亞麻籽木脂素總糖苷提取物的製備方法及其應用的製作方法
2023-05-20 20:44:51
專利名稱：亞麻籽木脂素總糖苷提取物的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從亞麻籽中提取分離木脂素總糖苷有效部位的方法，具體地說是從亞麻籽中提取分離具有預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆、血脂代謝紊亂的木脂素總糖苷提取物。
背景技術：
亞麻(Linum usitatissimum)，又稱胡麻，是生產纖維(麻)、油(亞麻油)和食品的傳統作物。亞麻籽中含有較多的木脂素糖苷類化合物，其主要的生物活性成分為開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)，臨床和藥理試驗證明亞麻籽及SDG具有植物雌激素的作用，抗腫瘤的作用，抗脂質過氧化的活性，對心血管疾病作用等重要的生理活性。亞麻在我國北方廣泛種植，是我國的主要經濟作物之一，亞麻籽年產量約42萬噸，具世界第四位，我國目前主要用於榨油。(王萍.亞麻木酚素生理功能.糧食與油脂，2000445-46.)。
亞麻籽中的木脂素糖苷類化合物SDG由於具有廣泛的生物活性而得到重視，但該類化合物的大規模提取分離具有一定的難度，限制了在醫藥及食品補充劑中的運用。1956年Bakke等就報導了採用乙醇和二氧六環混合溶劑提取，再採用甲醇鈉或甲醇鋇水解的提取分離SDG的方法(Bakke J.E.，Proceeding of the North Dakota Academy of Science，1956，1018-22.)；US 5705618專利報導了採用含水醇提取，鹼水解，醋酸乙酯萃取或離子交換樹脂分離，製備HPLC色譜純化的製備工藝；US 6806356專利報導了採用丙酮水提取，鹼水解的工藝；WO062812專利報導了採用超臨界二氧化碳萃取和反相C18色譜分離的工藝；CN 1162438C報導了採用含水醇提，鹼水解，矽膠色譜分離的工藝。現有工藝均存在提取分離工藝成本高，容易帶有溶劑殘留，難以工業化生產的問題。
婦女更年期綜合症是由於在絕經前後，由於卵巢功能退行性改變，雌激素水平低下所導致的以植物神經功能紊亂為主，伴有心理症狀的一組症候群。據國內外有關資料報導，在45-50歲90％的婦女均有不同程度的臨床表現並由此引起疾病，其中以骨質疏鬆和心腦血管疾病最為常見(韓學陽，女性生殖內分泌激素與補充治療.北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1993，348-57.)。亞麻籽中含有較大含量的木脂素糖苷類成分，該類植物雌激素前體活性成分能在腸道細菌的作用下形成兩種主要的哺乳動物木脂素腸內脂(enterolactone)和腸二醇(enterodiol)(Borriello S.P.，Journal of Applied Bacteriology，1985，5837-43.)。運用亞麻籽中木脂素總糖苷有效部位，預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆、血脂代謝紊亂的動物試驗和臨床研究未見報導。最相關的資料是US 6498145專利公開了提純的SDG在降血壓製劑的運用；US 6673773專利公開了亞麻籽中木脂素、香草酸葡萄糖苷、戊二酸組合物在降膽固醇和動脈粥樣硬化的應用。但以上專利均沒有涉及婦女更年期疾病的預防和治療，尤其是本發明的技術方案製備得到的木脂素總糖苷的活性報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種運用大孔吸附樹脂從亞麻籽中提取分離木脂素總糖苷的方法。
本發明的另一目的是在於提供這種亞麻木脂素總糖苷在用於製備預防及治療婦女更年期的骨質疏鬆、脂質代謝紊亂的藥品和保健食品中的運用。
一種從亞麻籽木脂素總糖苷提取物的製備方法，包括以下步驟a.將亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕，或經脫殼處理得到的亞麻籽殼，粉碎成粒狀粉末；b.將a得到的亞麻籽原料，加低級醇或含水低級醇提取，回收，提取物經鹼水解，中和，濾過，收集濾液；或將b得到的亞麻籽原料直接用鹼性低級醇或含水低級醇溶液提取，中和，回收，濾過，收集濾液；c.將b收集的濾液上樣於大孔吸附樹脂柱分離，含水低級醇溶液梯度洗脫，收集40％～60％含水低級醇洗脫液；d.將c收集的40％～60％含水低級醇洗脫液減壓回收至幹，乾燥粉碎得亞麻籽木脂素總糖苷，其中木脂素總糖苷含量為60％～85％。
