人骨骼肌中的褐色脂肪細胞祖細胞的製作方法

2023-05-20 18:43:36 2

人骨骼肌中的褐色脂肪細胞祖細胞的製作方法
【專利摘要】本發明涉及褐色脂肪組織(BAT)祖細胞和從骨骼肌分離BAT祖細胞的方法。還提供BAT祖細胞表面標誌物以及用於誘導細胞分化成褐色脂肪細胞的培養基和試劑。在一些實施方案中，BAT祖細胞表達與內皮細胞相關的第一細胞表面標誌物，第一細胞表面標誌物在基於抗體的測定中使用第一抗體可檢測到。另外，BAT祖細胞可大致上不含與內皮細胞相關的第二細胞表面標誌物，所述第二細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第二抗體大致上不可檢測到。BAT祖細胞還可大致上不含額外細胞表面標誌物。
【專利說明】人骨骼肌中的褐色脂肪細胞祖細胞
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2011年11月10日提交的美國臨時專利申請No. 61/558, 152的優先 權和權益，所述專利申請全部以引用方式併入本文。

【技術領域】
[0003] 本發明涉及褐色脂肪組織（BAT)祖細胞和從骨骼肌分離BAT祖細胞的方法。本發 明還涉及BAT祖細胞表面標誌物以及誘導細胞分化的培養基和試劑。本發明用於研究、預 防和治療各種代謝疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗和血脂異常。
[0004] 背景
[0005] 肥胖流行病與糖尿病、高血壓、冠心病、癌症和其它病症的發病率增加緊密相關。 白色脂肪組織的作用是存儲脂質，並且它與肥胖症相關。褐色脂肪組織（"BAT"）的作用事 實上相反。它專門從事脂質燃燒和以熱量形式的能量耗散。事實上，褐色脂肪細胞含有許 多線粒體（其中發生細胞燃燒）並且獨特地表達BAT解偶聯蛋白-1 ( "UCP1"）。UCP1充 當氧化磷酸化的解偶聯劑，導致能量以熱量形式耗散。交感神經系統刺激線粒體發生以及 UCP1表達和活性。齧齒動物中的BAT相關生熱作用在暴露於低溫後增加（例如，預防體溫 過低）或由於過度飽食、燃燒多餘吸收脂肪和預防體重增加而增加。通過改變體重增加的 易感性和消耗大量葡萄糖，BAT也改進胰島素敏感性。因此，它在保持體溫、能量平衡和葡 萄糖代謝中發揮重要作用。
[0006] 使用轉基因動物的實驗支持BAT的潛在抗肥胖症性質。舉例來說，已經報告BAT 的遺傳切除可導致肥胖症，而BAT的數量和/或功能（和/或UCP1表達）的遺傳增加據報 告可促進瘦的和健康的表型。具體來說，與對照小鼠相比，具有較高數量BAT的小鼠獲得較 少體重並且更具有胰島素敏感性。最近，異位BAT貯存物在小鼠肌肉中予以證實，已經提出 這些貯存物可提供防止體重增加和代謝症候群的基於遺傳的機制。
[0007] 雖然UCP1據報告在控制齧齒動物體內的能量平衡中起作用並且表達UCP1的BAT 存在於人類新生兒體內，但是一直認為在成人中沒有生理相關的UCP1表達。事實上，表達 UCP1的BAT被認為在生命早期消失，並且成人被認為沒有BAT。
[0008] 因此，需要仔細識別並且研究可在成人體內提供更多BAT和/或刺激UCP1表達的 方法，以便研究、預防和治療各種代謝疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗血脂異常和1 型糖尿病。
[0009] 概述
