一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法

2023-05-20 16:02:51

專利名稱：一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物產氫方法，具體涉及一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法。
背景技術：
目前世界上氫的年產量在3600萬噸以上，主要來自化石燃料、生物質和水，主要是採用傳統的物理化學方法如水電解、天然氣催化重整和熱裂解、煤炭氣化、石油腦的部分氧化等製取氫氣，傳統的制氫方法實質上是以消耗大量化石能源為代價換取氫能，淨增能值低，經濟適用性不強，同時對環境產生汙染。運用光電技術和電解技術結合的方法也可以製取氫氣，用太陽能光伏電池或太陽能熱收集器能產生較高的轉化效率，但由於地球表面太陽能輻射率僅為1kW·m-2，因此需要建造巨大的面積以收集足夠多的能量，這明顯限制了其商業運用，同時這種方法的最不利條件是需要非常高的投資成本和高技術要求，從而在技術方面阻礙了其在欠發達國家和地區對太陽光的運用。而利用微生物法製取氫氣具有許多優點使用豐富的可再生資源微生物和水為原料，直接或間接利用地球上最經濟和最清潔的能源太陽光，能治理環境汙染，保護環境，經濟適用性強，生產安全，設備簡單，操作方便，不需消耗大量的能量，成本低、投資省，光合產氫微生物種類繁多，利用前景廣闊，易於普遍推廣應用。因此利用微生物法製取氫氣已成為可再生能源利用和開發領域的研究熱點。
目前利用太陽能制氫的方法有太陽能熱分解水制氫、太陽能發電電解水制氫、陽光催化光解水制氫、太陽能生物制氫等等，其中以太陽能生物制氫具有最廣闊的前景。
在太陽能光生物制氫技術中光合細菌因能分解有機物質，轉化和利用太陽光能為氫能而具有獨特的優勢，即在光能的驅動下以有機物為原料，分解有機物獲得氫氣，屬於光能異養型。在微生物產氫系統中，光合細菌制氫被認為是最有前途的微生物產氫方法，這是由於(1)光合細菌制氫具有高的理論光氫轉化量；(2)不產生O2，避免了O2造成的微生物失活問題；(3)光能利用中的光譜範圍寬；(4)具有消耗廢水處理過程中排放的有機底物的能力，實現了有機廢物的綜合利用和環境保護的目的，因此這對可再生能源的開發和可持續發展戰略的實現將是很有前途的處理技術。國外文獻報導光合細菌產氫速率一般為0.00518-1.58mg·h-1·l-1，這類光合細菌產氫效率仍然較低。
目前沒有專門培養產氫光合細菌方法的文獻報導，同時在光合細菌篩選方面更多的文獻資料集中於光合細菌的增殖培養及擴大培養，得到的是含有雜菌的光合細菌培養液，而篩選得到的光合細菌更多的是僅僅用於飼料或蛋白質的生產或汙水處理，沒有將有機廢棄物處理與能源化緊密聯繫起來，部分資料報導對光合細菌的篩選是採用厭氧培養箱，但這種方法僅僅提供厭氧條件，而沒有同時提供光能，因此不能保證獲得的光合細菌具有較高的產氫能力。

發明內容
本發明的目的是提供一種產氫效率高、利用沼澤紅假單胞菌在厭氧和光照條件下分解有機物質產生氫氣的方法。
一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，採用如下步驟進行(1)製備液體培養基，將液體培養基放入高壓滅菌鍋內滅菌12-15分鐘，取出培養基冷卻至常溫，並將液體培養基分別裝入種子擴大培養反應器和光生物制氫反應器中待用；其中，液體培養基的初始pH範圍為4.5-8.8，有機底物的濃度範圍為1.98g/l-45g/l；(2)沼澤紅假單胞菌菌種的擴大培養用接種針挑取固體雙層平板培養基上生長的沼澤紅假單胞菌落接種於滅菌冷卻後的液體培養基中；在盛裝該液體培養基的種子擴大培養反應器中充入氬氣排除空氣，形成厭氧環境，並將接種後的液體培養基置於25℃-35℃，日光燈為光源，光照度為1500lx-8000lx的光照恆溫培養箱中靜置培養36-96小時，得到後續產氫過程中所用的擴大培養液；(3)沼澤紅假單胞菌的光生物制氫將沼澤紅假單胞菌擴大培養液按培養基量的8％-18％接種到光生物制氫反應器盛裝的液體培養基中，並在光生物制氫反應器內充入氬氣獲得厭氧環境，以日光燈或LED燈為光源，光照度為2000lx-5000lx，培養溫度為20℃-35℃，靜置恆溫光照培養10小時-15小時後沼澤紅假單胞菌開始產生氫氣。
