利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法
2023-05-20 18:39:46 2
專利名稱：利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法。
背景技術：
目前充血性心力衰竭發病率逐年升高，全球有1500萬患者，每年新發病例為46. 5 萬，為65歲以上人群首要住院原因，也是心血管死亡的最主要原因。以幹細胞為種子資源的細胞移植療法可促進梗死局部血管新生和心肌再生，進而改善心肌梗死後心功能，已成為目前心血管領域的研究熱點。然而可供移植的胚胎心肌細胞增殖能力有限、取材不便， 骨骼肌成肌細胞又不能與心肌細胞形成縫隙連接且會致心律失常，致使該治療手段止步不前。因此以幹細胞為種子資源的細胞治療成為損傷組織修復和替代的重要手段。其中，人胚胎幹細胞受到其自身一些因素的限制，如致瘤性、免疫原性和倫理問題等，尚不能作為理想的移植細胞源。間充質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)是具多分化方向能力的成體幹細胞，因其進行自體移植無排異及來源的限制，是理想的移植細胞源。其中，骨髓間充質幹細胞是目前主要的幹細胞來源。儘管其倫理問題與胚胎幹細胞相比大為減少，但骨髓細胞必須通過侵入的途徑獲得，而且隨著年齡的增長，幹細胞數量顯著減少。因採集方式及自身含量的限制，骨髓間充質幹細胞在臨床應用上面臨著難以突破的瓶頸。骨髓來源的間充質幹細胞主要存在以下問題1.分化為心肌細胞、神經元細胞等功能細胞的潛能不夠；2.移植後大部分細胞死亡；3.移植療效不理想；4.細胞數量限制。子宮內膜細胞系具有很強的自我更新能力。在每個月經周期都會有組織和血管的大量增長，這一增長過程會隨著月經周期的結束而停止。美日中等多國科學家的最新研究顯示在隨女性經血脫落的子宮內膜組織中，具有相當數量的間充質幹細胞(基質幹細胞)_宮內膜幹細胞，數量為骨髓來源的30倍；這些幹細胞活力更強，更強的自我更新和增殖能力，分化潛能更接近胚胎幹細胞。有研究發現宮內膜幹細胞不僅具有幾乎每M小時複製一次的驚人速率，而且它們產生獨特生長因子的速率，比來自於臍帶血的幹細胞要大上 10萬倍。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，所得的功能心肌細胞能用於治療心肌梗死。為了解決上述技術問題，本發明提供一種利用子宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，包括以下步驟1)、宮內膜幹細胞的分離培養和擴增
將經血經含抗生素的殺菌液的殺菌處理後，離心，去上清液；然後加入Chang氏通用培養基置於4 6% CO2,94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中培養；培養5 7天後換液去除未貼壁細胞；一旦細胞生長至75 85%匯合度時，即採用胰酶消化傳代；一般，可每隔2 4換液一次，每3 4天傳代細胞一次；2)、體外誘導分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變為單個圓形時即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，離心， 所得的細胞沉澱用PBS清洗；在上述PBS清洗後的細胞中加入誘導培養基置於4 6% CO2、94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中培養；每IX IO5個的細胞中加入0. 8 1. 2ml誘導培養基，所述誘導培養基為在無血清DMEM培養基中含有1 10 μ M的5-氮胞苷；培養時間為68 76小時，得功能性心肌細胞。作為本發明的利用子宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法的改進步驟 1)依次為①、經血收集在採集管內設置20ml的Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，並添加以下成分至以下濃度萬古黴素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、頭孢氨苄(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那黴素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、慶大黴素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、兩性黴素 