食源性土黴素殘留快速半定量檢測試紙條及試紙卡的製作方法

2023-05-21 03:37:41

專利名稱：食源性土黴素殘留快速半定量檢測試紙條及試紙卡的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型檢測試紙條及試紙卡，特別是一種用於食品中土黴素 (Oxytetracyline， 0TC)殘留檢測的試紙條及試紙卡。
背景技術：
土黴素是四環素族抗生素中的一種。常用其鹽酸鹽，為淡黃色的結晶或無定形粉 末，無臭，在日光下顏色變暗，在鹼性溶液中晚破壞失效，在乙醇中微溶，在NaOH及稀HC1中 易溶。 土黴素對大多數革蘭氏陽性和陰性球菌與桿菌，對立克次體、支原體、衣原體螺旋 體和某些原蟲都有抑制作用，其抗菌機制主要為與菌核蛋白體30S亞基在A位特異性結合， 阻止aa-tRNA在該位置上的聯結，從而阻止肽鏈延伸和細菌蛋白合成，其次還可引起細胞 膜通透性改變，使胞內的核苷酸和其它重要成分外漏，從而抑制DNA複製，但是目前細菌對 其耐藥性較重，耐藥率較高，而且OTC與四環素族其它的抗生素間也存在著一定的交叉耐 藥性。 OTC在體內的殘留較重。 一般來說，0TC易吸收，但不完全，2h-4h達到血藥峰濃 度。土黴素在不同動物體內達到峰濃度的時間不同，如在牛中需要4-8小時達到峰濃度，吸 收後廣泛分布於肝、腎等組織和體液中，易滲入胸水、腹水、胎畜循環及乳汁中，也可以在肝 髒膽汁中濃縮，排入腸內，部分再被吸收，形成肚腸循環。主要以原形藥從尿中排出。豬內 40mg/kg/天，連服5天，休藥4天可食組織中殘留量為0. 04mg/kg。蛋雞服7日，蛋清濃度 迅速達到高峰，但是蛋黃濃度持續時間長，休藥13天後，蛋清和蛋黃中均可檢測到殘留量。 綿羊肌肉注射後14天，組織中殘留量才能低於0. lmg/kg，奶牛肌肉注射5mg/kg後4天，牛 奶中的殘留量在370 ii g/kg-10 ii g/kg間。 由於OTC是一種廣譜的抗菌藥，加之其價格低廉，因此作為動物生產中的飼料添 加劑用於控制動物性疾病，促進動物的生長發育，被廣泛應用於畜牧飼養場、蜂場、雞場等。 但是由於其濫用，已經引起了食源性OTC的殘留，對人體的健康造成了較大的危害，因此國 家食品安全部門、農業部門對動物性食品中，包括肉、蛋奶、蜂蜜等食品中殘留限量均進行 了嚴格的限制，明確了在肉製品中OTC的檢測量不得超過0. lmg/kg，，在蜂蜜中不得檢出。 目前測定OTC的方法主要是酶聯免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC) ， ELISA 法檢測用的試劑目前主要依賴進口 ，檢測成本很高，HPLC法要求有高端的液相色譜儀和專 門的技術人員，樣品的通量較小，需要樣品的前處理時間長，因此用HPLC法進行檢測成本 高，時間長，通量小，不適合於生產單位檢測。雖然也有利用OTC檢測用試紙條的方法進行 殘留檢測的相關報導，但是，其不能定量，假陽性和假陰性率較高，準確率得不到保證，應用 效果不理想。
發明內容 1、本設計的目的研製出簡便、快速、靈敏的土黴素半定量檢測試紙條和試紙卡。[0008] 結合附圖對本設計進行說明

圖1代表土黴素半定量快速檢測試紙側面觀；圖2代表土黴素半定量快速檢測試 紙正面觀；圖3代表土黴素半定量快速檢測試紙卡側面觀；圖4代表土黴素半定量快速檢 測試紙卡正面觀。 附圖1，2，3中標號1為進樣區，2為膠體金標記OTC單克隆抗體與第二種屬動物 蛋白的混合物，或為檢測用0TC抗原與與第二種屬動物蛋白的混合物，3為延長部分；4為3 條由檢測用OTC抗原印製而成的隱性線作為檢測線，或為3條由OTC單克隆抗體印製而成 的檢測線，5為第二種屬動物抗鼠IgG抗體印製而成的一條隱性線作為對照線，6為吸水區， 7為支撐板，8為固著在支撐板上的反應膜，9為保護膜。