其中，所述液體培養基的最佳初始pH範圍取6.0-8.5。
其中，所述液體培養基的最佳有機底物的濃度範圍為11.880g/l-27.72g/l。
其中，所述液體培養基成分是有機底物11.880g/l-27.72g/l；K2HPO4·3H2O0.3g/l-1.56g/l；KH2PO40.22g/l-10.89g/l；NH4Cl0.677g/l-2.35g/l；
CaCl20.002g/l-0.26g/l；FeSO4·7H2O0.005g/l-0.417g/lZnSO40.0001g/l-0.02g/l；MgSO4·7H2O0.02g/l-0.5g/l；NaCl0.1g/l-1.5g/l；CuSO40.001g/l-0.04g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.0001g/l-0.002g/l；VB20.00001g/l -0.00025g/l；煙酸0.00001g/l-0.0002g/l；牛肉膏0.5g/l-4.0g/l；水1000ml；pH值6.0-8.5在上述成分中，一些鐵、鈣和鎂等對光合細菌產氫具有較大的促進作用，同時濃度為0.002g/l-0.26g/l的鈣鹽可在一定程度上提高本菌種的生長能力和維持細胞活性存在，但這類無機鹽濃度必須遵循本培養基配方嚴格的限制，否則將影響產氫光合細菌的生長和產氫能力。另外，由於該菌種缺乏自身合成生長因子的能力，因此在培養基中需要適當補充生長因子如生物素、煙酸和牛肉膏等。
本發明所述的技術方案與現有光合細菌光生物制氫技術相比具有獨特的優勢，制氫效率高、成本低，與國內外同類光合細菌菌種比較該菌種在特定條件下的產氫能力處於前列，其次，沼澤紅假單胞菌在環境保護方面具有廣闊的應用潛力，本發明所述的沼澤紅假單胞菌能分解有機物和厭氧發酵液中的各種有機酸，研究發現該菌種對有機物質的分解和利用率最高可達到100％，特別適合分解和利用厭氧發酵後的有機廢水，進一步降低廢液中的有機物含量，充分利用了生物質能，實現了化害為寶，保護環境的目的，因此在環境保護和實現資源的可持續利用方面具有廣闊的應用前景和社會價值。


圖1是底物濃度對沼澤紅假單胞菌產氫量的影響曲線圖2.是培養基初始pH值對沼澤紅假單胞菌產氫行為的影響曲線圖3培養基Fe2+對沼澤紅假單胞菌產氫行為的影響曲線圖4溫度變化對沼澤紅假單胞菌產氫行為的影響曲線圖5光照強度對沼澤紅假單胞菌產氫行為的影響曲線具體實施方式
實施例1沼澤紅假單胞菌的培養(1)採集菌源採集農田、汙水溝等的上表層淤泥為菌源，靜置5小時，收集上清液；顯微鏡下初步鏡檢微生物的種類和數量分布，發現有大量的其它雜菌，如念珠藻菌、綠藻等，光合細菌數量很少；(2)具有產氫行為的沼澤紅假單胞菌菌株的增殖培養取上述上清液70ml分別倒入250ml的三角瓶中，同時加入30ml滅菌的新鮮培養基於瓶中，將上清液和新鮮培養基搖勻，並充入氬氣排除空氣，進行靜置厭氧培養，菌種培養中以日光燈為光源，光照度為3000勒克斯(lx)，培養溫度為30℃，培養10天，培養液顏色逐漸變紫紅，在培養瓶壁上有紅色菌吸附生長；(3)具有產氫行為的沼澤紅假單胞菌菌株的富集培養取上述培養液的中下層液體40ml於滅菌的乾淨培養瓶中，再加入40ml的已滅菌的新鮮培養基，將培養液和新鮮培養基搖勻充入氬氣創造厭氧環境，將培養瓶置於恆溫培養箱中，以日光燈或LED燈為光源，光照度為4000勒克斯，培養溫度為30℃，再次光照靜置轉化培養，培養1天後觀察到培養瓶中溶液變渾濁，培養3天後顯微鏡觀察到活菌鹼性美藍染色後，進行顯微鏡鏡檢，發現念珠藻菌株消失，含大量的長杆形非運動性細菌(革蘭氏染色不明顯)和部分長絲狀的多細胞連接的細菌(革蘭氏染色陽性)，觀察到少量的運動性、細胞呈橢園形的細菌，還含有部分球形、細胞形態很小的細菌(革蘭氏染色為陰性)，還具有少量的能快速彎曲變形運動的細菌；在第7天後觀察到大量的具有運動性、細胞呈橢圓形，革蘭氏染色為陰性的細菌出現，其它菌的數量明顯減少。