B (Amphotericin B) 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液； 將15 20ml的經血放入上述採集管內，於0 4°C的低溫下保存M 48小時；然後離心， 去上清液；②、原代培養A)、取6 IOml的Chang氏通用培養基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養瓶中置於4 6% C02、94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱內培養；培養5 7天後全量換液；再將上述培養瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細胞滑落至培養瓶底部，用移液管去除培養瓶中的培養基；C)、在步驟B)所得的培養瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養基進行潤洗(潤洗細胞層)，然後用移液管去除培養瓶中的培養基；D)、在步驟C)所得的培養瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養基，置於4 6% CO2、94 96%飽和溼度的36 38 °C培養箱內培養；Chang氏通用培養基的配製方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入650mL MEM-alpha(MEM alpha, Invitrogen ^w] ) >160 ~ 200mL Chang B (Irvine Scientific 公司)、10 30mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、5 15mL 青黴素/鏈黴素雙抗(10，000U/mL苄青黴素鈉，10，000 μ g/mL鏈黴素)，5 15mL的濃度為 200mM 的 L-穀氨醯胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、130 170mL 的胎牛血清(ES-FBS， Invitrogen公司)；充分混勻，高壓蒸汽滅菌後放入0 4°C冰箱保存待用；③、細胞傳代培養一旦步驟②原代培養的細胞生長至75 85%匯合度時，即採用胰酶消化傳代；(一般每3 4天傳代細胞一次)；具體如下A)、一旦步驟②原代培養的細胞生長至75 85%匯合度時，去除培養液，然後用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進行洗滌；B)、加入2 4ml胰酶，置於4 6% CO2、94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細胞脫落並成單細胞狀態；E)、按l 8的比率傳代；F)、在每Iml的細胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養基；然後置於4 6% CO2、94 96%飽和溼度的36 38 °C培養箱中培養。在本發明中，孵育和培養均是在4 6% CO2,94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中進行的。在本發明中，用於消化的胰酶是指常規的0.25%或者0.2% (質量體積比)的胰酶(胰蛋白酶)。本發明主要涉及以下內容1.宮內膜幹細胞的培養及分子標記物的鑑定。2.體外實驗建立5-氮胞苷定向誘導經血幹細胞分化為功能性心肌細胞的體外模型。3.心肌梗死後充血後心力衰竭動物模型的構建。4.體內實驗將沒有誘導和成功誘導分化的功能性心肌細胞進行體內移植，評估 MSCs移植後在體內的分化情況及心功能改善情況。本發明通過體外經血幹細胞的培養及鑑定，篩選出穩定的宮內膜幹細胞系；經 5-氮胞苷體外定向誘導模型，成功分化出功能性心肌細胞；利用細胞移植術，將沒有誘導和定向分化為心肌細胞經血幹細胞原位移植在心肌梗死後充血後心力衰竭動物模型的梗死灶周邊，研究宮內膜幹細胞移植在心肌梗死後充血後心力衰竭動物模型治療的作用；術後跟蹤細胞體內的分化情況及心功能改善情況；運用Kaplan-Meier生存曲線分析宮內膜幹細胞移植術在治療心肌梗死後充血後心力衰竭動物模型的療效，證實其治療心肌梗死的可行性。宮內膜(經血)幹細胞是最近發現的成體幹細胞的一種，屬於間充質幹細胞 (MenSC)。子宮內膜組織內發現存在豐富的間充質幹細胞，在月經期間隨經血排出體外，是一種無創、安全的幹細胞來源方式。