[0010] 申請人:已經首次識別各種組織中的能夠分化成褐色脂肪細胞的細胞的存在。在一 方面， 申請人:已經在骨骼肌中識別這類細胞的群體， 申請人:將其稱作BAT祖細胞。本公開提 供分選來自各種組織的細胞以識別並且分離BAT祖細胞的方法。在一些實施方案中，BAT 祖細胞從人骨骼肌中分離。提供使BAT祖細胞在體外和體內分化成褐色脂肪細胞的方法。 在一些實施方案中，在人受試者體內，可導致BAT祖細胞在體內分化成褐色脂肪細胞。本發 明還涉及BAT祖細胞表面標誌物（例如，CD31和CD34)和培養基以及誘導細胞分化的試劑 (例如，PPAR γ激動劑和BMP7)。
[0011] 在一些實施方案中，本公開的ΒΑΤ祖細胞可在培養物中擴增。在另一方面，分化的 ΒΑΤ祖細胞UCPlmRNA表達通過試劑如細胞滲透cAMP衍生物、過氧化物酶體增殖物活化受體 (PPAR如PPARY)激動劑等來增加。在一些實施方案中，已經分化成褐色脂肪細胞的BAT祖 細胞可含有大量線粒體轉錄因子A(mtTFA)和PPAR γ輔助活化劑-1 a (PGC-1 α )，其均涉及 控制線粒體發生，以及線粒體標誌物細胞色素氧化酶IV (C0X IV)。分化的ΒΑΤ祖細胞可展 現以下特性中的一個或多個：高水平的UCP1表達、高水平的解偶聯呼吸、高呼吸率、高代謝 率。 申請人:提供分化的細胞，這些細胞經過配備可經由氧化磷酸化的解偶聯來代謝葡萄糖、 氧化脂肪酸，並且以熱量形式來耗散能量。
[0012] 本公開提供檢測成人骨骼肌中的UCPlmRNA的方法，和增加其在體內表達的方 法。雖然以前關於成人體內UCP1表達的研究集中於白色脂肪組織，但是 申請人:公開了具有 UCP1表達的實質性潛力的褐色脂肪祖細胞在人骨骼肌中的存在和分離。在一些實施方案 中，此BAT祖細胞庫可用於調節能量耗散以及治療肥胖症、糖尿病和代謝疾病。
[0013] 在一些方面，本公開提供識別人骨骼肌中的BAT祖細胞的方法和從人骨骼肌樣品 中分離這些細胞的方法。還提供促進這些祖細胞在體外、體內或在這兩者下分化成褐色脂 肪細胞的條件和試劑（例如化合物、蛋白質、生物材料等）。提供使用這些條件和試劑來治 療代謝疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常等的方法。
[0014] 本公開提供允許識別試劑（例如，化合物、蛋白質、生物材料等）的測定，這些試劑 誘導UCP1基因的表達、促進BAT祖細胞在體外分化成褐色脂肪細胞、促進BAT祖細胞在體 內分化成褐色脂肪細胞，或這些活性的組合。根據一些實施方案，用這種方式識別的試劑可 用於治療代謝疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常等。
[0015] 在一方面，提供褐色脂肪組織（BAT)祖細胞。BAT祖細胞從人骨骼肌中分離並且能 夠分化成褐色脂肪細胞。BAT祖細胞表達與內皮細胞相關的第一細胞表面標誌物，所述第一 細胞表面標誌物在基於抗體的測定中使用第一抗體可檢測到。另外，BAT祖細胞大致上不 含與內皮細胞相關的第二細胞表面標誌物，所述第二細胞表面標誌物在所述基於抗體的測 定中使用第二抗體大致上不可檢測到。在某些實施方案中，BAT祖細胞可大致上不含第三、 第四和第五細胞表面標誌物中的至少一個。舉例來說，BAT祖細胞可大致上不含與造血細 胞相關的第三細胞表面標誌物，所述第三細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第 三抗體大致上不可檢測到。BAT祖細胞可大致上不含第三細胞表面標誌物和/或與生肌細 胞相關的第四細胞表面標誌物，所述第四細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第 四抗體大致上不可檢測到。BAT祖細胞可大致上不含第三和/或第四細胞表面標誌物，和/ 或與周細胞相關的第五細胞表面標誌物，所述第五細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定 中使用第五抗體大致上不可檢測到。