再取中下層的紅色培養液重複本步驟3次，光學顯微鏡下觀察到大量的優勢菌種為短杆形或紅色橢圓形細菌；(4)具有產氫行為的沼澤紅假單胞菌菌株富集培養液的梯度稀釋液的製備取步驟(3)得到的富集培養液用滅菌的蒸餾水按10-1-10-9級數進行稀釋，分別得到稀釋倍數為10-1、10-2、......10-10的梯度稀釋液；(5)具有產氫行為的沼澤紅假單胞菌菌株的分離純化採用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養基為菌種的生長繁殖提供厭氧環境；首先在無菌的培養皿中製作下層基礎營養固體平板培養基，待下層基礎營養固體平板培養基冷卻後分別在各固體平板培養基上接種步驟(4)得到的富集培養液的10-3-10-10梯度稀釋液，將固體平板培養基表面放置15分鐘，倒入40℃左右的僅含瓊脂且含量為1.8％的上層覆蓋液，蓋上培養皿皿蓋，放置冷卻至上層瓊脂覆蓋液完全凝固，再將培養皿置於30℃，光照度為5000lx的光照恆溫培養箱中光照培養8天；長出菌落後，挑選生長快，菌落形態單一而大、菌落顏色為紅色者為目的菌種，(6)挑取步驟(5)得到的目的菌種，按步驟(4)的方法進行稀釋，再按步驟(5)的方法重複進行3次分離純化，直到到生長的菌落形態一致，菌落顏色為紫紅色，光學顯微鏡下觀察到細胞形態均為橢圓形，即判定得到純菌種；該菌種菌落表面溼潤，極易挑取，細胞易分散，且革蘭氏染色為陰性，細胞運動性強，電鏡下可見細胞表面分泌有大量的粘液；鞭毛多而長，周生，直徑為100-200μm，長約4.0μm左右，寬約2.5μm左右；該菌種經生理生化分析和16SrRNA比對，鑑定該菌種屬於紅螺菌目、紅螺菌科、紅假單胞菌屬、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，並命名為Rhodopseudomonas palustris CQK 01。
其中，培養基的組成如下K2HPO4·3H2O濃度1.2g/l；MgSO4·7H2O濃度0.5g/l；KH2PO4濃度0.6g/l；FeSO4·7H2O濃度0.05g/l；C6H12O6·H2O濃度6.012g/l；(NH4)6Mo7O24·4H2O濃度0.0005g/l；NaCl濃度1.5g/l；CaCl2濃度0.015g/l；NH4Cl濃度1.5g/l；生長因子溶液濃度3ml/l；ZnSO4·7H2O濃度0.002g/l；實施例2(1)光生物制氫反應器的製做選用透明的有機玻璃為光生物制氫反應器材料，板厚0.8cm，反應器長10cm，寬5cm，高10cm，反應器為長方體結構，反應器總容積500ml，在反應器頂部左右兩側各開一個孔，用於充入氬氣和排放空氣，在反應器靠近底部部位開一個孔，用於液體取樣和排液，每個孔用轉接頭與外部連接，其中排氣孔與外部氣體收集裝置連接用於收集氫氣，反應器除必須的開孔外應不漏氣和漏液；(2)產氫液體培養基配方的配製葡萄糖7.92g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；
KH2PO40.38g/l；NH4Cl1.99g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO40.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；NaCl1.0g/l；CuSO40.03g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.00075g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.00002g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；生長因子溶液2ml；調節液體培養基的初始pH值為8.0(3)將液體培養基放入高壓滅菌鍋內滅菌15分鐘，取出培養基冷卻至常溫，並將液體培養基分別裝入種子擴大培養反應器和光生物制氫反應器中待用；(4)沼澤紅假單胞菌菌種的擴大培養用接種針挑取實施例1