體。
38.根據權利要求36或37所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中Fe區包含或由SEQ ID NO:62的胺基酸序列組成。
39.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其是IgG分子、或者是IgG分子的抗原結合片段、變體、融合體或衍生物。
40.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其進一步包含細胞毒性半簇。
41.根據前述權利要求任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是直接和/或間接細胞毒性的。
42.根據權利要求40或41所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇在細胞內時是細胞毒性的，和/或其在細胞外時是沒有細胞毒性的。
43.根據權利要求40或41任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是直接細胞毒性的化療劑或直接細胞毒性的多肽。
44.根據權利要求40或41任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇能夠將無細胞毒性的前藥轉換成細胞毒性藥物。
45.根據權利要求40或41任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是放射增敏劑。
46.根據權利要求40或41任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是能夠將無細胞毒性的前藥轉換成細胞毒性藥物的核酸分子。
47.根據權利要求40或41任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是直接細胞毒性的核酸分子。
48.根據權利要求40或41所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇是編碼直接細胞毒性多肽和/或間接細胞毒性多肽和/或治療多肽的核酸分子。
49.根據權利要求40或41所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中細胞毒性半簇包含放射性原子，例如選自以下的放射性原子:磷-32 ;碘-125 ；碘-131 ;銦-111 M -186 M -188 ;釔-90。
50.根據權利要求1至49任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其進一步包括容易檢測的半簇。
51.根據權利要求50所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中容易檢測的半簇包含放射性原子，例如鎝_99m或碘-123。
52.根據權利要求50所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體、或衍生物，其中容易檢測的半簇選自:碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳、鐵。
53.一種核酸分子，其編碼如權利要求1至52任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，或其多肽鏈組分。
54.根據權利要求53所述的核酸分子,其包含選自以下的一個或多個核苷酸序列:SEQID NO:40 ；SEQ ID NO:41 ；SEQ ID NO:42 ;或 SEQ ID NO:43 ;或 SEQ ID NO:44 ;或 SEQ IDNO:45 ;*SEQ ID NO:46 ;*SEQ ID NO:47 ;*SEQ ID NO:48 ;*SEQ ID NO:49 ;*SEQ IDNO:50 ;*SEQ ID NO:51 ;*SEQ ID NO:52 ;*SEQ ID NO:53 ;*SEQ ID NO:54 ;*SEQ IDNO:55 ;或 SEQ ID NO:56 ;或 SEQ ID NO:57。
55.根據權利要求54所述的核酸分子，其包含以下的核苷酸序列:
56.—種載體,其包含如權利要求53至54任一項所定義的核酸分子。
57.根據權利要求56所述的載體，其中所述載體是表達載體。
58.—種重組宿主細胞,其包含如權利要求53至55任一項所定義的核酸分子或權利要求56或57所定義的載體。
59.根據權利要求58所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是細菌細胞。
60.根據權利要求59所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是哺乳動物細胞，如人細胞。
61.一種藥物組合物，其包含有效量的如權利要求1至52任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或者變體、融合體或衍生物，以及藥學上可接受的緩衝液、賦形劑、稀釋劑或載體。
62.根據權利要求61所述的藥物組合物，其適於胃腸外施用。
63.根據權利要求61或62所述的藥物組合物，其適於在或接近腫瘤部位局部施用，例如腫瘤內或腫瘤旁。
64.一種試劑盒，其包含 根據權利要求61至63任一項所述的藥物組合物。
65.根據權利要求1至52任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，或根據權利要求53至55任一項所定義的核酸分子，或根據權利要求56或57所定義的載體，或根據權利要求58至60任一項所定義的宿主細胞，或根據權利要求61至63任一項所定義的藥物組合物，用於藥物中。
66.根據權利要求1至52任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，或根據權利要求53至55任一項所定義的核酸分子，或根據權利要求56或57所定義的載體，或根據權利要求58至60任一項所定義的宿主細胞，或根據權利要求61至63任一項所定義的藥物組合物，用於治療癌症。
67.根據權利要求1至52任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，或根據權利要求53至55任一項所定義的核酸分子，或根據權利要求56或57所定義的載體，或根據權利要求58至60任一項所定義的宿主細胞，或根據權利要求61至63任一項所定義的藥物組合物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
68.根據權利要求66所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物或核酸分子或載體或宿主細胞或藥物組合物，或根據權利要求67所述的用途，其中癌症的治療包括步驟:向有其需要的個體施用有效量的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物或核酸分子或載體或宿主細胞或藥物組合物。
69.一種治療患有癌症的個體的方法，所述方法包括步驟:向有其需要的個體施用有效量的:根據權利要求1至51任一項所定義的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物；或根據權利要求53至55任一項所定義的核酸分子；或根據權利要求56或57所定義的載體；或根據權利要求58至60任一項所定義的宿主細胞；或根據權利要求61至63任一項所定義的藥物組合物.
70.根據權利要求65、66或68任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物或核酸分子或載體或宿主細胞或藥物組合物，或根據權利要求67所述的用途，或根據權利要求69所述的方法，其中向有其需要的個體施用的步驟包括局部施用。
71.根據權利要求65、66或68任一項所述的抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物或核酸分子或載體或宿主細胞或藥物組合物，或根據權利要求67所述的用途，或根據權利要求68所述的方法，其中所述癌症選自:前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、子宮頸癌、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、多發性骨髓瘤、白血病、急性淋巴細胞白血病、黑色素瘤、膀胱癌和成膠質細胞瘤。
72.—種產生根據權利要求1至52任一項所述的抗體或抗原結合片段的方法，所述方法包括在允許所編碼的抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養根據權利要求58至60任一項所定義的宿主細胞。
73.一種抗體或其抗原結合片段、或變體、融合體或衍生物，其基本上如此處說明書中的描述。
74.—種藥物組合物或核酸分子或載體或宿主細胞或試劑盒，其基本上如此處說明書中的描述。
75.一種用途或方法，其基本上如此處說明書中的描述。
【文檔編號】A61K39/395GK103930442SQ201280054090
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年9月5日 優先權日:2011年9月5日
【發明者】P·B·J·艾爾馬克, E·M·達倫 申請人:鱷魚生物科學公司, 生物發明國際公司