重組人胱抑素c基因及其表達與應用的製作方法
2023-05-21 04:35:21
專利名稱：重組人胱抑素c基因及其表達與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地，涉及一種重組人胱抑素c基 因及其表達與應用。
背景技術：
胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族2中的成 員之一。它的分子量為13kD，是由122個胺基酸組成的低分子量非 糖基化蛋白質(M Abrahamson， et al. Biochemical Journal, 1990.)， 含兩對二硫鍵，且能在所有有核細胞中恆定、持續地轉錄及表達，可 被看做House ke印ing基因(黃君富等，醫學臨床生物化學與檢驗 學分冊)。近來的研究已經發現胱抑素C參與機體許多生理與病理過 程，包括腫瘤的侵潤性生長及轉移、炎症的發生與發展以及組織纖維 化(張耀全，袁發煥等，2003,23(6))等疾病。作為外分泌型蛋白， 它廣泛的存在於腦脊液、血液、唾液及精液等體液中且濃度較高。因 胱抑素C是一種低分子量蛋白質，可經腎小球自由濾過，在近曲小管 被重吸收並降解，腎臟是清除循環中胱抑素C的唯一器官，所以血清 胱抑素C濃度主要由GFR決定，由此可見胱抑素C是一種理想的反映 GFR變化的內源性標誌物(GrubbA， et al， Acta Med Scand， 1985)。 同時有研究報導應用兔抗胱抑素C抗體建立的ELISA技術檢測了急性 心肌梗塞病人急性期、恢復期及正常對照組的血清胱抑素C水平，發 現急性期與恢復期的自身對照並無顯著性差異，但有意義的是這兩者的胱抑素C水平均顯著低於正常對照組(馮建芳等，基礎醫學與臨
床，1995)。提示胱抑素C的血清濃度改變，在一定程度上可以作為 急性心肌梗塞診斷的參考指標。
血清胱抑素C濃度的測定具有重要的診斷意義，但目前我國還沒 有自主研發的胱抑素C診斷試劑。究其原因製備胱抑素C診斷試劑盒 需要特異性強和靈敏性高的抗胱抑素C單克隆抗體,而要得到該單克 隆抗體就必須得到高純度的胱抑素C蛋白，傳統的從胎盤、尿液等組 織中提取的胱抑素C蛋白濃度低，純度差，批間差大無法用做免疫 原製備單抗或製備診斷質控品。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種重組人胱抑素c基因、該
基因表達的重組蛋白及其製備方法，以及該蛋白的應用。
本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是 一種具有SEQ ID NO : 1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。
一種具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。 一種根據SEQ ID NO :1所示核酸序列製備重組可溶人胱抑素C 蛋白的方法，包括下述步驟(1)從新鮮人胎盤中獲得總RNA，用 RT-PCR方法得到截短人胱抑素C的DNA序列；(2)用步驟(1)獲得 的DNA序列與表達質粒重組，重組子經過DNA測序驗證，確定重組表 達質粒的序列和閱讀框均正確；(3)用步驟(2)所獲得的重組表達 質粒轉化表達宿主細胞；(4)培養宿主細胞並從細胞胞質中回收和純 化重組可溶性人胱抑素C蛋白。所述表達載體為能與人胱抑素蛋白的基因序列重組並形成表達 質粒的表達載體，具體地，表達載體為原核表達載體，且該原核表達 載體的融合蛋白標籤可對人胱抑素C蛋白的兩對二硫鍵正確配對起
到促進作用，該原核表達載體可選PET32a(+)。所述的表達宿主細胞 為能夠表達所述重組表達質粒的宿主細胞，且具有校正大腸桿菌密碼 子偏好性的特徵，可選大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)。
本發明不限於特定的表達載體，在一優選實施方案中，本發明使 用原核表達載體，例如PET32a(+)。本發明不限於特定的宿主細胞， 在一優選實施方案中，本發明使用大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)， Rosseta gami II (DE3)購於Merck公司，是MerK公司自己對有特殊 功能的大腸桿菌產品的命名。
所述培養宿主細胞所用的培養基採用含抗生素基礎培養基擴增 培養宿主細胞，參數為培養溫度35。C 37T:，培養時間4 5h;誘 導溫度35-37°C ，誘導時間3 5h;誘導物IPTG終濃度為0. 2 0。 5mM。
篩選宿主細胞中高效表達的陽性表達菌株作為工程菌，重組可溶 性人胱抑素C蛋白通過工程菌誘導培養後離心收集菌體，超聲破碎後 離心取上清經過鎳柱一步純化得到。