得到的在固體雙層平板培養基上生長的沼澤紅假單胞菌落接種於滅菌冷卻後的液體培養基中；在盛裝該液體培養基的種子擴大培養反應器中充入氬氣排除空氣，形成厭氧環境，並將接種後的培養基置於25℃-35℃，日光燈為光源，光照度為1500lx-8000lx的光照恆溫培養箱中靜置培養36-96小時，得到後續產氫過程中所用的擴大培養液；(5)沼澤紅假單胞菌的光生物產氫將沼澤紅假單胞菌擴大培養液按培養基量的8％-18％接種到用光生物制氫反應器盛裝的滅菌冷卻後的液體培養基中，並在光生物制氫反應器內充入氬氣獲得厭氧環境，以日光燈或LED燈為光源，光照度為5000lx，培養溫度為30℃，靜置恆溫光照培養；培養期間定時檢測產氫狀況，發現在接種培養後第12h光合細菌開始產氫，產氫速率為0.6731ml·h-1·l-1，此時生物量(乾重)為0.019g·l-1，當培養至第44h時，產氫速率達最大，為5.432ml·h-1·l-1，此時0.23g·l-1。此後產氫速率逐漸下降，當培養至第105h，產氫基本停止，生物量減少為0.14g·l-1，在連續105h培養中共獲得364mlH2。
實施例3(1)液體培養基配製取葡萄糖19.8g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.38g/l；NH4Cl1.99g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0834g/l；ZnSO40.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；NaCl1.0g/l；CuSO40.03g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.00075g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.00002g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；生長因子溶液2ml；調節液體培養基的初始pH值為8.0其他條件和步驟與實施例2相同，發現在接種培養後第12h沼澤紅假單胞菌開始產氫，產氫速率為0.5376ml·h-1·l-1，此時生物量(乾重)為0.037g·l-1，當培養至第23h時，產氫速率達最大，為14.0672ml·h-1·l-1，此時生物量為0.28g·l-1。此後至第64h產氫速率基本維持在10.976-14.224ml·h-1·l-1之間，之後產氫速率逐漸下降，當培養至第120h，產氫仍繼續為0.645ml·h-1·l-1，生物量略減少為0.12g·l-1，在連續120h的培養中共獲得626.08mlH2。
對比實施例2和3發現，底物濃度對該菌種的產氫影響很大，適當的高底物濃度有助於提高該菌種的產氫性能。通過實驗發現沼澤紅假單胞菌能利用有機底物的濃度範圍為1.98-35.64g/l(以葡萄糖為例)，其中適宜底物濃度範圍為11.880g/l-27.72g/l。圖1表示在特定培養條件下底物濃度對沼澤紅假單胞菌產氫性能的影響。當底物濃度低於5.94g/l時，光合細菌產氫量很低，在連續培養62h後，培養液即變成紅色，產氫完全停止。當底物濃度高於23.76g/l時，產氫過程受到抑制，濃度越高抑制作用越強。
實施例4(1)液體培養基配製取葡萄糖3.96g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.38g/l；NH4Cl1.99g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.00695g/l；ZnSO40.