多元同步標記分析法的製作方法

2023-05-20 18:53:06

專利名稱：多元同步標記分析法的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物標樣(血、尿及其它)標記分析方法，特別適用於免疫測定即血、尿液或其他生物樣品中抗原、抗體及機體成分的測定方法，臨床工作中，為了診斷一種疾病，經常需要測定多種成分，常規的標記分析，只能一種一種地測定，即取一份標本血清或其他樣品經過一系列的技術操作處理，獲得一種成分的含量值，分析的項目越多，耗費的時間就越多，需要的樣品也就越多，取大量的樣品，對病人是一種痛苦，以B肝表面抗原，E抗原，表面抗體，E抗體、核心抗體，通常稱之為兩對半的測定為例，要取得這五種數據，需要作五次操作處理，需要取五份總計0.8毫升血清標本，對兒童來說取夠所需的血量並非容易的事，特殊標本的取材更困難，甚至無法測定多種必要的項目，影響論斷，另外，檢測多種項目要進行多次技術操作，工作量大，消耗多，誤差因素也多。
本發明的目的就是針對上述現有標記分析法的不足，建立了一種只用一份標本(血清或其他)進行一次操作處理，就可以完成多種項目檢測的方法，從而提高了標記分析的效率，簡化了操作，減少了標本用量，減少了誤差的機會。
本發明稱作多元同步標記分析法，它是在常規固相標記分析的基礎上開發出來的，多元同步標記分析的理論基礎是免疫學的特異性-即抗體只與相應的抗原結合，Cutt和Treager的抗體包被塑料載體的新技術，為多元同步標記分析的發明奠定了技術條件。
長時以來，人們始終沿用常規的標記分析法，是因為客觀上存在著若干尚未解決的實際問題，如免疫學的特異性雖然在理論上被承認，但多種抗原抗體在同一體系同時進行反應時，不同抗原抗體之間有無交叉反應，可否造成幹擾;常規的固相載體，無論包被上什麼特異物，在外觀上均無差別，難於分辨;常規固相標記分析用的試劑，是否適合多元同步標記分析使用，有無幹擾物存在，如何將幹擾物分離;常規的標記分析，需要一系列的標準管，如果多元同步標記分析沿用常規方法，每一種被測物都帶一系列標準管，操作複雜，浪費試劑，多元同步標記分析的優越性也就體現不出來;多元同步標記分析的反應體系必然要增大，被測物和試劑的濃度勢必降低，反應機率減少，靈敏度降低。只有解決上述幾個問題，多元同步標記分析法才能建立。
本發明通過大量的試驗觀察，確認了如下的原則和方法。
1、常用的抗體特導性很高，在同一體系內多對抗原抗體可以互不幹涉地進行特導性反應。
2、常規固相標記分析的試劑，因為存在幹擾物，不能簡單地混合使用，需要根據分析項目作認真地分析，必要地檢測，查出幹擾因素，用物理或化學方法將幹擾除去。
3、常用的固相載體為聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺，聚丙烯醛、尼龍等或塗有上述材料的固相支持物，都可用於多元同步標記分析法，為了區分不同的包被物，本發明採用熱灼，鑽孔等方法製造區分標態，也可用形志，大小作為區分標誌，也可以加彩色。實驗證明，這些標誌方法是行之有效的。如果包被珠在試管內不能上下易位，順序可以成為區分的標誌。利用空吸法，使分珠操作既簡單，又迅速、準確。
4、本發明配製了共用標準，減少了標準管數目，節省了試劑，簡化了操作。常規標記分析的標準品，只要含量準確，含有雜質並沒有影響，例如，常規分析法表面抗原陽性對照中含有E抗原或其他並不影響表面抗原的測定。若用這種試劑配製多元同步測定的陽性對照，就會產生幹擾。配製多元同步測定標準的試劑，需根據測定的項目，認真分析所用試劑是否存在幹擾因素。若存在幹擾因素，則採用化學、物理方法除去幹擾，進行必要的純化處理。
以HBsAg HBeAg HBcAb同步放射性標記分析的試劑要求列表如下+表示必須達到一定量，-表示不能存在，0表示無關。
試劑成分試劑 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAg HBcAg HBcAbHBsAgHBeAg陽性對照 + - + - - +HBcHbHBsAgHBeAg陰性對照 - - - - - -HBcAb標記HBcAb - - - - - -HBsAbHBeAb標記試劑 - + - + 0 0HBcAg包被珠 - - - - + -HBsAb包被珠 - + - - - -HBeAb包被珠 - - - + - -