[0016] 在另一個方面，本發明表徵從骨骼肌分離的細胞群體，包括如本文描述的至少一 種BAT祖細胞。
[0017] 在另一方面，提供識別BAT祖細胞的方法。所述方法包括：提供從骨骼肌分離的細 胞群體；使細胞群體與分別對於第一和第二細胞表面標誌物具有特異性的第一和第二抗體 接觸，其中第一和第二細胞表面標誌物各自與內皮細胞相關；以及在基於抗體的測定中確 定表達第一細胞表面標誌物並且大致上不含第二細胞表面標誌物的BAT祖細胞。在一些實 施方案中，所述方法可進一步包括以下中的至少一個：使細胞群體與對於與造血細胞相關 的第三細胞表面標誌物具有特異性的第三抗體接觸，所述第三細胞表面標誌物在所述基於 抗體的測定中使用第三抗體大致上不可檢測到；使細胞群體與對於與生肌細胞相關的第四 細胞表面標誌物具有特異性的第四抗體接觸，所述第四細胞表面標誌物在所述基於抗體的 測定中使用第四抗體大致上不可檢測到；和/或使細胞群體與對於與周細胞相關的第五細 胞表面標誌物具有特異性的第五抗體接觸，所述第五細胞表面標誌物在所述基於抗體的測 定中使用第五抗體大致上不可檢測到。在某些實施方案中，所述方法可進一步包括通過選 擇表達第一細胞表面標誌物並且不表達第二細胞表面標誌物的細胞來分離細胞群體。在一 些實施方案中，所述方法可包括選擇表達第一細胞表面標誌物並且不表達第二細胞表面標 志物，以及第三、第四和第五細胞表面標誌物中的至少一個細胞表面標誌物的細胞來分離 細胞群體。舉例來說，所述選擇可包括選擇表達⑶34並且不表達⑶31、⑶45、⑶56或⑶146 的細胞。所述方法還可包括分離BAT祖細胞和/或在增殖培養基中培養BAT祖細胞，從而 離體擴增BAT祖細胞。
[0018] 在另一個方面，提供誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞的方法。所述方法包括： 提供本文描述的BAT祖細胞；使BAT祖細胞暴露於分化培養基；並且在分化培養基中培養 BAT祖細胞以誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞。
[0019] 在另一個方面，本發明表徵治療患者的代謝疾病或病狀的方法。所述方法包括：從 個體或供體的骨骼肌獲得BAT祖細胞；通過在培養基中培養來使BAT祖細胞繁殖；並且將 培養細胞移植至個體。在某些實施方案中，所述方法可進一步包括經由在分化培養基中離 體培養來誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞。在各種實施方案中，代謝疾病是肥胖症、超 重、葡萄糖耐量受損、胰島素抵抗、2型糖尿病、血脂異常、高血壓、心血管疾病、代謝症候群、 帕-魏二氏症候群（Prader-Willi Syndrome)或1型糖尿病。
[0020] 在另一個方面，提供識別誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞的試劑的方法。所 述方法包括：提供本文描述的BAT祖細胞；使BAT祖細胞與試劑接觸；確定是否BAT祖細胞 展現分化成褐色脂肪細胞的指標。在一些實施方案中，分化指標可為以下中的一個或多個 的增加：UCP1蛋白質或mRNA的表達、FABP4(aP2)蛋白質或mRNA的表達、PPARY2蛋白質或 mRNA的表達、mtTFA蛋白質或mRNA的表達、PGC-1 α蛋白質或mRNA的表達、解偶聯呼吸、呼 吸率、代謝率、葡萄糖利用率、脂肪酸氧化率和其組合。
[0021] 在另一個方面，提供識別誘導UCP1的表達或活性水平的試劑的方法。所述方法包 括：提供本文描述的BAT祖細胞；使BAT祖細胞與試劑接觸；確定是否BAT祖細胞展現UCP1 表達或活性的增加。
