一種植物DNA的簡便、快速提取方法與流程

2023-05-21 06:03:56 1

本發明公布了一種植物dna的簡便、快速提取方法，屬於分子生物學領域。本發明極大地簡化了植物dna提取方法，該方法簡便、快速、穩定性好，可廣泛應用於提取分子鑑定所需的各種植物葉片dna。
背景技術：
：隨著水稻、玉米、小麥等主要農作物全基因組測序的完成，這些經濟作物的分子標記開發難度明顯下降，利用分子標記進行輔助育種、品種鑑定開始被應用到實際生產之中。但分子鑑定和表觀鑑定不同，必須通過dna提取和鑑定等一系列程序，故而進行大樣本篩選時，工作量極大，急需適應高通量篩選要求的方法體系，而這其中最需要優化的就是dna的提取過程。現有dna提取方法十六烷基三甲基溴化銨(ctab)法(doyleetal.arapiddnaisolationprocedureforsmallquantitiesoffrexhleaftissue.phytochembull.1987,19:11-15.)，需經過研磨、裂解、氯仿抽提、離心、沉澱和清洗等步驟，整個流程需要兩小時，可同時操作二十個樣品，平均耗時約六分鐘，需要用去汙劑ctab、有毒有害的有機溶劑氯仿及大量的乙醇，其間需將樣品轉管三次，提取效率低，而且對操作的專業程度、細心程度要求較高，不適合高通量操作；現在應用於高通量dna提取的dna提取工作站(餘婧等.自動化工作站批量提取烤後菸葉dna方法的建立與應用.貴州農業科學.2015,5:217-219.)，雖然簡單便捷，但是需要昂貴的設備、專用試劑，對實驗人員的操作要求也比較高；而直接pcr法(rogersetal.directpcramplificationfromleafdiscs.plantsci.1999,143:183-186.)雖然可以省去dna提取的步驟，但是材料用量對實驗結果有顯著影響，穩定性難以保證，需要使用擴增效果更好也更加昂貴的酶以及pcr增強試劑，而且每次取樣僅能用於一次pcr擴增。所以急需開發一種操作簡單方便，穩定性好，不需要特殊設備儀器，也不需使用有毒有害或者昂貴試劑，可大批量同時處理的新dna提取方法。本發明公布了一種植物dna的簡便提取方法，使用三羥甲基氨基甲烷(tris)為dna樣品提供良好的緩衝條件，保證dna的穩定性；使用乙二胺四乙酸(edta)抑制dna酶活性，防止細胞破碎後細胞中的dna酶對dna進行降解；高溫加熱，不僅能裂解植物細胞，釋放dna，還能滅活植物細胞釋放的各種酶類和附著在植物樣品上的微生物；高速離心能夠去除非水溶性的細胞碎片等雜質。由於提取物中所添加的較高濃度的edta會抑制taqdna聚合酶的活性，所以在後續的pcr過程中需要增加相應濃度的鎂離子，以中和過多的edta，保證pcr正常進行。操作周期約20分鐘，批量處理時可達到每人每分鐘處理一個樣品。只需要edta和tris，後續擴增只需要使用普通的taqdna聚合酶。提取每一個樣品，試劑成本不到0.01元人民幣，而且一次提取可用於多次pcr擴增。其間不需要轉管等操作，減少了人為失誤。不需要特殊的儀器設備，沒有太多的操作要求，這將極大的節約人力和材料成本。本發明在遺傳作圖、分子標記輔助育種、品種純度檢測、品種的真實性鑑定等領域具有重要的應用價值。技術實現要素：本發明的目的在於公布一種植物葉片基因組dna提取方法，所述的dna提取方法可滿足分子標記篩選的dna模板需要，且省時、操作容易、設備要求低、成本低、安全無毒無汙染。技術方案：一種植物dna的簡便、快速提取方法，按照下述步驟進行：(1)剪取1～2cm2植物葉片置於離心管中，用研磨棒快速研磨得到勻漿；(2)向所述植物勻漿中加入提取液，70～90℃加熱10～15分鐘，再經過10000～13000r/min離心1分鐘，即得到可直接用於pcr的dna提取物。所述提取液由tris溶液和edta溶液組成，其中tris和edta的含量分別為20～50mm和13～25mm，ph8.0。所述tris溶液配製方法如下：0.5mtris-hcl(200ml)：稱取60.55gtris，溶於100ml蒸餾水中，再用濃鹽酸調至ph8.0，定容至200ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。所述edta溶液配製方法如下：(2)0.5medta(200ml)：稱取29.2gedta溶於100ml蒸餾水中，再用10mnaoh調至ph8.0，定容至200ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。所述提取液配製方法如下：提取液(100ml)：10ml0.5mtris(ph8.0)，5ml0.5medta(ph8.0)，定容至100ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)；低溫(4℃)儲存。優選的，如上所述的植物葉片基因組dna提取方法，所述提取液的體積為所述植物勻漿體積的10～20倍。優選的，如上所述的植物葉片基因組dna提取方法，所述提取液中tris的濃度為25～50mm，edta的濃度為13～25mm；優選的，如上所述的植物葉片基因組dna提取方法，所述加熱溫度為70～90℃，加熱時間為10～15分鐘；優選的，如上所述的植物葉片基因組dna提取方法，所述離心轉速為10000～13000r/min離心時間1分鐘；本發明中離心的速度經過優選，所需時間更短，dna模板質量相同。若離心速度過小，則不利於雜質的沉澱；優選的，如上所述的植物葉片基因組dna提取方法，在作為dna模板進行pcr的時候，補加的鎂離子的量為25～30mm。當遇到如田間取樣等不能及時對樣品進行處理的情況時，可現在1.5ml的離心管中加入200μl的提取液，採樣時將葉片一端插入提取液中避光儲存，使用時再研磨加熱離心即可，條件不變。