5、由於多元同步標記分析的反應體系要比常規法增大，反應試劑和被測物的濃度降低，本發明採用延長反應時間，如實例延長1倍，增加反應機率予以解決。
本發明的技術方案就是在上述實驗觀察的基礎上提出的。
利用抗原抗體或他特異性結合物，包被在固相材料上，在同一反應體系裡，在固相載體上與被測的抗原或其他結合物，分別進行特異反應，進行定性、定量測定，其特徵在於a、多種被測物在同體系，同一試料裡，同時進行反應。
b、被測物種類根據固相的標誌或順序區分。
c、多種被測物標準，融匯在同一樣品裡。
具體操作步驟如下1、標本製備因多元同步標記分析法，建立在常規的固相分析基礎上，因此對標本無特殊要求，與常規方法處理保存標本的原則相同。
2、試劑常規法是單一成分測定，只要試劑適用於某成分的測定即可，即使存在無關成分，只要不幹擾該項測定即可，多元同步標記分析要求不含幹擾同一體系其他成分測定的物質，這需要對試劑進行加工處理提純。
可以採用任一種提純法，最方便的是親和層析法。
3、反應方法這個方法的核心技術是利用不同的抗體(抗原或其他特異性結合物)包被在各不相同的可以區分的在固相載體上，在同一體系分別攝取相應的抗原(抗體或其他特異性結合物)將被測物分離，在去除無關因素或幹擾因素後，再加標記抗體(抗原或其他特異性結合物)，通過標記物定量，計算被測物含量。操作方法與常規的固相標記分析法類同即夾心法，競爭法，中和法。常規方法是單一成分測定，多元同步法則可以結合使用多種方法即在同一體系既有夾心過程，又存在競爭過程、中和過程。
4、數據處理a、標準曲線法用於定量測定。
b、定性分析計數與含量成負相關的定性測定法-中和法、競爭法以樣品計數低於陰性對照的50%為陽性;計數與含量成正相關的定性測定-夾心法，以樣品計數高於陰性對照的2.1倍為陽性。
c、根據數據統計原理，作正規的七檢驗判斷陰性或陽性更好。
下面結合多元同步標記分析舉例，作進一步的說明(一)HBsAg HBeAg HBcAB同步放射性標記分析。
1、設備放射性標記分析實驗室常規儀器，計數器，洗珠設備，分珠器等。
2、試劑(1)、HBsAg、HBeAg、HBcAb陰性對照下稱三陰對照血清。
(2)、HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性對照下稱三陽對照血清。
(3)、HBsAb包被珠。
(4)、HBeAb包被珠。
(5)、HBcAg包被珠。
(6)、HBcAb、HBeAb複合標記試劑。
三、方法三陰管 三陽管 被測樣品管三陰性對照: 0.2三陽性對照 0.2樣品 0.2HBcAb標記試劑 0.5 0.5 0.5HBsAb包被珠 一粒 一粒 一粒HBEAb包被珠 一粒 一粒 一粒HBcAb包被珠 一粒 一粒 一粒45度C3h後蒸溜水洗三次每次3ML取出上層HBcAg包被珠作HBcAb測定。
HBsAbHBeAb標記試劑 0.4 0.4 0.4
45度2h後，室溫過夜蒸溜水洗三次每次3ML取出上層作HBeAg測定，底層留作HBsAg測定。
4、結果計算，按常規方法進行。
(二)HBsHb HBeHb同步放射性標記分析實例。
1、儀器同上2、試劑(1)、HBsAb HBeAb陰性對照(2)、HBsAb HBeAb陽性對照(3)、競爭HBeAg(4)、HBsAg包被珠(5)、HBeAb包被珠(6)、HBsAg HBeAb複合標記液五、方法HBsAb HBsAb HBeAb HBeAbHBsAbHBeAb陰性對照 0.2- -HBsAbHBeAb陽性對照 - 0.2 -樣品 - - 0.2競爭HBeAg 0.3 0.3 0.3HBsAg包被珠一粒 一粒 一粒HBeAb包被珠一粒 一粒 一粒45度 3h 蒸溜水洗3次，每次4mlHBsAgHBeAb 複合標記液 0.4 0.40.445度 2h 室溫過液 蒸溜水洗3次每次4ml4、計算按常規方法進行為了證明本發明的可靠性，對把本發明的分析法與常規法作了比較結果如下1、靈敏度比較，將HBsAg、HBeAg陽性對照作一系列稀釋後用兩種方法測定、結果見表表1 