[0022] 本發明還包括使用本文描述的任何一種方法所識別的試劑在製造藥物中的用途， 所述藥物用於治療代謝疾病，和/或用於治療或預防患者的體溫過低。
[0023] 在一些實施方案中，第一細胞表面標誌物可為⑶34並且第一抗體可為抗-⑶34抗 體。在一個實施方案中，第二細胞表面標誌物可為CD31並且第二抗體可為抗-CD31抗體。 第三細胞表面標誌物，例如，可為CD45並且第三抗體可為抗-CD45抗體。第四細胞表面標 志物，例如，可為⑶56並且第四抗體可為抗-⑶56抗體。第五細胞表面標誌物，例如，可為 ⑶146並且第五抗體可為抗-⑶146抗體。
[0024] 在各種實施方案中，BAT祖細胞可在分化培養基中分化成褐色脂肪細胞。舉例來 說，分化培養基可為基本分化培養基（MDM)。分化培養基可進一步包括過氧化物酶體增殖物 活化受體Y (PPARY)激動劑和/或骨形態形成性蛋白質-7(BMP7)。在一些實施方案中，在 添加分化培養基之前，BMP7可存在於允許增殖BAT祖細胞的增殖培養基中。
[0025] 本發明的額外方面包括分離的BAT祖細胞、其原代培養物、從其中產生的建立或 永生細胞系、培養BAT祖細胞或細胞系、轉染或轉導或感染或轉化細胞或細胞系，和可從這 類BAT祖細胞或細胞系或轉化株分化的任何細胞或培養物。本公開的這些和其它特徵在本 文中闡明。
[0026] 附圖簡述
[0027] 圖1展示人胎兒肌肉中的間質血管細胞的免疫組織化學描述和FACS分析和分選。
[0028] 圖2展示從人胎兒肌肉中分選的細胞在成脂條件下的培養和CD34+細胞的RT-PCR 和蛋白質印跡分析。圖2A、2B、2C :相差；比例尺：50μπι。
[0029] 圖3展示人胎兒肌肉⑶34+細胞中的線粒體呼吸的解偶聯和UCPlmRNA表達的控 制。
[0030] 圖4展示成脂培養物中的成人肌肉和WAT細胞的表徵。圖4A、4C :相差；比例尺： 50 μ m〇
[0031] 圖5展示羅格列酮對於人骨骼肌中的UCPlmRNA表達的效果。
[0032] 圖6展示擴增之前的⑶31-細胞群體（圖6A :EMC309,繼代2 ;圖6B :EMC314,繼代 1)。
[0033] 圖7展示擴增之前的⑶31+細胞群體（圖7A :EMC309,繼代4 ;圖7B :EMC314,繼代 3)。
[0034] 圖8展示擴增之前的⑶56+細胞群體（圖8A :EMC309,繼代1 ;圖8B :EMC314,繼代 3)。
[0035] 圖9展示⑶31-細胞群體分化成褐色脂肪細胞（圖9A-9D :EMC309,第14天的繼 代4 ;圖9E-9H :EMC314,第14天的繼代3)。
[0036] 圖10展示CD31+細胞不分化成脂肪細胞（圖10A-10D :EMC309,第14天的繼代6 ; 圖 10E-10H :EMC314,第 14 天的繼代 5)。
[0037] 圖11展示⑶56+細胞不分化成脂肪細胞（圖11A-11D :EMC309,第14天的繼代6 ; 圖 11E-11H :EMC314,第 14 天的繼代 5)。
[0038] 圖12展示與從成脂分化培養基（MDM)中生長的⑶31-細胞回收的RNA相比， 從CD31+和CD56+細胞中回收的RNA顯著較少（反映較低數量的細胞），不論存在或不存 在羅格列酮或BMP7 (+/-cmpd)。比較⑶31-樣品相比於⑶31+和⑶56+樣品中的暗色條 (MDM+/_cmpd)。
[0039] 圖13展示⑶31-細胞分化成脂肪細胞並且表達UCP1。⑶31-細胞暴露於羅格列 酮或BMP7強勁地增加細胞的分化和UCP1的表達。
[0040] 圖14展示cAMP和β -AR激動劑與PPAR γ激動劑具有對於UCPlmRNA表達的協同 效果。RDM =基本分化培養基+羅格列酮，iso =(-)-異丙腎上腺素。