它們依下列次序粘著於反應膜上， 進樣區，金標記0TC單克隆抗體與第二種屬動物蛋白的混合物，3條由檢測用OTC抗原印製 而成的隱性線，l條第二種屬動物蛋白抗鼠IgG抗體印製而成的隱性線，吸水區。附圖中10 為檢測試紙卡上蓋；11為檢測試紙卡底座；附圖4中標號12為檢測試紙卡加樣孔。 膠體金標記部分為玻璃纖維或醋酸纖維，其上標記的物質為第二種屬動物蛋白與 土黴素單克隆抗體，或第二種屬動物蛋白與檢測用土黴素人工抗原的混合物，混合物混合 的方法為第二種屬動物蛋白與土黴素單克隆抗體或檢測用人工抗原的混合比例，以標準 的土黴素樣品為標準，當陰性樣品檢測時，對照線和檢測線剛好出現肉眼可見的紅色為準。 檢測反應部分上包被有土黴素檢測用抗原3條作為檢測線，或土黴素單克隆抗體3條作為 檢測線，同時還包被有第二種屬動物蛋白IgG抗體1條作為對照線。當膠體金標記部分為 第二種屬動物蛋白和土黴素單抗混合物時，在膠體金標記部分和檢測反應部分之間加長。 其中檢測用抗原是指土黴素與牛血清白蛋白或卵白蛋白結合的偶聯物，在用膠體 金標記抗原時，此混合物作為標記的對象，或在膠體金標記抗體時，此混合物作為檢測線上 的包被物質，第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物蛋白。 2、本設計所涉及的各部分的處理及功能 支撐板起支撐作用，其上粘合有反應膜，其下有防水塗層，其作用主要是起固定 反應膜等，可由硬質塑料、硬紙板、薄樹脂等韌性材料製成。 進樣區主要是由吸水能力較強的濾紙、或玻璃纖維紙製成。將上述材料與中性 (pH7. 0)的磷酸緩衝液中浸泡10分鐘以上，高溫烘乾，或防塵風乾。 膠體金標記部分的製備包括膠體金溶膠的製備，膠體金標記土黴素抗體或土黴 素人工抗原，膠體金標記部分處理。 膠體金溶膠的製備將氯金酸配製成1%的溶液(A)，取A溶液lmL，再配成0.01X 的溶液(B)，加熱至沸騰，再向B中加入1X的檸檬酸鈉水溶液5mL，繼續加熱至出現透明 的橙紅色為止，獲得直徑約為15nm的膠體金溶膠(C)。用O. lmol/L的K2C(U周pH值至 8. 5-9. 5，4t:保存備用。 膠體金標記土黴素抗體將土黴素單抗及第二種屬動物蛋白分別用PBS稀釋 到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL 土黴素單抗，1. 5mL第二種屬動物蛋白，振蕩5分 鍾，加入20%的PEG 10000至終濃度為0. 05%，4°C 8000-10000g離心20分鐘，去上清， 用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)復溶，以8000-10000g離心，15分鐘，除去上清，將沉澱用 PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0_7. 5)稀釋2000倍，產物即為金標土黴素素抗體(D)。 膠體金標記土黴素抗原將土黴素檢測用抗原及第二種屬動物蛋白分別用PBS (0. 01mol/L， pH 7. 0-8. 4)稀釋到4mg/Kg，每lOOmL C溶液中加入3mL 土黴素檢 測用抗原，1. 5mL第二種屬動物蛋白，振蕩5分鐘，加入20 %的PEG 10000至終濃度為 0. 05 % ， 4°C 8000-10000g離心20分鐘，去上清，用PBS (0. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)復溶，以 8000-10000g離心，15分鐘，除去上清，將沉澱用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)稀釋2000
倍，產物即為金標土黴素檢測用抗原(E)。 膠體金標記部分處理將獲得的D或E倒入大玻璃皿中，將精製玻璃纖維棉浸於其 中2分鐘，取出後自然乾燥。 用0.8%戊二醛溶液浸泡反應膜，半小時以上，取出烘乾，上邊包被3條不同濃度