有益效果：(1)簡便、快速、成本低、穩定性高、安全無汙染。本發明提取dna時僅需edta和tris兩種常用試劑，價格也相對低廉，易保存，且不需要使用氯仿等有機試劑，安全性高。利用高溫加熱使蛋白質變性，同時可以起到滅菌的效果。本發明提出的方法操作簡便、快速，不需要轉管等操作，減少了人為失誤，也不需要特殊的儀器設備，這將極大地節約人力、成本。所獲的dna提取物穩定性高，在低溫下(如4℃)存放五個月仍能正常使用。(2)能夠實現高通量操作。鑑於本發明公布的dna提取方法具有簡便、快速、低成本、高穩定性的優點，在遺傳作圖、分子標記輔助育種、品種純度檢測、品種的真實性鑑定等領域可實現高通量操作。(3)適用性廣本發明適用於小麥、大麥、玉米、番茄和水稻等經濟作物，以及擬南芥等模式植物，其中有單子葉，也有雙子葉植物，其他植物雖然沒有一一進行試驗驗證，但是已經可以說明本發明也可以運用於許多植物dna的提取。附圖說明為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1：小麥dna的pcr產物電泳檢測圖。m：dnamarkerdl2000，1～3泳道：提取完成後立即進行pcr的產物，4～6泳道：提取完成後置於4℃條件下儲存五個月後再以相同條件進行pcr的產物。圖2：簇毛麥、水稻、擬南芥、油菜、番茄和玉米dna的pcr產物電泳檢測圖。m：dnamarkerdl2000，1～5泳道：簇毛麥pcr產物，6～10泳道：水稻pcr產物，11～15泳道：擬南芥pcr產物，16～20泳道：油菜pcr產物，21～25泳道：番茄pcr產物，26～30泳道：玉米pcr產物。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。實施例11、dna提取液的配製(1)0.5mtris-hcl(200ml)：稱取60.55gtris，溶於100ml蒸餾水中，再用濃鹽酸調至ph8.0，定容至200ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。(2)0.5medta(200ml)：稱取29.2gedta溶於100ml蒸餾水中，再用10mnaoh調至ph8.0，定容至200ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。(3)提取液(100ml)：10ml0.5mtris(ph8.0)，5ml0.5medta(ph8.0)，定容至100ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。2、dna的提取(1)取小麥新鮮葉片約1～2cm2於滅過菌的1.5ml離心管中，用研磨棒研磨成勻漿狀。加入200μl提取液，混勻。90℃加熱15分鐘。室溫下13000r/min離心1分鐘，上清液即用作pcr中dna模板使用，於低溫(4℃)條件下儲存。3、pcr擴增pcr反應體系：1×pcr緩衝液(無mg2+)，2.7mmmgcl2，0.2mmdntp，2μm引物，1utaqdna聚合酶(5u/μl)，1μldna提取物。其中，所用引物p1～p2見表1。pcr反應程序：①94℃3min；②94℃20s；③60℃30s；④72℃40s；⑤重複②③④進行35個循環；⑥72℃5min；⑦4℃保存。表1引物信息(f：正向引物；r：反向引物)引物名稱引物序列(5』→3』)dna模板來源p1f:gccattatagtcaagagtgcactagctgt小麥p2r:agctcctctcgttctccaatgctp3f:gtgttcaagggaaaggctgcact簇毛麥，水稻p4r:acttcagtaggtgacagagcaaagagp5f:gtgttcaagggaaaggctgcact玉米p6r:ggattcagcaggcccaagactp7f:ggttccaaagacagctccgagt擬南芥p8r:tgtgacaggaaccacaaaatagtcap9f:ggtccccaggacagctctgagt油菜p10r:agacaggaaccacaatacggtcap11f:gtatggggaccagagattcttctga番茄p12r:gtgacaggaacagtaaaccgatca4、電泳檢測採用6％聚丙烯醯胺凝膠電泳(page)，硝酸銀染色，觀察。結果表明，使用本發明提取的dna為模板，pcr產物條帶清晰，反應可重複性高，低溫長期儲存穩定性高(見圖1)。5、簇毛麥、水稻、擬南芥、油菜、番茄、玉米dna提取與pcr檢測分別取簇毛麥、水稻、擬南芥、油菜、番茄、玉米的新鮮葉片約1cm2於滅過菌的1.5ml離心管中，用研磨棒研磨成勻漿狀。加入200μl提取液，混勻。70～90℃加熱15分鐘。室溫下13000r/min離心1分鐘，上清液即用作pcr中dna模板使用。同上一步驟描述進行pcr檢驗。其中，所用引物p3～p12見表1。pcr反應產物採用6％聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析，結果如圖2所示。簇毛麥、水稻pcr產物片段約1500bp，擬南芥pcr產物片段約490bp，油菜pcr產物片段約480bp、490bp，番茄pcr產物片段約700bp，玉米pcr產物片段約350bp、850bp，條帶都很清晰，反應的可重複性高。由此可見，本發明公布的方法可廣泛應用於簇毛麥、水稻、擬南芥、油菜、番茄、玉米等植物等dna的提取及分子鑑定。綜上所述，本方法具有樣品用量少、簡便、快速，對設備要求低，穩定性好，應用範圍廣等優點，可應用於大規模品種鑑定，分子標記輔助育種，遺傳分析等領域。當前第1頁12