[0041] 圖15展示如與未分化的BAT祖細胞相比，分化褐色脂肪細胞具有顯著增加水平的 PPAR γ 2mRNA。RDM =基本分化培養基+羅格列酮，iso =(-)-異丙腎上腺素。
[0042] 圖16展示⑶31-細胞的呼吸。與未分化細胞（EGM2,白色條）比較，分化成褐色 脂肪細胞的CD31-細胞（灰色條）具有較高水平的線粒體解偶聯，或質子洩漏（狀態4呼 吸），以及最大（解偶聯）呼吸（狀態3u)。
[0043] 圖17展示通過螢光免疫組織化學對於⑶31-細胞中的UCP1所進行的定量。
[0044] 圖18展示通過多重實時PCR，未分化（EGM2)和分化（羅格列酮或BMP7)⑶31-細 胞中的UCP1 (圖18A，黑色條）、FABP4(圖18B，灰色條）和親環蛋白A mRNA的定量。
[0045] 詳述
[0046] 本公開提供識別和分離各種組織中的BAT祖細胞的方法，在一些實施方案中，所 述方法包括識別人骨骼肌中的常見褐色脂肪細胞祖細胞並且從人骨骼肌樣品中分離這類 細胞。在一些實施方案中，細胞分選可通過細胞表面標誌物如一個或多個群集分化/指定 (〃⑶〃）分子⑶31、⑶34、⑶45、⑶56和⑶146的免疫組織化學分析來完成。⑶31和⑶34可 用於識別內皮細胞。造血細胞和生肌祖細胞可分別基於其細胞表面上的CD45和CD56的識 別來分選。CD146可用於識別周細胞。在一方面，CD34的表達將細胞識別為褐色脂肪細胞 的祖細胞。在另一個方面，CD34+細胞亞群代表迄今為止已知的最純人褐色脂肪細胞祖細 胞。
[0047] 流式細胞術、螢光激活細胞分選（"FACS")和在本領域中已知的其它細胞分選技 術可用於分選從各種組織獲得的細胞並且將BAT祖細胞與其它細胞分離。在本領域中已知 的其它技術之中，多色FACS可用於識別⑶31-⑶34+內皮細胞。另外，⑶146+周細胞、⑶45+ 造血細胞和/或CD56+生肌祖細胞中的一種或多種可分離並且移除。逆轉錄酶聚合酶鏈 反應（"RT-PCR")分析可用於證實⑶34+和⑶146+細胞群體中不存在造血細胞和生肌祖細 胞。
[0048] 申請人:意外地發現祖細胞群體存在於骨骼肌中，並且在一些實施方案中，此群體 發現於骨骼肌但是未發現於白色脂肪組織中，並且在一些實施方案中，僅發現於骨骼肌中 (即，未發現於其它組織中）。骨骼肌可為人或任何動物的骨骼肌，並且祖細胞群體可分散 於骨骼肌中或集中於不連續區域。在一些實施方案中，BAT祖細胞可發現於肌纖維之間。骨 骼肌BAT祖細胞可為固定群體或可在骨骼肌或其它組織內以及不同組織之間和之中移動。 進一步，BAT祖細胞可發現於胎兒、青少年和成人骨骼肌中。
[0049] 本發明教導提供從各種組織中分離的BAT祖細胞。舉例來說，提供從人骨骼肌中 分離的BAT祖細胞。在一些實施方案中，BAT祖細胞發現於骨骼肌中但是未發現於白色脂肪 組織，和/或僅發現於骨骼肌中。一些BAT祖細胞可表達UCP1、線粒體轉錄因子A (mtTFA) 和/或PPAR γ輔助活化劑-1 a (PGC-1 α )以及一種或多種相應mRNA。本公開提供檢測成 人骨骼肌中的BAT祖細胞和/或UCPlmRNA的方法。雖然以前關於成人體內UCP1表達的研 究集中於白色脂肪組織，但是 申請人:公開了具有UCP1表達的高潛力的褐色脂肪祖細胞在 人骨骼肌中的存在和分離。在一些實施方案中，骨骼肌中的BAT祖細胞庫提供調節能量耗 散的機制以治療代謝疾病如肥胖症、糖尿病等。
[0050] 存在於骨骼肌中的祖細胞群體的至少一部分能夠分化成真正的褐色脂肪細胞，並 且在一些實施方案中，存在於骨骼肌中的祖細胞群體的一部分能夠在體外分化成真正的褐 色脂肪細胞。本公開提供擴增BAT祖細胞培養物的方法和使BAT祖細胞分化成真正的BAT 細胞的方法，包括在成脂培養基中使以前分選的細胞分化的方法。在一些實施方案中，分選 的祖細胞分化成褐色脂肪細胞可使用維持白色脂肪細胞分化的條件或使用確定為促進祖 細胞分化成褐色脂肪細胞的試劑來執行。