的土黴素檢測用抗原作為檢測線，同時包被有1條抗第二種屬動物蛋白IgG抗體的對照線，
當膠體金標記為第二種屬動物蛋白和土黴素單克隆抗體的混合物時，檢測線包被的是土黴
素檢測用抗原，當膠體金標記的為第二種屬動物蛋白和土黴素檢測用抗原時，檢測線包被
的是土黴素單克隆抗體。此部分的作用是將檢測結果以不同的顏色顯示出來。 吸水區製備將醋酸纖維、吸水濾紙等經室溫乾燥後，用作檢測反應後多餘反應液
的吸收部分。 延長部分的製備將玻璃纖維棉、醋酸纖維、等經室溫乾燥後加在膠體金標記部分 與檢測反應部分之間。 試紙的組裝將進樣區、膠體標記區、延長區、檢測反應區及吸水區依次粘於固定 在支撐板上的反應膜上，再在其兩端加上不乾膠保護膜，即成為土黴素半定量檢測試紙。
試紙卡的組裝將上述不加保護膜的試紙芯置於一種特殊的有槽底座中(11)，其 上粘有部分區域帶有顏色的上蓋(IO)，上蓋有加樣孔(12)，加樣孔一側有深色塗層，底座 與上蓋在周邊用膠粘合在一起。
檢測原理 當膠體金標記部分的標記物為第二種屬動物蛋白和土黴素素單克隆抗體的混合 物時，如果樣品中含有土黴素，進樣後，樣品通過試紙的虹細作用到達膠體金部分，樣品中 的土黴素與膠體金標記的土黴素單克隆抗體結合，形成複合物，結合物上移到達檢測線，因 膠體金標記的抗體只有一個土黴素結合位點，樣品溶液中的土黴素與之結合後，檢測線上 的檢測用的抗原便不能與膠體金標記的土黴素抗體結合，檢測線不顯色；當樣品中不含有 土黴素時，膠體金標記的土黴素單抗便被檢測用抗原捕獲，檢測線顯色。無論樣品中是否含 有土黴素，膠體金標記的第二種屬動物蛋白都可以到達對照線，與對照線上包被的第二種 屬動物蛋白抗體結合，形成肉眼可見的顏色。如果對照線不出顏色，則說明試紙條失效。當 膠體金標記物為第二種屬動物蛋白與檢測用土黴素抗原的混合物時，如果樣品中含有土黴 素，樣品溶液會通過毛細作用上移，其中土黴素分子量小，移動速度快，先達到檢測線，與檢 測線上包被的土黴素單抗結合，因土黴素單抗只有一個結合位點，且土黴素小分子與土黴 素單抗結合力較檢測用蛋白偶合的土黴素人工抗原與抗體的結合力強，於是檢測用抗原不 能與檢測線上的土黴素單抗結合，檢測線不顯色。如果樣品中不含有土黴素，則膠體金標記 的土黴素人工抗原則可以達到檢測線後與土黴素單抗結合，檢測線顯色。無論樣品中是否 含有土黴素，膠體金標記的第二種屬動物蛋白都可以到達對照線，與對照線上包被的第二 種屬動物蛋白抗體結合，形成肉眼可見的顏色。如果對照線不出顏色，則說明試紙條失效。 半定量的方法通過調節檢測線與對照線包被物濃度，調節顯色深淺，將檢測線顯
5色深淺與標準物質濃度呈線性相關，即可達到半定量的目的。[0029] 3、使用方法 3條檢測線包被有0. 01-30 ii g/mL的土黴素單克隆抗體或土黴素檢測用抗原，三條檢測線上包被的濃度漸減，參考線包被有濃度為0. 01-30 ii g/mL的抗第二種動物蛋白的IgG ;各條線之間間隔5mm，當3條檢測線都呈現顏色時，則樣品為陰性，當檢測線第1，2條檢測線呈色，第3條檢測線不呈色時，則樣品中土黴素的濃度大於A ng/mL，小於B ng/mL，當第1條檢測線呈色，第2，3條線不呈色時，樣品中土黴素的濃度大於B ng/mL，小於C ng/mL，當3條線都不呈色時，樣品中土黴素的含量大於C ng/mL。其中A、B、C為設定的檢測限，可以是大於或等於0. lng/mL的某一濃度，三種濃度為A < B < C。對照線一直呈色，如不顯色，表明試紙失效。[0031] 4、本設計的優點 特異性強。本設計採用了土黴素單克隆抗體用來檢測食源性土黴素素殘留。由於
單克隆抗體的特異性極高，所以本發明的試紙及試紙卡能夠極特異地檢測，與四環素、金黴