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；NaCl0.1g/l-1.5g/l；CuSO40.03g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.00075g/l；CuSO40.03g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.00002g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；生長因子溶液2ml；在兩個相同的光生物制氫反應器中各裝0.31上述培養基，分別調節液體培養基的初始pH值為8.0，5.0；以下步驟和條件與實施例2相同，發現培養基初始pH值為5.0時，在接種培養後第12h光合細菌產氫速率為1.08ml·h-1·l-1，當培養至第60h時，產氫完全停止，共獲得24.5ml H2，當培養基初始pH值為8.0時，在接種後第12h產氫速率1.64ml·h-1·l-1，在連續120h培養中共獲得33.2ml H2。
由此認為，培養液pH值對該菌種的產氫影響較大，當pH值為8.0時其產氫能力較pH值為5.0的高許多。
圖2示出了培養基初始pH值對產氫性能的影響，由圖2可知，當初始pH為7、8、9時，沼澤紅假單胞菌的產氫能力較強，特別是pH值略偏鹼性為8時，沼澤紅假單胞菌的產氫能力達到最大，因此有利於沼澤紅假單胞菌產氫和生長的適宜pH範圍為6.0-8.5，同時在實驗中發現當pH過於偏酸，培養液中出現大量的死菌，當pH值為9時，菌種生長較快，但隨後培養液中很快出現大量死菌，極大地影響本菌種的產氫能力。
實施例5(1)液體培養基配製取葡萄糖3.96g/l；K2HPO4·3H2O0.6g/l；KH2PO40.38g/l；NH4Cl1.99g/l；CaCl20.1g/l；FeSO4·7H2O0.0417g/l；ZnSO40.0005g/l；MgSO4·7H2O0.05g/l；NaCl0.1g/l-1.5g/l；CuSO40.03g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.00075g/l；CuSO40.03g/l；VB20.00002g/l；煙酸0.00002g/l；牛肉膏3g/l；水1000ml；生長因子溶液2ml；調節液體培養基的初始pH值為8.0；以下步驟和條件與實施例2相同，將接種後的培養液按上述條件連續培養5天，期間定時檢測產氫狀況，發現在接種培養後第12h光合細菌開始產氫，產氫速率為0.616ml·h-1·l-1，此時生物量(乾重)為0.012g·l-1，當培養至第24h時，產氫速率達最大，為5.219ml·h-1·l-1，此時生物量為0.15g·l-1。此後產氫速率逐漸下降，當培養至第120h，產氫基本停止，共獲得37.3ml H2。
比較實施例4和5發現，在相同的其它培養條件下鐵離子濃度對光合細菌的產氫影響很大，當鐵離子濃度為0.0417g/l(即0.15mmol/l)時，產氫能力明顯比濃度為0.00695g/l(即0.025mmol/l)的高。同時生物量生長也較高。
圖3示出了培養基Fe2+對產氫性能的影響，由圖3可知，本菌種代謝中對Fe2+需求量大，當Fe2+達0.15mmol/l時產氫量最高。
在實施例2、實施例3、實施例4和實施例5中，可以將葡萄糖改為乙酸鈉或酒石酸鈉或丙酸鈉等有機物。
另外本發明人還通過實驗得到了在確定的培養基組成及含量相同條件下圖4所示的溫度變化對產氫代謝的影響曲線和圖5所示的光照強度對產氫性能的影響曲線；溫度主要是影響光合細菌產氫代謝中酶催化活性。由圖4表示在特定培養基配方下溫度對沼澤紅假單胞菌產氫性能的影響，由此可知溫度為25℃時，本菌種產氫能力最佳，溫度低於或高於25℃時，光合細菌產氫量皆呈下降趨勢，但實際應用中還需考慮菌種產氫代謝速率，表明本菌種的生長溫度範圍為10℃-43℃，產氫適宜溫度範圍為20℃-35℃。沼澤紅假單胞菌產氫代謝中需要光能作為驅動力。圖5表示特定條件下光照強度對本菌種產氫行為的影響，研究表明本菌種生長和產氫過程中所需的光照強度為0lx-9000lx，其中適宜的光照強度為2000lx-5000lx。特定條件下光照強度對本菌種產氫行為的影響表現為該菌種在黑暗厭氧條件下基本不生長或生長緩慢，當光照度為4000lx時，獲得的產氫量達到最大，為49.57mlH2/(100ml culture medium)，為最佳的光照度，當光照度低於或高於4000lx時，都將限制或抑制光合細菌生理活動向合成氫氣的方向進行。