一種製備抗人胱抑素C不同表位的系列單克隆抗體或多克隆抗 體的方法，運用按照上述方法製備的重組可溶性人胱抑素C蛋白免疫 實驗動物獲得單克隆抗體或多克隆抗體。通過位點疊加實驗確定抗不 同抗原表位的系列單克隆抗體；所述系列是指大於等於兩株。
一種製備測定人體內人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法，運用上述方法製備的兩株單克隆抗體通過化學交聯劑分別與膠乳交聯後 混合於緩衝液中製備成診斷試劑，其中兩株單克隆抗體摩爾比為1:
所述化學交聯劑為Sulfo-NHS， EDC. HCL。
一種製備人胱抑素C診斷試劑質控品的方法，按照上述方法製備 的重組可溶性人胱抑素C蛋白用保護性緩衝液分別調製到從低到高5 個固定濃度後凍幹製備。
所述從低到高5個固定濃度是指按照上述製備的診斷試劑的檢 測線性範圍而定的濃度。
所述的5個固定濃度分別為0。 5ug/ml; lug/ml; 2ug/ml; 4ug/ml; 8ug/ml
綜上，本發明的有益效果是本發明運用基因工程技術表達純化 大量穩定的重組可溶胱抑素C蛋白並利用該蛋白獲得了一對單抗，進 而製備了穩定的胱抑素C診斷試劑及其質控品。解決了我國人胱抑素 測定試劑盒自主研發的瓶頸問題。
圖1是本發明製備的人胱抑素c診斷試劑的測定結果示意圖，其
中橫軸表示進口試劑1測定進口試劑2校準品的校準值(ug/ml)，縱
軸表示自製試劑測定進口試劑2校準品的校準值(ug/ml);
圖2是重組人胱抑素C蛋白誘導純化電泳圖，其中，M:中分子量
蛋白Marker; 1: IPTG誘導前全菌裂解液；2: IPTG誘導3h後全菌裂解
液；3: Ni柱純化後重組蛋白；圖3是cystatin C重組蛋白Weastern Blot分析的示意圖，其 中，M:預染蛋白Marker;l: cystatin C重組蛋白， 一抗為抗人胱抑 素多抗；2: cystatin C重組蛋白，一抗為抗人血紅蛋白多抗。
具體實施例方式
實施例1:
製備重組可溶人胱抑素C蛋白
(1) 克隆截短胱抑素C基因、構建表達質粒
按照胱抑素C基因DNA序列設計引物，RT-PCR擴增該基因並與 pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 a ， PCR鑑定單克隆確定可能 的陽性質粒，再提取質粒雙酶切鑑定。經過DNA測序證明鹼基及開放 閱讀框正確的陽性質粒用適宜的酶切出與同樣雙酶切的PET32a (+)連 接，構建原核表達質粒，轉化表達宿主菌Rosseta gami II 。 PCR鑑 定陽性宿主菌。上述實驗用質粒載體均為本實驗室保存，表達菌 Rosseta gami II購於Merck公司，總RNA提取試劑盒購於Fermentas 公司，反轉錄試劑盒、限制性內切酶、連接試劑盒購於大連Takara 公司。
(2) 篩選高效表達的陽性表達菌株
接種10株上述陽性菌株與5mlLB+amp中，37°C， 220rpm培養 過夜，第二日按l^接種量接種於新鮮的LB+amp培養基中，37°C， 220rpm培養4一5小時，取lml菌液做未誘導條件下的菌體蛋白對照， 餘下菌液加入終濃度0. 5mM的IPTG， 25°C ， 170rpm誘導培養過夜，取 lml菌液做為誘導後的菌體蛋白對照。誘導前後的細菌菌液離心去上清，菌體分別用100ul的TE緩衝 液重懸，煮沸5min後，SDS—PAGE電泳。考馬斯亮蘭染色，BandScan 分析電泳條帶。誘導後的菌在預測的分子量處有一條濃集的蛋白條 帶，誘導前的菌在相同的分子量處沒有蛋白條帶。經BandScan軟體 分析該目的蛋白佔總蛋白量的20%以上。選表達水平高的菌株為工
程菌株o
誘導後的細菌超聲破碎後離心取上清和沉澱分別進行SDS—PAGE 電泳分析，結果表明重組蛋白是以可溶形式存在於上清中。 (3)工程菌的擴大培養及目的蛋白的純化
按照小量培養的條件擴大培養量，1%的甘油菌接種於20mlLB +&!1^培養基中37。C，220rpm過夜培養，第二日2%接種量接種於1LLB 十amp培養基中37°C ， 220rpm培養4-5h至OD,至0. 5-1, 0，加入IPTG 至終濃度為0.5mM， 37°C， 220rpm誘導培養3-5h，離心收集菌體按 1G菌體加入10ml Loading Buffer (20Mm PBS， 0. 5M NaCl， 30mM咪 唑，PH7.4) 的比例加入Loading Buffer,超聲破碎再次離心取上 清，用0.45uM的濾膜過濾以備純化。
HisTRAP H. P (GE company)柱，用10倍柱體積Loading Buffer 平衡柱子，上述過濾上清直接上柱，上樣後用Loading Buffer洗柱 至OD，吸收值至基線，用Elusion Buffer(20Mm PBS， 0. 5M NaCl， 300mM 咪唑，PH7,4)洗脫，收集洗脫峰，進行SDS-PAGE分析純度，結果顯 示純度達到90%以上，蛋白濃度2_3mg/ml。 6L培養液可得到140 一200mg蛋白。(4)Elisa及Western鑑定重組蛋白抗原性