素、利它黴素、泰樂菌素、呋喃唑酮等生產中常用抗生素無交叉反應，無假陽性。 靈敏度高。本試紙檢測下限可達到lng/mL，也可以根據檢測要求，把檢測濃度調到
lng/mL以上。 檢測快速。本試紙可以在樣液加入後2-5分鐘出現結果，且顏色穩定，比一般的酶聯免疫法快50倍以上。 準確性高。本設計採用了 3條檢測線結合1條對照線的方法進行檢測，通過檢測線顏色與對照線顏色深淺及檢測線呈現顏色條帶數，可以做到半定量。與一般的僅一條檢測線的試紙條相比，準確性高。 成本低廉。本發明的檢測成本較一般的酶聯免疫檢測成本低很多，如果大規模製備，成本將更低。 操作方便。本設計用於土黴素殘留檢測無需任何專門的儀器設備，不需要專業技術人員培訓，只要用肉眼判讀即可檢測出殘留情況。而且各種樣品均可以進行測定。因此本設計適合範圍較廣，適合於衛生檢測部分、食品安全檢測部門、動物飼養場、食品加工廠、個人使用。
5、具體實驗例 (1) 土黴素素人工抗原的合成 具體方法一採用羰二亞胺法將OTC與BSA偶聯，形成OTC-BSA。將BSA和羰二亞胺分別溶於PBS (0. 01mol/L、pH7. 4)中，0TC溶於甲醇中。然後將EDC溶液和0TC溶液加至BSA溶液中。室溫避光攪拌反應20h以上，5000-8000g離心10-20min，取上清，用PBS (0. 01mo1/L、 pH7. 4)於4。C透析48h以上。0TC與0VA的偶聯方法同上。具體方法二採用羰基二咪唑法(CD I法)將0TC和CD I在適量無水丙酮中室溫避光反應，得到OTC和CDI的中間產物，再將該中間產物用PBS(0.01mol/L、 pH7. 4)溶解，最後加入BSA，室溫避光反應20h。5000-8000r/min離心15min，取上清用PBS(O. 01mol/L、 pH7. 4)於4。C透析48h以上。OVA與OTC的偶聯方法同上。製備出的抗原進行鑑定的方法為將0TC、 BSA、 0VA、偶聯產物、載體蛋白與OTC的簡單混合物分別加入濃硫酸，根據其顯色反應的不同也可鑑定抗原偶聯情況。或者將BSA、0VA、0TC、偶聯產物，載體蛋白與0TC的簡單混合物經適當稀釋後，在250 400nm波長範圍內掃描，分析掃描圖譜，並對它們的特徵性吸收峰的偏移情況進行對比。[0041] (2) 土黴素單克隆抗體製備 對6周齡的SPF雌性BALB/c小鼠進行皮下多點注射，免疫劑量為60 y g蛋白/只。初次免疫時，抗原和等量的弗氏完全佐劑混合均勻，以後各次均和等量的不完全佐劑混合。初次免疫與再次免疫時間間隔2周，以後每次免疫之間間隔2周，每次免疫量均為30ug蛋白/只，共免疫4次。免疫4次後小鼠眼眶取血，測血清效價。測定方法為BSA和OVA偶聯土黴素2ug/ml，4t:包被過夜，37t:封閉2h ;多抗血清從200倍開始2倍梯度稀釋，空白對照(blank)為PBS，陰性對照(negative)為陰性血清200倍稀釋。效價測定結果表明，免疫的4隻鼠中的第4號OTC-BSA與OTC-OVA效價達106以上，所以腹腔衝擊免疫4#鼠，免疫量為50ug蛋白。衝擊後可以進行細胞融合，具體步驟為將狀態良好的sp2/0細胞輕柔的從培養瓶壁上吹打下來，吸入到50ml離心管中。小鼠摘眼球取血，然後拉頸處死，放入75%的酒精中浸泡5min。在平皿中倒入少量無血清的MDM，將細胞篩及注射器內芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細胞篩上。用注射器的內芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細胞吸入到裝sp2/0的離心管中，離心1500rad/min，5min。用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細胞到15ml離心管中，再加入lml的HAT，放在孵箱中備用。