[0051] 一些實施方案利用UCPl、FABP4(aP2)、PPARy2、線粒體轉錄因子A(mtTFA)和/或 PPAR γ輔助活化劑-1 a (PGC-1 α )以及一種或多種相應mRNA的存在來識別開始至少部分 地分化的BAT祖細胞。高代謝率或高水平解偶聯呼吸、葡萄糖利用、脂肪酸氧化或前述特性 彼此或與其它特性的組合可用於識別開始至少部分地分化的BAT祖細胞。出於本公開目 的，開始至少部分地分化成褐色脂肪細胞的BAT祖細胞被稱為"分化的褐色脂肪細胞"。
[0052] 舉例來說，確定為表達⑶34標誌物的細胞（即⑶34+細胞）可分化成褐色脂肪細 胞，通過在含有0. 86 μ Μ胰島素、10 μ g/ml轉鐵蛋白、0. 2nM三碘甲腺原氨酸、1 μ Μ羅格列 酮、100 μ M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μ Μ地塞米松和1 %青黴素-鏈黴素的DMEM-漢氏 F-12培養基中培養。其它試劑也可用於促進祖細胞分化成褐色脂肪細胞。在一些實施方案 中，根據本公開教導來識別的試劑用於促進祖細胞分化成褐色脂肪細胞。在一些實施方案 中，分化的褐色脂肪細胞展現高水平UCP1表達、高水平解偶聯呼吸和/或高代謝率。
[0053] 在另一個實例中，與⑶34+細胞（即，包括⑶34+⑶31-細胞和⑶34+⑶31+細胞） 相比，表達⑶34標誌物但是大致上不含⑶31標誌物的細胞（即，⑶34+⑶31-細胞）可代 表更純ΒΑΤ祖細胞群體。在某些實施方案中，不含有PPARY激動劑（例如，羅格列酮）的 成脂分化培養基，稱為基本分化培養基（MDM)，證明足以誘導至少一定比例脂肪細胞祖細 胞的分化。MDM的組成為：DMEM/漢氏F-1250/50混合物（3. 151g/l，17. 5mM右旋葡萄糖， 3. 651g/l 左旋谷醯胺）（Cellgro#10-090-CV)、5 μ g/ml (0· 86 μ M)胰島素、10 μ g/ml 轉鐵蛋 白、0. 2nM3, 3'，5-三碘-L-甲狀腺素、100 μ M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μ Μ地塞米松、1 % 青黴素-鏈黴素。
[0054] 本公開提供增加 ΒΑΤ祖細胞、分化褐色脂肪細胞或兩者中的UCPlmRNA表達的方 法。舉例來說，試劑如細胞滲透cAMP衍生物和過氧化物酶體增殖物活化受體-γ (PPAR γ ) 激動劑可用於增加 BAT祖細胞、分化褐色脂肪細胞或兩者中的UCPlmRNA表達。增強的UCP1 表達可通過在本領域中已知的方法來確定，包括通過定量RT-PCR來測量UCPlmRNA。用於 UCPlmRNA的RT-PCR分析中的示例性引物以SEQ ID N0:1-4和11-12形式來提供。
[0055] 與未暴露於成脂培養基的BAT祖細胞相比，暴露於成脂培養基的BAT祖細胞可含 有較高水平UCPImRNA。親環蛋白mRNA水平可充當評估細胞中的UCPImRNA豐度的歸一化值 (反映細胞數量或RNA總量）。在一些實施方案中，未暴露於成脂培養基的BAT祖細胞中的 UCPlmRNA水平使用RT-PCR不可檢測到，而分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平可檢測到 並且可相對於親環蛋白mRNA水平來歸一化。作為UCP1表達的比較測量，分化褐色脂肪細 胞中的UCPlmRNA水平可與培養小鼠褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平相比較。