純化的重組胱抑素C稀釋至10ug/ml後按照Elisa標準操作規 程包板，分別使用抗胱抑素C多克隆抗體及抗人血紅蛋白多克隆抗體 為一抗，使用辣根過氧化物酶標記兔抗人IgG為二抗，結果顯示抗胱 抑素C多抗為一抗的孔板為陽性而抗人血紅蛋白多體為一抗的孔板 為陰性。證明重組胱抑素C免疫特異性高。Western實驗結果與Elisa 結果相同。
實施例2:
製備人胱抑素C診斷試劑
(1) 一對抗不同表位單克隆抗體的製備
純化重組胱抑素C蛋白按照單克隆抗體製備標準操作規程製備 多株抗克隆抗體。通過位點疊加實驗篩選一對抗不同位點的單抗。具 體步驟如下取純化的重組人胱抑素C蛋白稀釋至10ug/ml按照El isa 標準操作規程包數個板(l-N， N為待測單克隆株數)，封閉洗板後加 入第一株單抗至此單抗所對應的抗原位點飽和的濃度(至位點飽和所 需單抗濃度是通過預實驗完成的)，37"C孵育。第1板按普通程序加 入二抗並顯色，記錄下板孔0D值0DL同時第2板洗滌後加入第二株單 抗，第3板洗滌後加入第三株單抗…第N板洗滌後加入第N株單抗， 再次37X:孵育，按程序加入二抗後顯色，板孔0D"直與0D!進行比較， OD值差別超過臨界點的單抗確定為與第一株單抗抗不同抗原位點者。 按照上述方法篩選獲得了兩株抗不同位點的單抗，分別命名為d， Q 。
(2) 單克隆抗體致敏膠乳膠乳與EDC.HCL、 Sulfo-NHS按照一定比例混合於活化緩衝液 (0, 1M MES, 0. 15M NaCl，PH5. 0)中，15min後加入淬滅劑離心收集 膠乳，重懸於致敏緩衝液(O. 1M pBS，O. 5M NaCl,ra 7.2)中加入適量 混合單抗(單抗一與單抗二按摩爾比1: 1混合)反應lh.反應液加 入終濃度1腿SA封閉過夜。離心收集致敏好的膠乳重懸於反應緩衝液 (0. 2M NH4C1， 0. 1M NaCl， 0. 2%。PEG20000， PH8. 4)中即為人胱抑素C 診斷試劑R2。
(3)試劑測定結果
通過自製試劑，進口試劑1分別測定進口試劑2配套校準品得到 校準值。結果顯示自製試劑與進口試劑1校準值相關係數達到 0.9997 ，參見圖1所示。
實施例3:
製備人胱抑素C診斷質控品
取濃縮重組人胱抑素蛋白用保護緩衝液(0. 02M碳酸鹽緩衝液， 20%丙三醇，0. 8%蔗糖，0. 5%BSA， 0. 2X。NaN3)稀釋成8ug/ml， 4 ug/ml， 2 ug/ml, 1 ug/ml，0.5 ug/ml等五個濃度，凍幹後即製成人胱抑素C診 斷質控品。序列表
〈110>四川省邁克科技有限責任公司 重組人胱抑素C基因及其表達與應用 <130〉重組人胱抑素C基因及其表達與應用
<160〉 2
Patentln version 3. 3
1
394
DNA
〈213> 人
1
ggatcctccagtcccggcaagccgccgcgcCtggtggg3ggccccatggacgccagcgtg60
gtgtgcggcgtgC3Ctgg3Ctttgccgtcggcgagtacaacaaagccagc120
accacagccgcgcgctgcaggtggtgcgcgcccgcaagcaigatcgtagct180
ggggtgaactacttcttggacgtggagctgggccgaaccacgtgtaccaagacccagccc240
肌cttggacaactgccccttccatgaccag ccscatctga aa兆ga^agcattctgctct300
ttccagatctacgctgtgccttggcagggcacaatgaccttgtcgaaatccacctgtcag360
g3CgCCt3ggggtctgtaccgggctggcctgtgc394
〈210〉 2
〈211> 122
PRT
人
2
Gly Ser Ser Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met
15 10 15
Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala
20 25 30
Val Gly Glu Tyx Asn Lys Ala Ser Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala 35 40 45Leu Gin Val Val Arg Ala Arg Lys Gin lie Val Ala Gly Val Asn Tyr
50 55 60
Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gin Pro 65 70 75 80
Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His Asp Gin Pro His Leu Lys Arg Lys
85 90 95