將離心好的細胞，倒掉上清，用無血清的MDM將細胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min，5min)。將離心好的細胞上清儘量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細胞，將離心管放入37t:溫水中，在1分鐘內緩慢加入lml的PEG，加完後，在溫水中靜置lmin。然後2min內緩慢加入2ml的無血清的MDM，接著2min內緩慢加入8ml無血清的MDM。離心1000rad/min， 5min。倒掉上清，加入10ml的血清，小心的將細胞吹勻，倒入前面準備好的胸腺細胞。再加入25ml滅過菌的半固體培養基，充分混勻。然後均勻倒入30個細胞培養皿中。將細胞培養皿放入溼盒中，然後放入孵箱中培養。挑5X93個細胞單克隆，培養於5塊96孔細胞培養板(事先用胸腺細胞鋪板，100ul/孔)。第3天對5塊96孔細胞培養板，全部換液。第6天用免疫蛋白BSA偶聯土黴素包板，對挑選的克隆採用ELISA方法，做第二次篩選，得到9株陽性雜交瘤細胞株。具體步驟為首先用包被液稀釋抗原(huh印)，終濃度為2ug/ml，100ul/孔，4t:，過夜；後用洗液洗滌2次。加入一抗(細胞培養上清)、陰性對照(SP2/0培養上清)、空白對照(PBS)、陽性對照(陽性血清PBS 200倍稀釋)，均為100ul/孔，37t:孵箱，溫育lh後用洗液洗滌3次。加入PBS稀釋20000倍的二抗，100u1/孔，37。C孵箱溫育lh，取出後用洗液洗滌3次。最後是顯色，採用顯色液100ul/孔，顯色時間為5min左右。每孔加入50ul終止液終止。在雙波長(450,603)條件下測吸光值，記錄保存數據。 每隻小鼠腹腔注射滅菌的液體石蠟0. 5mL， 1周後同法每隻小鼠注射IX 106個雜交瘤細胞，10d後抽取腹水，離心去除油脂和沉澱，獲得單克隆抗體。用間接EL ISA法檢測腹水效價，確定合適的抗原包被濃度和腹水稀釋倍數。將旗水做適當稀釋後，分別與0、0. 1、1 、 10、 100、 1000mg/L等不同濃度的OTC標準品按等體積加入酶標板中反應，繪製標準曲線測定其親和力、靈敏度與檢測限。以OTC的結構類似物鹽酸土黴素(0TC-HC1)、鹽酸金黴素(CTC-HC1)、鹽酸四環素(TC-HC1)與其做競爭EL ISA，檢測其交叉反應。所用競爭物的濃度同上。獲得的穩定性及特異性較高的腹水經層析純化後即為OTC單克隆抗體。[0044] (3)樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維棉浸於PBS中2分鐘以上，然後烘乾。[0045] (4)膠體金標記部分的製備包括膠體金溶膠的製備，膠體金標記土黴素抗體或土黴素人工抗原，膠體金標記部分處理。 (5)膠體金溶膠的製備將氯金酸配製成1 %的溶液(A)，取A溶液lmL，再配成0. 01%的溶液(B)，加熱至沸騰，再向B中加入1%的檸檬酸鈉水溶液5mL，繼續加熱至出現透明的橙紅色為止，獲得直徑約為15nm的膠體金溶膠(C)。用O. lmol/L的I^C03調pH值至8. 5-9. 5，4t:保存備用。 (6)膠體金標記土黴素抗體將土黴素單抗及第二種屬動物蛋白分別用PBS稀釋到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL 土黴素單抗，1. 5mL第二種屬動物蛋白，振蕩5分鐘，加入20%的PEG 10000至終濃度為0. 05%，4°C 8000-10000g離心20分鐘，去上清，用PBS (0. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)復溶，以8000-10000g離心，15分鐘，除去上清，將沉澱用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0_7. 