在細胞標記分子表達和細胞增殖、分化能力上，經血幹細胞與胚胎幹細胞更相似。本發明通過5-氮胞苷誘導宮內膜幹細胞定向分化為功能性心肌細胞的體外模型，採用不經誘導和誘導定向分化的宮內膜幹細胞體內移植的方法，觀察幹細胞在體內分化的效果，為心肌梗死後充血後心力衰竭的治療提供一種高效、應用更廣泛的解決方案。本發明的利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，具有以下優點1、宮內膜幹細胞表達心肌細胞特異性基因GREMl是骨髓幹細胞的10倍。2、體外誘導分化率高，可高達60%。3、宮內膜幹細胞在小動物體內存活時間可達2月以上。
綜上所述，本發明建立體外定向誘導心肌細胞模型，利用幹細胞移植技術，研究宮內膜幹細胞移植在心肌梗死後充血後心力衰竭動物模型治療的作用；證實其治療心肌梗死的可行性，為提高幹細胞臨床治療效果奠定基礎。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為免疫組化實驗結果圖，5μ M的5-氮胞苷誘導後72小時，β-Actin染色結果；圖2為RT-PCR實驗結果圖，5 μ M的5_氮胞苷誘導後72小時，三條帶從上到下分另Ij 為 β -MHC, cTNT 和GAPDH ；圖3為體內移植實驗結果圖；圖4為體內移植實驗結果圖；圖5為移植後宮內膜幹細胞生存力評價圖。
具體實施例方式一、宮內膜幹細胞的分離培養和擴增招募10位不同年齡段的經期婦女，在完全自願的前提下捐獻月經血樣品。具體操作規程如下1、經血樣品收集將經血採集管，月事杯放入經血採集盒，送至經血供者手中。採集管事先裝有 20mlHBSS(Hank' s平衡鹽溶液)採集液，其中含有Vancomycin (萬古黴素)80 μ g/mL、 Claforan (頭孢氨苄)250 μ g/mL、Amikacin (卡那黴素)100 μ g/mL、Gentamycin (慶大黴素)120 μ g/mL、Amphotericin B (兩性黴素B) 2. 7 μ g/mL及400單位肝素鈉。以此作為含抗生素的殺菌液。即上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)採集液的製備方法如下在20ml的Hank' s平衡鹽溶液中添加以下成分至以下濃度萬古黴素 (Vancomycin) 80 μ g/mL、頭孢氨苄(Claforan) 250 μ g/mL、卡那黴素(Amikacin) 100 μ g/ mL、慶大黴素(Gentamycin) 120 μ g/mL、兩性黴素 B (Amphotericin B) 2. 7 μ g/mL及 400 單位肝素鈉；然後再按照常規程序於高溫高壓下進行滅菌。供者在月經開始的前幾天(第1至3天)，利用月事杯獲取經血樣品。將每15 20ml的經血(屬於同一個供者)放入上述1個採集管內。在得到細胞捐贈者知會同意的情況下對細胞進行培養(此知會同意必需獲得制定評審委員會的批准)。在獲取樣品後送往處理實驗室之前必須將它們在低溫(0 4°C )條件下進行保存(保存期一般為M到48 小時)。1)保存M小時後，觀察經血收集管中的樣品，如有沉澱，可將樣品經由IOOmicron 過濾網過濾；2)準備離心前，仔細將樣品收集管的外周擦拭乾淨；確保離心機上離心管的平 3)在840g、4. 0°C的條件下離心樣品7分鐘；
4)小心取出樣品收集管，勿擾亂細胞分層；5)將樣品收集管外周用酒精棉擦拭消毒後，移入生物安全櫃進行下一步操作；6)去除上清液；小心吸液，不要擾亂細胞層，造成額外的細胞丟失。上述上清液可用於進行細菌檢測，即將該上清液按照常規的血培養法進行厭氧菌和需氧菌、真菌的檢測，並按照常規方法進行鑑定。若為陽性結果，則結束整個宮內膜幹細胞的分離培養和擴增。將上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)採集液中被處理了 M小時後的經血，按照常規方式進行微生物檢測及傳染病病原體安全檢測，一般對常見病毒如HIV、HBV, HCV, CMV和梅毒進行檢測。若為陽性結果，則結束整個宮內膜幹細胞的分離培養和擴增。上述2種檢測目的是為了保證最終所得的功能心肌細胞的使用安全性。