本公開提供 培養小鼠褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平約25 %的分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水 平，而在其它實施方案中，UCPlmRNA水平是培養小鼠褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平的約 25 ± 10 %或約15 %至約30 %。本公開涵蓋培養小鼠褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平約5 % 至約100%範圍內的分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平。在一些實施方案中，UCPlmRNA 水平可超過培養小鼠褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平的100%。
[0056] 與相同種類或相同個體成人骨骼肌活檢中的細胞相比，分化褐色脂肪細胞可含有 顯著較高水平的UCPlmRNA。另外，分化褐色脂肪細胞中的UCP1蛋白質的數量可與相同種 類或相同個體胎兒BAT中的UCP1蛋白質的數量近似相等。本公開涵蓋人分化褐色脂肪細 胞中的UCPlmRNA水平與體內人褐色脂肪細胞的UCPlmRNA水平近似相等。在一些實施方案 中，人分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA水平可在體內人褐色脂肪細胞的UCPlmRNA水平的 約1%直至比其大許多倍的範圍內。
[0057] 本公開提供增加 BAT祖細胞、分化褐色脂肪細胞或兩者中的UCPlmRNA水平的方 法。在一些實施方案中，所述方法提供選擇性增加 BAT祖細胞、分化褐色脂肪細胞或兩者 中的UCPlmRNA水平。PPARY激動劑可刺激骨骼肌和分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA產 生。舉例來說，在一些實施方案中，PPARY激動劑羅格列酮選擇性刺激骨骼肌或分化褐色 脂肪細胞中的UCPlmRNA產生。細胞滲透cAMP衍生物可刺激均骨骼肌和分化褐色脂肪細胞 中的UCPlmRNA產生。舉例來說，在一些實施方案中，細胞滲透cAMP衍生物8-溴-cAMP選 擇性刺激骨骼肌或分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA產生，而在一些實施方案中，細胞滲透 cAMP衍生物（4-氯苯基硫代）-cAMP選擇性刺激骨骼肌或分化褐色脂肪細胞中的UCPlmRNA 產生。舉例來說，在一些實施方案中，PPARy激動劑羅格列酮和細胞滲透cAMP類似物二丁 醯-cAMP或β-AR激動劑（-)-異丙腎上腺素的組合可另外選擇性刺激骨骼肌或分化褐色 脂肪細胞中的UCPlmRNA產生（圖14)。
[0058] 線粒體轉錄因子A( "mtTFA"）和過氧化物酶體增殖物活化受體輔助活化 劑-la ("PGC-la "）涉及控制線粒體發生。分化褐色脂肪細胞可含有大量mtTFA、PGC_la 或兩者。本公開提供如與未分化的BAT祖細胞相比，具有顯著增加水平的mtTFA mRNA、 PGC-1 a mRNA或兩者的分化褐色脂肪細胞。線粒體標誌物細胞色素氧化酶IV(COXIV)涉及 線粒體呼吸鏈。本公開提供如與未分化的BAT祖細胞相比具有顯著增加水平的COX IV mRNA 的分化褐色脂肪細胞。脂肪酸結合蛋白-4( "FABP4"或"aP2"）和過氧化物酶體增殖物活 化受體-Y2( "PPARY 2"）基因只表達於脂肪細胞（褐色和白色）中。分化褐色脂肪細胞 可含有大量FABP4、PPAR γ 2或兩者。本公開提供如與未分化的BAT祖細胞相比具有顯著增 加水平的FABP4mRNA、PPAR γ 2mRNA或兩者的分化褐色脂肪細胞。舉例來說，圖15展示在由 RDM誘導的分化後，RDM+cAMP或RDM+iso、PPAR γ 2mRNA水平分別增加10. 4倍、9. 2倍和6. 8 倍。