5)稀釋2000倍，產物即為金標土黴素素抗體(D)。[0048] (7)膠體金標記土黴素抗原將土黴素檢測用抗原及第二種屬動物蛋白分別用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-8. 4)稀釋到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL 土黴素檢測用抗原，1. 5mL第二種屬動物蛋白，振蕩5分鐘，加入20 %的PEG 10000至終濃度為0. 05%，4°C 8000-10000g離心20分鐘，去上清，用PBS (0. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)復溶，以8000-10000g離心，15分鐘，除去上清，將沉澱用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)稀釋2000倍，產物即為金標土黴素檢測用抗原(E)。 (8)膠體金標記部分處理將獲得的D或E倒入大玻璃皿中，將精製玻璃纖維棉浸於其中2分鐘，取出後自然乾燥。 (9)檢測反應部分處理用0. 8%戊二醛溶液浸泡反應膜，半小時以上，取出烘乾，
上邊包被3條不同濃度的土黴素檢測用抗原作為檢測線，同時包被有1條抗第二種屬動物
蛋白IgG抗體的對照線。此部分的作用是將檢測結果以不同的顏色顯示出來。 (10)試紙組裝將進樣區、膠體標記區、延長區、檢測反應區及吸水區依次粘於固
定在支撐板上的反應膜上，再在其兩端加上不乾膠保護膜，即成為土黴素半定量檢測試紙。
(11)試紙卡的組裝將上述不加保護膜的試紙芯置於一種特殊的有槽底座中，其
上粘有部分區域帶有顏色的上蓋，上蓋有加樣孔，加樣孔一側有深色塗層，底座與上蓋在周
邊用膠粘合在一起。
(12)檢測試紙的製備要求 物理要求外觀平整，材料粘合牢固。以生理鹽水為樣品液，吸樣後lmin觀察，樣液移行速度5mm/min以上。 陰性參考品符合率用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)配製濃度為50ng/ml的四環素溶液進行10次平行檢測，反應時間在5min時觀察結果，應為陰性；用PBS(O. 01mol/L，pH7. 0-7. 5)配製濃度為100ng/ml的金黴素溶液進行10次平行檢測，反應時間在5min時觀察結果，應為陰性。 陽性參考品符合率用PBS(O. 01mol/L，pH 7. 0-7. 5)配製濃度為10、50、 100ng/ml的OTC標準溶液，分別進行10次平行檢測，反應時間在5min時觀察結果，無陰性結果出現。[0057] 最低檢測限用PBS(O. 01mol/L， pH 7. 0-7. 5)配製濃度為0、0. 5、 1、2、5、 10ng/ml的OTC標準溶液，分別進行10次平行檢測，反應時間在5min時觀察結果，最低檢出量不高於lng/ml。 再現性用PBS(O. 01mol/L，pH 7. 0-7. 5)配製濃度為10ng/ml的OTC標準溶液，分別進行10次平行檢測，反應時間在5min時觀察結果，反應結果應一致，顯色度均一。[0059] 穩定性將完好的成品放於37t:恆溫箱中IO天后取出檢測，所有指標達到上述要求。 (13)試紙使用[0061] 樣品製備 蜂蜜取lg樣品加入10ml稀釋液，每間隔2分鐘用力震蕩；10分鐘後搖勻靜置lmin取上清100iU，用稀釋液做IO倍的稀釋後用試紙檢測。 牛奶取lg樣品加入10ml稀釋液，每間隔2分鐘用力震蕩；10分鐘後搖勻靜置lmin取上清100iU，用稀釋液做IO倍的稀釋後用試紙檢測。
飼料取lg樣品加入10ml稀釋液，每間隔2分鐘用力震蕩；10分鐘後搖勻靜置lmin取上清100iU，用稀釋液做IO倍的稀釋後用試紙檢測。[0065] 尿液用尿液直接測定，也可以離心後取上清液測定。