HBsAg陰陽對照各種稀釋度的P/N值1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512多元同步 33 33 27 16 14 8 6 4.5 1.9常規法 88 85 64 53 27 18 10 6 1.9表2 HBeAg陽性對照各種稀釋度的P/N值多元同步 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:51211.5 10.8 6.3 3.6 2.6 2.3 1.6 1.2 1.1常規法 41 20 18 11 5.1 3.3 2.3 1.4 0.52、特異性比較從理論上講，只要常規方法HBsAg測定與HBeAg測定無幹擾，多元同步也不會存在幹擾，實例也證明了這點。
HBeAg陽性對照P/N＝30 HBeAg測定為陰性P/N＝1.1HBsAg陽性對照P/N＝15.3 HBeAg測定為陰性P/N＝0.93、臨床應用比較、臨床標本58份，用兩種方法測定HBsAg和HBeAg、檢出HBeAg陽性11例，兩種方法一致。常規方法檢出HBsAg30例，多元同步法檢出25例，對結果不一致的樣品進行複查，常規4例陰性，1例陽性，多元同步5例陰性，最終檢出結果，常規法26例，多元同步法25例，結果不同的那例，採用吳清福的數據處理法則兩種方法均在可疑範圍。用北方免疫試劑研究所提供的HBsAg國家標準品作檢測結果如下國家標準 常規法 多元同步法靈敏度 ≤1ng/ml ≤1ng/ml ≤1ng/ml特異性20管 0/20 0/20 0/20線性5點 0.95 0.97 0.966精密度(10管CV)15% 8.9% 7.6%HBcHb、HBeAb的多元同步測定結果也很好。本發明的多元同步標記分析法，具有如下優點1、多元同步分析法簡化了操作，大大提高了工作效率，以B肝兩對半的常規放射性標記分析與多元同步放射性標記分析為例，比較如下
B肝兩對半常規標記分析法與多元同步標記分析法比較標本用量 加樣次數 洗珠次數 消耗吸頭 陰陽性對照常規標記法 0.8ml 11次 11次 11次 10並多元同步法 0.3ml 6次 4次 5 4多元同步標記分析法與常規標記法提高工作效率2.5倍。
2、多元同步法可以在同一體系中分析多種成分，標本需要量少，減少病人痛苦對醫學研究和臨床都有很大意義。
3、多元同步分析法操作簡單，減少了誤差來源，減少了錯號及樣品、試劑漏加、重加的機率。
4、多元同步分析法可以在同一體系進行多種成分測定增加了多種檢測項目的可比性。
5、多元同步分析法的核心是固相吸附劑的一致性，文獻報導通過共價健結合包被珠變異在2.2%完全達到了液相法的水平，可以用於定量，多元同步分析法將使標記分析系列化，在醫學分析測定方面有很大的實用價值。
權利要求
1.一種生物試樣(血、尿或其它物質)的多元同步標記分析法，利用抗原、抗體或其他特異性結合物包被在固相材料上，在同一體系裡，在固相載體上與被測的抗體，抗原或其他特異性結合物分別進行特異性反應，進行定性定量測定，其特徵在於a、多種被測物在同一體系，同一試樣、同時進行反應。b、被測物種類的區分，根據固相的標誌或區位，順序。c、多種被測物標準融匯在同一標樣裡。
2.按照權利要求1，所述的多元同步標記分析法，其特徵在於固相材料可以是聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯醯胺，聚丙烯醛或尼龍，固相的區分方法包括形狀，大小、標誌、顏色或順序，標記分析法可以是放射性標記，酶標記，螢光標記或稀土元素標記。
3.按照權利要求1和2所述的多元同步標記分析法，其特徵在於標樣和試劑原料中的幹擾物需要清除。
全文摘要
本發明是一種生物試樣(如血、尿及其它)中的物質測量方法，它建立在固相標記分析的基礎上，原理是將多種抗原抗體或其它特異性結合物，分別包被在固相載體上，在同一體系裡與相應的抗體、抗原或其他特異性結合物反應，達到同時測定幾種物質成分含量的目的。這個方法具有節省標本，操作簡單，降低成本，減少誤差等優點。
文檔編號G01N33/558GK1097252SQ9310777
公開日1995年1月11日 申請日期1993年7月3日 優先權日1993年7月3日
發明者張興祥, 王俐敏 申請人:首鋼總公司