2、原代培養培養基配製——Chang氏通用培養基的成分如下l)650mL MEM alpha 培養基2) 180mL Chang 氏 B 液(基礎培養基)(18% ν/ν)3) 20mL Chang 氏 C 液(2% ν/ν)4) IOmL青黴素/鏈黴素雙抗(10，000U/mL苄青黴素鈉，10, 000 μ g/mL鏈黴素；即每ml青黴素/鏈黴素雙抗溶液中含有10，000U的苄青黴素鈉和10，000 μ g的鏈黴素)5) IOmL 的 L-穀氨醯胺 200mM (IOOx)6) I5OmL 的胎牛血清(15% ν/ν)Chang氏通用培養基的配製方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入 650mLMEM-alpha # S (MEM alpha, Invitrogen ^w] ) U80mL Chang BS^ (Irvine Scientific 公司)、20mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、IOmL 青黴素 / 鏈黴素雙抗(10，000U/mL苄青黴素鈉，10, 000 μ g/mL鏈黴素)，IOmL的濃度為200mM的L-穀氨醯胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、150mL 的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen 公司)；充分混勻，按照常規方式高壓蒸汽滅菌後放入0 4°C冰箱保存待用。1)取7mLChang氏通用培養基，加入到已去除上清的經血樣品(即步驟1的所得物)中，輕柔吹打混勻；得細胞懸液；2)取一個T-25培養瓶，將步驟1)所得的全部細胞懸液移取到該培養瓶中；3)放入36. 0-38. 0°C的孵箱內(5% C02，95%飽和溼度)培養；4)培養5-7天，全量換液(即換7mLChang氏通用培養基)。在生物安全櫃中，先將培養瓶直立5分鐘，待未貼壁的細胞大部分隨培養基滑落至培養瓶底部，用移液管將培養基去除。5)取3mLChang氏通用培養基，慢慢在培養瓶側壁滴入。慢慢將培養瓶放平，輕柔地搖晃，潤洗細胞層，然後將培養瓶直立5分鐘，用移液管將培養基去除。6)取7mLChang氏通用培養基，慢慢在培養瓶側壁滴入。7)鏡下觀察，有散落的貼壁細胞。8)放入36. 0-38. 0°C CO2孵箱(5% C02，95%飽和溼度)內繼續培養。在培養過程中，等幹細胞細胞貼壁後，去除未貼壁的細胞，一般每隔2 4天換液一次繼續培養。一周後觀察，細胞生長，有成團細胞增殖，此時細胞生長至80%匯合度。
3、細胞傳代培養1)去除上述原代培養步驟的8)所得物中的培養液；2)用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進行洗滌；上述無鈣鎂離子的PBS洗滌液的配製如下
NaCl8.OOg
KCl0. 2g
Na2HPO4H2O1. 56g
KH2PO40. 2
雙蒸水定容至1 L;於高壓蒸汽滅菌(常規程序)後放入4°C冰箱保存待用。3)加入3ml胰酶，36_38°C孵育(5% CO2,95%飽和溼度)5分鐘；4)加入5ml的Chang氏通用培養基使胰酶失活；5)輕柔吹打，使貼壁細胞脫落並成單細胞狀態；6)按1 8的比率傳代在8ml的細胞懸液中取Iml至一新的T_25培養瓶中，再加入6ml的Chang氏通用培養基，混勻；7)放入 36. 0-38. 0°C CO2 孵箱(5% CO2,95% 飽和溼度)內培養；8)每3-4天傳代細胞一次(即從步驟1)開始至步驟7)為止，每3-4天傳代一次)，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率。4、經血間充質幹細胞的分子表型鑑定流式細胞術檢測細胞表面抗原1)細胞傳至第2-4代時收集細胞，0. 25%胰酶消化細胞，製成細胞懸液，細胞量為 IXlO6 ；2)分別取所需數據的0. 5ml EP管，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(⑶34，⑶44， CD45, CD73, CD90, CD105, CD29, SSEA-4，0CT-4，及同型對照)20 μ 1 ；3)、管內分別加入細胞樣本(步驟1)所得)50μ1，避光4°C孵育30min;4)、300g 離心 5 分鐘；5)、棄上清，加入(質量濃度)人血清的PBS 1ml，充分混勻，300g離心5分鐘；6)、棄上清，加入PBS調整樣本量至100 μ 1，上流式細胞儀進行分析；所得結果為CD44，CD73,CD90, CD105, CD29, SSEA-4, 0CT-4 為陽性，CD34, CD45 為陰性；從而確定所得確為宮內膜幹細胞。二、建立宮內膜幹細胞定向分化為功能性心肌細胞的體外模型取培養4-6代的宮內膜幹細胞進行體外實驗，採用ΙμΜ,δμΜ,ΙΟμΜ不同濃度的5-氮胞苷，並結合不同的誘導時間，將宮內膜幹細胞定向誘導成功能性心肌細胞。對分化所得細胞進行心肌肌球蛋白重鏈(MHC)，心肌肌球蛋白輕鏈(MLC-2v)，心肌肌鈣蛋白 (Troponin)等標誌的免疫細胞化學染色，以及相關心肌特異性分子標誌如Nkx2. 5，ANF, GATA4，Na+-Ca2+交換泵及磷酸蛋白受體等的RT-PCR鑑定等。具體操作規程如下