所述的低級醇的碳數為C1～C3，優選的低級醇為乙醇；步驟b可按下列任何一種方法進行(i).提取的低級醇溶液為70％乙醇，加入量為5～10倍，提取次數為1-2次，提取時間為6～10hr,室溫攪拌提取，提取液減壓回收至幹，提取物加入10-20倍量的鹼水液，室溫攪拌水解4～8hr，水解液加入濃酸中和至PH值為6-7，離心，或濾過，得濾液；(ii).鹼性醇溶液為溶解無機鹼的乙醇溶液或含水乙醇溶液，加入量為5-10倍，室溫攪拌提取，提取時間為6～10hr，提取液中和至中性，回收溶劑，加入適量水溶解，離心，或濾過，得濾液；所述用於水解提取物的無機鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀，濃度為2～6％；鹼性醇溶液為2～6％的氫氧化鈉或氫氧化鉀的乙醇溶液；所述步驟c可採用濾液上樣於大孔吸附樹脂柱，依次用20％，50％，95％乙醇梯度洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收至幹；所述步驟c採用的大孔吸附樹脂為聚苯乙烯骨架的極性或非極性大孔吸附樹脂，可選用D101，AB-8，XAD-2，HP-20等型號的樹脂。
提取方法包括室溫攪拌提取、40℃攪拌提取、回流、滲漉等，為了所提取成分的穩定性及節約能源，最好採用室溫攪拌提取。
亞麻籽木脂素總糖苷提取物的乾燥方法為真空乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥，最好為真空乾燥。
一種亞麻籽木脂素總糖苷提取物，該亞麻籽提取物採用上述方法製備得到。
本發明提供的提取溶劑、濃度、提取方法、水解方法是通過試驗比較確定；大孔樹脂的洗脫工藝是通過嚴格的不同濃度含水醇梯度洗脫試驗，通過HPLC含量監控確定，洗脫部位的木脂素總糖苷含量(主要成分為開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷，松脂醇二葡萄糖苷等)達到60％～85％，洗脫部位經化學法檢識無氰苷類成分，氣相色譜未檢出本提取物中苯乙烯、甲苯等由於採用大孔樹脂工藝帶來的樹脂殘留物。
含量測定的方法照高效液相色譜法(中國藥典2000版一部附錄VID)測定。
色譜條件Shimadzu CLC ODS C184.6×150mm；甲醇0.2％HOAc(35∶65)；UV 280nm；一種亞麻籽木脂素總糖苷提取物製劑，其特徵在於該製劑以本發明技術方案製備得到的亞麻籽木脂素總糖苷提取物為主要活性成分，加上藥劑上或保健食品可接受的輔料，製成藥劑或保健食品可接受的劑型。所述的輔料可選自亞麻油、大豆油、澱粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、氯化鈉、維生素E、維生素C、半胱氨酸、亞硫酸鈉等中的任意一種或幾種。所述的藥劑或保健食品可接受的劑型為口服製劑或注射劑，優選為軟膠囊、硬膠囊、片劑、滴丸、水針、粉針或輸液。
本發明所得到的亞麻木脂素總糖苷提取物製備所需的藥品或保健食品的各種劑型時，可以按照藥劑或保健食品的常規生產方法製備。如將該提取物與一種或多種載體混合，然後製成相應的劑型。
本發明所得到的亞麻木脂素總糖苷提取物能夠顯著改善去卵巢大鼠的骨質疏鬆及血脂代謝紊亂的作用，可用於預防及治療婦女更年期的骨質疏鬆、脂質代謝紊亂的病症。
本發明得到的木脂素總糖苷提取物，可與藥用輔料混合，製備具有預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆、血脂代謝紊亂的藥物和保健食品。
本發明的優點是本發明所提供的亞麻木脂素總糖苷提取物，其製備工藝簡單，成本低，無溶劑殘留，適合工業化生產。
以下通過實施例詳細說明本發明的技術方案，並不以此限定本發明的實施範圍。
具體實施例方式
實施例1亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、3倍量體積的70％乙醇，室溫攪拌提取2次，第一次8小時，第二次2小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入10倍量體積的4％NaOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以50％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物82g，木脂素總糖苷含量為75％。