Ala Phe Cys Ser Phe Gin lie Tyr Ala Val Pro Trp Gin Gly Thr Met
100 105 110
Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gin Asp Ala 115 120
權利要求
1、一種具有SEQ ID NO1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。
2、 一種具有SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。
3、 一種根據權利要求1所述核酸序列製備重組可溶人胱抑素C 蛋白的方法，其特徵在於，包括下述步驟(1) 從新鮮人胎盤中獲得總RNA，用RT-PCR方法得到SEQ ID NO : 1所示的截短人胱抑素C基因序列；(2) 用步驟(1)獲得的截短人胱抑素C基因序列與表達質粒重 組，重組子經過DNA測序驗證，確定重組表達質粒的序列和閱讀框均 正確；(3) 用步驟(2)所獲得的重組表達質粒轉化表達宿主細胞；(4) 培養宿主細胞並從細胞胞質中回收和純化重組可溶性人胱 抑素C蛋白。
4、 根據權利要求3所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特徵在於所述表達載體為原核表達載體，且該原核表達載體的融 合蛋白標籤可對人胱抑素C蛋白的兩對二硫鍵正確配對起到促進作 用。
5、 根據權利要求4所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特徵在於所述原核表達載體為PET32a(+)。
6、 根據權利要求3所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特徵在於所述的表達宿主細胞為能夠表達所述重組表達質粒的宿 主細胞，且具有校正大腸桿菌密碼子偏好性的特徵。
7、 根據權利要求6所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法，其特徵在於所述的表達宿主細胞為大腸桿菌Rosseta gami II (DE3)。
8、 根據權利要求3所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特徵在於所述培養宿主細胞所用的培養基採用含抗生素基礎培養 基擴增培養宿主細胞，參數為培養溫度35'C 37'C，培養時間4 5h;誘導溫度35-37°C，誘導時間3 5h;誘導物IPTG終濃度為0. 2 0. 5mM。
9、 根據權利要求3所述的製備重組可溶人胱抑素C蛋白的方法， 其特徵在於篩選宿主細胞中高效表達的陽性表達菌株作為工程菌， 重組可溶性人胱抑素C蛋白通過工程菌誘導培養後離心收集菌體，超 聲破碎後離心取上清經過鎳柱一步純化得到。
10、 一種製備抗人胱抑素C不同表位的系列單克隆抗體或多克隆 抗體的方法，其特徵在於運用按照權利要求3所述製備的重組可溶 性人胱抑素C蛋白免疫實驗動物獲得單克隆抗體或多克隆抗體，通過 位點疊加實驗確定抗不同抗原表位的系列單克隆抗體；所述系列是指 大於等於兩株。
11、 一種製備測定人體內人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法， 其特徵在於運用權利要求10所製備的兩株單克隆抗體通過化學交 聯劑分別與膠乳交聯後混合於緩衝液中製備成診斷試劑，其中兩株單克隆抗體摩爾比為l: 1。
12、 根據權利要求11所述製備測定人體內人胱抑素C蛋白濃度診斷試劑的方法，其特徵在於所述化學交聯劑為Sulfo-NHS， EDC, HCL。
13、 一種製備人胱抑素C診斷試劑質控品的方法，其特徵在於 按照權利要求3所述製備的重組可溶性人胱抑素C蛋白用保護性緩衝 液分別調製到從低到高5個固定濃度後凍幹製備。
14、 根據權利要求13所述製備人胱抑素C診斷試劑質控品的方 法，其特徵在於所述從低到高5個固定濃度是指按照權利要求11 製備的診斷試劑的檢測線性範圍而定的濃度，所述5個固定濃度分別 為O. 5ug/ml; lug/ml; 2ug/ml; 4ug/ml; 8ug/ml。
全文摘要
本發明公開了一種重組人胱抑素C基因及其表達與應用。該截短人胱抑素C基因具有SEQ ID NO1所示核酸序列；截短人胱抑素C蛋白具有SEQ ID NO2所示胺基酸序列。本發明運用基因工程技術表達純化大量穩定的重組可溶胱抑素C蛋白並利用該蛋白獲得了一對單抗，進而製備了穩定的胱抑素C診斷試劑及其質控品。解決了我國人胱抑素測定試劑盒自主研發的瓶頸問題。
文檔編號C12N15/12GK101413001SQ20081014771
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者丹 吳, 周文娟, 堃 喻, 王保寧, 丹 陳 申請人:四川省邁克科技有限責任公司