1、體外定向誘導宮內膜幹細胞分化為心肌樣細胞取第4-6代生長狀況良好的細胞，表現為生長旺盛、胞體大、胞核清晰、胞漿豐富、 顯微鏡下折光性強的細胞，以胰酶(例如為0.2%胰蛋白酶)消化，顯微鏡下見細胞變為單個圓形時即以含15%胎牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打後離心，獲得細胞沉澱，PBS洗 2遍(目的是為了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物質)。誘導培養基將細胞沉澱吹散，然後接種於6孔板中進行誘導培養，接種細胞密度為1 X IO5/孔，每孔加Iml誘導培養基(定容至 Iml)。置於5% CO2,95%飽和溼度的36 38°C培養箱中培養。為了確定最佳誘導培養基，分別設置了以下3種誘導培養基含有1 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基，含有5 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基，含有10 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基。以不含5-氮胞苷的無血清DMEM培養基作為對照。上述含有1 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基的製備方法如下在無血清 DMEM培養基中加入5-氮胞苷，直至5-氮胞苷的濃度為1 μ Μ。於高壓蒸汽滅菌(常規方式) 後放入4°C冰箱保存待用。改變5-氮胞苷的用量，從而相應的得到含有5 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基以及含有10 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基。孵育7 後，在上述誘導培養基中孵育的均能得到功能性心肌細胞；其中，含有 5 μ M濃度5-氮胞苷的無血清DMEM培養基所對應的效果最好。而不含5-氮胞苷的無血清 DMEM培養基不能得到功能性心肌細胞。將上述功能性心肌細胞用含10% FBS (胎牛血清，體積含量)的DMEM培養基換液，每隔2-3天全量換液一次，繼續培養至第8周，每組包括20個細胞爬片(即每組分別設置誘導前和誘導後72小時及第2、3、4周)。5-氮胞苷誘導72小時後完成，繼續在含10% FBS (胎牛血清)的DMEM培養基培養，目的是為了觀察誘導後心肌細胞的變化。2、免疫組化鑑定1)取5μ M的5-氮胞苷誘導72小時的細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定。2)加入3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶。3)加入待測β-Actin—抗，4°C過夜。4)加入生物素標記的二抗。常溫孵育IOmin。5)鏡下觀察。所得結果如圖1所示圖1為免疫組化實驗結果，5μ M的5-氮胞苷誘導後72小時，β-Actin染色結果。β-Actin是心肌細胞的一種特異性蛋白，從圖1得知，宮內膜幹細胞已誘導分化為心肌樣細胞。3、RT-PCR檢測心肌細胞特異性基因(β -MHC, cTNT)的表達取第2代和誘導後72小時和第1、2、3、4、6、8周細胞，計數約1\106個，1^&01法提取總RNA。逆轉錄並進行體外擴增。PCR所需引物見下表1:表 1
所述擴增體系為試劑
濃度
體積
權利要求
1.利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，其特徵是包括以下步驟1)、宮內膜幹細胞的分離培養和擴增將經血經含抗生素的殺菌液的殺菌處理後，離心，去上清液；然後加入Chang氏通用培養基置於4 6% CO2,94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中培養；培養5 7天後換液去除未貼壁細胞；一旦細胞生長至75 85%匯合度時，即採用胰酶消化傳代；2)、體外誘導分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變為單個圓形時即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，離心，所得的細胞沉澱用PBS清洗；在上述PBS清洗後的細胞中加入誘導培養基置於4 6% CO2、94 96%飽和溼度的 36 38°C培養箱中培養；每1 X IO5個的細胞中加入0. 8 1. 2ml誘導培養基，所述誘導培養基為在無血清DMEM培養基中含有1 10 μ M的5-氮胞苷；培養時間為68 76小時， 得功能心肌細胞。