實施例2經脫殼處理得到的亞麻籽殼5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、3倍量體積的70％乙醇，室溫攪拌提取2次，第一次8小時，第二次2小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入10倍量體積的4％NaOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以50％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物95g，木脂素總糖苷含量為78％。
實施例3亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、3倍量體積的鹼性70％乙醇溶液(2％NaOH)，室溫攪拌提取2次，第一次8小時，第二次2小時。提取液合併，加入濃鹽酸中和至PH 6，減壓回收至無醇味，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以50％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物82g，木脂素總糖苷含量為75％。
實施例4亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、3倍量體積的70％乙醇，室溫攪拌提取2次，第一次8小時，第二次2小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入10倍量體積的4％NaOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以50％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物68g，木脂素總糖苷含量為80％。
實施例5亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、5倍量體積的70％乙醇，回流攪拌提取2次，每次3小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入10倍量體積的4％NaOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以50％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物72g，木脂素總糖苷含量為82％。
實施例6亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、5倍量體積的70％乙醇，回流攪拌提取2次，每次3小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入10倍量體積的4％KOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以60％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物65g，木脂素總糖苷含量為72％。
實施例7亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕5Kg，粉碎，加入藥材重量8倍、5倍量體積的70％乙醇，回流攪拌提取2次，每次3小時。提取液合併，減壓回收至幹；醇提物加入20倍量體積的4％NaOH溶液，室溫攪拌水解4小時，水解液中加入濃鹽酸中和至PH 6，離心(3500rpm，5min)，上清液上樣於已處理好的D101大孔吸附樹脂柱，以水洗去雜質，再以60％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，所得浸膏真空乾燥，即得亞麻木脂素總糖苷提取物56g，木脂素總糖苷含量為78％。