血清抽取動物血液，離心後取透明上清測定，或者用蒸餾水稀釋一倍後再進行測定。
檢測實例 將試紙箭頭浸泡在待測樣品中，浸入30秒時取出放平，20分鐘讀取結果。採用3條檢測線包被有0. 01-30 ii g/mL的土黴素單克隆抗體或土黴素檢測用抗原，三條檢測線上包被的濃度漸減，對照線包被有濃度為0. 01-30 ii g/mL的抗第二種動物蛋白的IgG ;各條線之間間隔5mm，當3條檢測線都呈現顏色時，則樣品為陰性，當檢測線第1，2條檢測線呈色，第3條檢測線不呈色時，則樣品中土黴素的濃度大於A ng/mL，小於B ng/mL，當第1條檢測線呈色，第2，3條線不呈色時，樣品中土黴素的濃度大於B ng/mL，小於C ng/mL，當3條線都不呈色時，樣品中土黴素的含量大於C ng/mL。其中A、B、C為設定的檢測限，可以是大於或等於O. lng/mL的某一濃度，三種濃度為A < B < C。對照線一直呈色，如不顯色，表明試紙失效。 使用試紙卡檢測方法與試紙條相同，此處略。
權利要求食源性土黴素殘留快速半定量檢測試紙含有支撐板、進樣區、反應區及吸水區，進樣區、反應區及吸水區按順序粘貼於支撐板上，各區間有2-5mm的間隔，其特徵在於反應區包括反應膜、膠體金標記部分、檢測用抗原及第二種屬動物蛋白，膠體金標記部分標記的物質土黴素的單克隆抗體，或土黴素檢測用抗原，檢測反應部分為包被有第二種屬動物蛋白及土黴素用抗原混合物印製成的3條線作為檢測線，或包被有第二種屬動物蛋白及土黴素單克隆抗體混合物印製成的3條線作為檢測線，同時包被有抗鼠IgG條帶作為對照線。
2. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於土黴素檢測用抗原為土黴素與牛血清白 蛋白(BSA)或卵清白蛋白(0VA)形成的偶合物。
3. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於第二種屬動物蛋白為非抗體來源屬動物 的蛋白。
4. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於所說的支撐板為薄樹脂、或硬紙板、塑料卡等。
5. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於反應膜是硝酸纖維素膜、或醋酸纖維素膜、 玻璃纖維棉。
6. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於吸水區由吸水能力較強的濾紙或濾油紙製成。
7. 根據權利要求1所說的試紙，其特徵在於保護膜為不乾膠膜。
8. 根據權利要求1所說的試紙卡，其特徵在於由底座及部分帶有顏色的上蓋組成，底 座有槽可放試紙芯，上蓋有加樣孔，加樣孔一側有深色塗層，底座與上蓋在周邊用膠粘合在一起。
專利摘要本實用新型公開一種用於食源性土黴素快速半定量檢測的試紙條和試紙卡。試紙條含有支撐板、樣品區、金標結合物、檢測區、對照區、反應膜、吸水區及保護膜。檢測區包括由金標土黴素單克隆抗體及第二種屬動物蛋白的混合物，檢測用土黴素印製而成的3條隱性直線，或金標記檢測用土黴素人工抗原與第二種屬動物蛋白的混合物，土黴素單克隆抗體印製而成的3條隱性直線，對照區是由抗第二種屬動物蛋白IgG抗體印製而成的1條隱性直線。將不帶有保護膜的試紙芯外加特製的透明塑料卡包被，製成檢測用試紙卡。本試紙條及試紙卡適用於食品安全檢測部門、研究部門、蜂場、個人用於檢測蜂蜜、牛奶、肉組織、飼料、血清樣品中的土黴素殘留，具有快速、特異性強、方便等特點。
文檔編號G01N33/577GK201514410SQ20092011015
公開日2010年6月23日 申請日期2009年7月22日 優先權日2009年7月22日
發明者侯麗薇, 國佔寶, 徐書法, 曹坦, 趙靜 申請人:中國農業科學院蜜蜂研究所;徐書法