2.根據權利要求1所述的利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，其特徵是所述步驟1)依次為①、經血收集在採集管內設置20ml的Hank' s平衡鹽溶液，並添加以下成分至以下濃度萬古黴素 60 100μ g/mL、頭孢氨苄150 350 μ g/mL、卡那黴素50 150 μ g/mL、慶大黴素80 160 μ g/mL、兩性黴素B 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液；將15 20ml的經血放入上述採集管內，於0 4°C的低溫下保存M 48小時；然後離心，去上清液；②、原代培養A)、取6 IOml的Chang氏通用培養基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養瓶中置於4 6%CO2,94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱內培養；培養5 7天後全量換液；再將上述培養瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細胞滑落至培養瓶底部，用移液管去除培養瓶中的培養基；C)、在步驟B)所得的培養瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養基進行潤洗，然後用移液管去除培養瓶中的培養基；D)、在步驟C)所得的培養瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養基，置於4 6%CO2, 94 96%飽和溼度的36 38 °C培養箱內培養；所述Chang氏通用培養基的配製方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入 650mLMEM-alpha 培養基、160 200mL 的 Chang B 基液、10 30mL 的 Chang C 基液、5 15mL青黴素/鏈黴素雙抗(10，00(^/11^苄青黴素鈉，10，00(^8/1^鏈黴素)，5 151^的濃度為200mM的L-穀氨醯胺、130 170mL的胎牛血清；充分混勻，高壓蒸汽滅菌後放入0 4°C冰箱保存待用；③、細胞傳代培養一旦步驟②原代培養的細胞生長至75 85%匯合度時，即採用胰酶消化傳代；具體如下A)、一旦步驟②原代培養的細胞生長至75 85%匯合度時，去除培養液，然後用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進行洗滌；B)、加入2 胰酶，置於4 6%CO2,94 96%飽和溼度的36 38°C培養箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細胞脫落並成單細胞狀態； 幻、按1 8的比率傳代；F)、在每Iml的細胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養基；然後置於4 6% C02、94 96%飽和溼度的36 38 °C培養箱中培養。
全文摘要
本發明公開了一種利用宮內膜幹細胞誘導分化功能心肌細胞的方法，包括以下步驟1)宮內膜幹細胞的分離培養和擴增；2)體外誘導分化將上述步驟1)所得的第4～6代生長狀況良好的細胞以胰酶消化，當顯微鏡下見細胞變為單個圓形時即以含體積濃度為13～17％胎牛血清的DMEM培養基終止消化，離心，所得的細胞沉澱用PBS清洗；在上述PBS清洗後的細胞中加入誘導培養基置於4～6％CO2、94～96％飽和溼度的36～38℃培養箱中培養；培養時間為68～76小時，得功能心肌細胞。所得的功能心肌細胞能用於治療心肌梗死。
文檔編號C12N5/0775GK102199573SQ20111009268
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月13日 優先權日2010年4月13日
發明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司