實施例8亞麻籽木脂素總糖苷提取物對去卵巢大鼠骨質疏鬆症、血脂紊亂的作用1.建立模型與分組取Wistar健康6月齡雌性大鼠50隻，隨機分為5組，以30mg/kg體重的劑量腹腔注射1％戊巴比妥鈉溶液，無菌條件下摘除雙側卵巢作為模型大鼠；陰性對照組切除腹部雙側一小塊脂肪，作為假手術組(對照組，10隻)；證明徹底去勢後的模型大鼠隨機分為去勢空白對照(模型組，10隻)，去勢陽性藥物組(10隻)，亞麻籽木脂素總糖苷低劑量組(FS-L，10隻)，亞麻籽木脂素總糖苷高劑量組(FS-H，10隻)。
2.給藥手術後2周後各組分別經口給予以下藥物假手術組去離子水(10ml·kg-1·d-1)；去勢空白對照組去離子水(10ml·kg-1·d-1)；去勢陽性藥物組尼爾雌醇(E3)1.5mg·kg-1·d-1；低劑量組FS50mg·kg-1·d-1；高劑量組FS150mg·kg-1·d-1。灌胃容積為2ml/只，每天1次。各組動物給藥90天後，2％戊巴比妥注射麻醉，腹主動脈取血分離血清置冰箱冷藏集中測試，取股骨剝離乾淨作骨密度檢測，完整摘取子宮稱重計算子宮指數。
3.檢測指標和方法血清雌二醇(E2)用放射免疫分析法測定；骨密度用雙能X線骨密度儀檢測；血清鈣(Ca)、磷(P)、鹼性磷酸酶(AKP)採用試劑盒法(放射免疫分析法)測定；總膽固醇採用CHOD-PAP法測定；甘油三酯(TG)採用GPO-PAP法測定；高密度脂蛋白膽固醇(HDLc)採用酶法測定；低密度脂蛋白膽固醇(LDLc)採用CHOD-PAP法測定；具體方法按各試劑盒說明書操作；以上各項指標的測定方法若為酶法，採用全自動生化分析儀(Olympus 400，日本)；若為沉澱法，採用半自動生化分析儀(CBI 71型，中國)。
4.結果(1)對體重、子宮係數及血清雌二醇的影響各組大鼠體重無明顯差異。與對照組相比較，模型組的子宮係數明顯降低；與模型組相比，尼爾雌醇組、FS二個劑量組的大鼠子宮係數升高；相對於模型組，尼爾雌醇組及FS的二個劑量組血清雌二醇(E2)水平皆顯著升高。結果見Tab.1。
Tab.1FS對大鼠體重、子宮係數和血清雌二醇含量的影響(n＝10，x±s)
注與對照組比較#p＜0.01；與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
(2)對大鼠骨密度(BMD)和骨代謝生化指標的影響與對照組比較，模型組的BMD值顯著降低；與模型組比較，尼爾雌醇組、FS的二個劑量組的BMD值顯著升高；各組大鼠的血清鈣(Ca)含量組間無顯著性差異。與對照組比較，模型組的鹼性磷酶(AKP)顯著升高，血磷(P)含量明顯降低；與模型組比較，尼爾雌醇組、FS的二個劑量組的AKP顯著降低，血磷(P)含量明顯升高。結果見Tab.2。
Tab.2FS對大鼠BMD和骨代謝生化指標的影響(n＝10，x±s)
注與對照組比較#p＜0.01；與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01。
(3)對大鼠血脂譜的影響與對照組比較，模型組大鼠的血清中的總膽固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)低密度脂蛋白(LDLc)分別升高了98.1％、33.9％和43.8％，但高密度脂蛋白(HDLc)下降了13.4％，與模型組比較，尼爾雌醇組和Fs的兩個劑量組均能明顯降低因去勢形成的TC、TG和LDLc的升高，但對HDLc影響不大。可能對高血脂(尤其是LDLc)有一定的調節作用。
Tab.3FS對去卵巢大鼠血脂水平的影響(n＝10，x±s)
注與對照組比較#p＜0.05；與模型組比較*p＜0.05。
5.討論人體內雌激素水平的高低與脂代謝和骨代謝密切相關，體內雌激素水平下降，是絕經後婦女骨質疏鬆和心血管發病率增高的主要原因。文獻研究表明，植物雌激素如大豆異黃酮可抑制骨吸收，減少婦女絕經後的骨丟失，預防骨質疏鬆的發生；同時雌激素可促進血脂的降解和排洩，降低TC、LDLc水平，減少膽固醇在動脈壁的沉著，抑制動脈粥樣硬化斑塊形成(Uesugi T，Bio1.Pharm.Bull.，2001，24(4)368-372.)。本研究動物試驗表明，本發明的亞麻籽木脂素糖苷提取物能夠顯著增高去卵巢大鼠的骨密度，同時顯著降低血清中鹼性磷酸酶活性，從而抑制雌激素缺失所致的骨代謝高轉換狀態；以上提示本品具有較好的改善去卵巢大鼠的骨質疏鬆作用。本品對於去卵巢大鼠的血脂代謝結果表明，亞麻籽木脂素糖苷提取物能夠顯著降低血清中TC，LDLc水平，對HDLc影響不大，提示本品具有較好降血脂及降低動脈粥樣硬化風險的作用。