權利要求
1.一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，其特徵在於採用如下步驟進行(1)製備液體培養基，將液體培養基放入高壓滅菌鍋內滅菌12-15分鐘，取出培養基冷卻至常溫，並將液體培養基分別裝入種子擴大培養反應器和光生物制氫反應器中待用；其中，液體培養基的初始pH範圍為4.5-8.8，有機底物的濃度範圍為1.98g/l-45g/l；(2)沼澤紅假單胞菌菌種的擴大培養用接種針挑取固體雙層平板培養基上生長的沼澤紅假單胞菌落接種於滅菌冷卻後的液體培養基中；在盛裝該液體培養基的種子擴大培養反應器中充入氬氣排除空氣，形成厭氧環境，並將接種後的液體培養基置於25℃-35℃，日光燈為光源，光照度為1500lx-8000lx的光照恆溫培養箱中靜置培養36-96小時，得到後續產氫過程中所用的擴大培養液；(3)沼澤紅假單胞菌的光生物制氫將沼澤紅假單胞菌擴大培養液按培養基量的8％-18％接種到光生物制氫反應器盛裝的液體培養基中，並在光生物制氫反應器內充入氬氣獲得厭氧環境，以日光燈或LED燈為光源，光照度為2000lx-5000lx，培養溫度為20℃-35℃，靜置恆溫光照培養10小時-15小時後沼澤紅假單胞菌開始產生氫氣。
2.根據權利要求1所述的利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，所述液體培養基的最佳初始pH範圍取6.0-8.5。
3.根據權利要求1所述的利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，所述液體培養基的最佳有機底物的濃度範圍為11.880g/l-27.72g/l。
4.根據權利要求1或2或3所述的利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，所述液體培養基成分是有機底物11.880g/l-27.72g/l；K2HPO4·3H2O0.3g/l-1.56g/l；KH2PO40.22g/l-10.89g/l；NH4Cl0.677g/l-2.35g/l；CaCl20.002g/l-0.26g/l；FeSO4·7H2O0.005g/l-0.417g/l；ZnSO40.0001g/l-0.02g/l；MgSO4·7H2O0.02g/l-0.5g/l；NaCl0.1g/l-1.5g/l；CuSO40.001g/l-0.04g/l(NH4)6Mo4O24·4H2O0.0001g/l-0.002g/l；VB20.00001g/l-0.00025g/l；煙酸0.00001g/l-0.0002g/l；牛肉膏0.5g/l-4.0g/l；水1000ml；pH值6.0-8.5。
5.根據權利要求4所述的利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，所述有機底物包括葡萄糖或乙酸鈉或酒石酸鈉或丙酸鈉。
全文摘要
一種利用沼澤紅假單胞菌制氫的方法，其特徵在於採用如下步驟進行(1)製備液體培養基，將液體培養基放入高壓滅菌鍋內滅菌12－15分鐘，取出培養基冷卻至常溫，並將液體培養基分別裝入生物反應器和光生物制氫反應器中待用；其中，液體培養基的初始pH範圍為4.5－8.8，有機底物的濃度範圍為1.98g/l－45g/l；(2)沼澤紅假單胞菌菌種的擴大培養用接種針挑取固體雙層平板培養基上生長的沼澤紅假單胞菌落接種於滅菌冷卻後的液體培養基中；在盛裝該液體培養基的生物反應器中充入氬氣排除空氣，形成厭氧環境，並將接種後的液體培養基置於25℃－35℃，光照度為1500lx－8000lx的光照恆溫培養箱中靜置培養36－96小時，得到後續產氫過程中所用的擴大培養液。
文檔編號C12R1/38GK101041832SQ20071007840
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月20日 優先權日2007年4月20日
發明者廖強, 王永忠, 朱恂, 田鑫, 石泳, 丁玉棟 申請人:重慶大學