綜上所述，本發明的亞麻籽木脂素糖苷提取物具有預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆症、血脂紊亂的作用。
權利要求
1.一種從亞麻籽木脂素總糖苷提取物的製備方法，包括以下步驟a.將亞麻籽經榨油得到的基本不含油脂的亞麻餅粕，或經脫殼處理得到的亞麻籽殼，粉碎成粒狀粉末；b.將a得到的亞麻籽原料，加低級醇或含水低級醇提取，回收，提取物經鹼水解，中和，濾過，收集濾液；或將a得到的亞麻籽原料直接用鹼性低級醇或含水低級醇溶液提取，中和，回收，濾過，收集濾液；c.將b收集的濾液上樣於大孔吸附樹脂柱分離，含水低級醇溶液梯度洗脫，收集40％～60％含水低級醇洗脫液；d.將c收集的40％～60％含水低級醇洗脫液減壓回收至幹，乾燥粉碎得亞麻籽木脂素總糖苷，其中木脂素總糖苷含量為60％～85％。
2.根據權利要求1所述的工藝，其特徵在於所述的低級醇的碳數為C1～C3，優選的低級醇為乙醇；
3.根據權利要求1所述的工藝，步驟b可按下列任何一種方法進行(i).提取的低級醇溶液為70％乙醇，加入量為5～10倍，提取次數為1-2次，提取時間為6～10hr，室溫攪拌提取，提取液減壓回收至幹，提取物加入10-20倍量的鹼水液，室溫攪拌水解4～8hr，水解液加入濃酸中和至PH值為6-7，離心，或濾過，得濾液；(ii).鹼性醇溶液為溶解無機鹼的乙醇溶液或含水乙醇溶液，加入量為5-10倍，室溫攪拌提取，提取時間為6～10hr，提取液中和至中性，回收溶劑，加入適量水溶解，離心，或濾過，得濾液；
4.根據權利要求3所述用於水解提取物的無機鹼為氫氧化鈉或氫氧化鉀，濃度為2～6％；鹼性醇溶液為2～6％的氫氧化鈉或氫氧化鉀的乙醇溶液。
5.根據權利要求1，步驟c的特徵在於濾液上樣於大孔吸附樹脂柱，依次用20％，50％，95％乙醇梯度洗脫，收集50％乙醇洗脫液，減壓回收至幹。
6.根據權利要求1，步驟c採用的大孔吸附樹脂為聚苯乙烯骨架的極性或非極性大孔吸附樹脂，可選用D101，AB-8，XAD-2，HP-20等型號的樹脂。
7.一種亞麻籽木脂素總糖苷提取物，其特徵在於該亞麻籽提取物採用權利要求1至6中任何一項所述的方法製備得到。
8.一種亞麻籽木脂素總糖苷提取物製劑，其特徵在於該製劑以權利要求7所述的亞麻籽木脂素總糖苷提取物為主要活性成分，加上藥劑上或保健食品可接受的輔料，製成藥劑或保健食品可接受的劑型。
9.根據權利要求8所述的亞麻籽木脂素總糖苷提取物製劑，其特徵在於所述的藥劑或保健食品可接受的劑型為口服製劑或注射劑，優選為軟膠囊、硬膠囊、片劑、滴丸、水針、粉針或輸液。
10.根據權利要求8所述的亞麻籽木脂素總糖苷提取物製劑，其特徵在於所述的輔料可選自亞麻油、大豆油、磷脂、澱粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、氯化鈉、維生素E、維生素C、半胱氨酸、亞硫酸鈉中的任意一種或幾種。
11.一種亞麻籽木脂素總糖苷提取物的應用，其特徵在於根據權利要求7所述亞麻籽木脂素總糖苷提取物在製備預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆症、血脂代謝紊亂病症的藥物及保健食品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種從亞麻籽中提取純化木脂素總糖苷的製備方法及其應用。該提取物可由下述方法製得1)提取及鹼水解亞麻籽經榨油得到的亞麻餅粕，或脫殼處理的亞麻籽殼，經低級醇或含水低級醇提取，回收，粗提物鹼水解，中和，過濾；或原料直接用鹼性低級醇或含水低級醇溶液提取，中和，回收，濾過；2)分離濾液上樣於大孔吸附樹脂柱，含水低級醇梯度洗脫，收集35％～60％含水低級醇洗脫液，3)乾燥洗脫液減壓回收至幹，乾燥粉碎得亞麻籽木脂素總糖苷其中木脂素總糖苷含量為60％～85％。本發明得到的亞麻籽木脂素總糖苷提取物，可與藥用輔料混合，製備具有預防和治療婦女更年期的骨質疏鬆、血脂代謝紊亂的藥物和保健食品。
文檔編號A61K9/08GK1749262SQ200510038970
公開日2006年3月22日 申請日期2005年4月20日 優先權日2005年4月20日
發明者汪豪, 熊非, 吳佳俊, 葉文才, 趙守訓 申請人:中國藥科大學