[0059] 根據一些實施方案的分化褐色脂肪細胞具有高水平的解偶聯呼吸和/或高代謝 率。當質子跨越線粒體內膜洩漏而非穿過三磷酸腺苷合成酶（"ATP合成酶"）酶以驅動三 磷酸腺苷（"ATP"）的產生時，可發生解偶聯呼吸。在跨越膜的質子電化學梯度中通過質 子運動釋放的能量以熱量形式耗散，而不是在製造 ATP的過程中耗散。解偶聯呼吸可隨著 細胞呼吸的部分（例如，氧消耗）的變化來測量，其獨立於通過ATP合成酶的ATP形成而發 生。舉例來說，在阻斷ATP合成酶功能的寡黴素的存在下，氧化磷酸化的電子傳遞鏈中的氧 消耗提供解偶聯呼吸的度量。
[0060] 本公開提供如與未分化的BAT祖細胞相比，具有顯著增加水平的解偶聯呼吸的分 化褐色脂肪細胞。在一些實施方案中，本公開提供具有總呼吸的約50%的解偶聯呼吸水平 的分化褐色脂肪細胞。一些實施方案展現總呼吸的約20%至約50%範圍內的水平的解偶 聯呼吸。使用成人白色脂肪細胞中的解偶聯呼吸水平作為比較標準，一些實施方案展現比 成人白色脂肪細胞大約1. 5至約3. 5倍範圍內的解偶聯呼吸。在一些實施方案中，解偶聯 呼吸水平比成人白色脂肪細胞大約2. 5倍。本公開尤其提供分化褐色脂肪細胞，這些細胞 經過配備可經由氧化磷酸化的解偶聯來代謝葡萄糖、氧化脂肪酸，並且以熱量形式來耗散 能量。
[0061] 本公開提供在體外和體內促進BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞的條件和試劑（例 如，化合物、蛋白質、生物材料等）。在一些實施方案中，分化促進試劑為：PPARY活化劑、 調節劑或抑制劑（例如，羅格列酮）、PPARa活化劑或調節劑（例如，氯貝丁酯、GW9578)、 PPARS活化劑或調節劑（例如，GW501516或GW0742)、雙重PPARa和PPARS活化劑或 調節劑、泛_PPAR( a、δ、γ )活化劑或調節劑（例如，GW4148)、TOE1抑制劑（例如，長春 西汀或IBMX)、TOE3抑制劑（例如，氰胍佐旦或IBMX)、TOE4抑制劑（例如，咯利普蘭或 IBMX)、PDE7 抑制劑（例如，BMS586353 或 BRL50481 或 IBMX)、前列腺素 J2、9 a，11 β -前列 腺素 F2、9 β，11 a -前列腺素 F2、由垂體腺苷酸環化酶活化多肽（ADCYAP1或PACAP)基因 衍生的肽（PACAP 前肽、PACAP 相關肽、PACAP-38 或 PACAP-27)、二丁醯-cGMP、8-溴-cGMP、 NRIP1(RIP140)抑制劑、PTEN抑制劑（例如，雙過氧（聯吡啶）氧代釩酸鉀或雙過氧（5-羥 基吡啶-2-羧基）氧代釩酸二鉀）、a 1-腎上腺素能完全或部分激動劑（例如，苯福林 或西拉唑啉）、a 2-腎上腺素能拮抗劑（例如，育亨賓）、RXRa活化劑或調節劑（例如， LGD1069(Targretin)或9-順式維A酸）、PGC-la活化劑、PGC-Ιβ抑制劑或活化劑、脂肪 連接蛋白或脂肪連接蛋白受體AdipoRl和/或Adip 〇R2的活化劑、N0S抑制劑或活化劑（例 如，1400W、2-乙基-2-異硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME)或腺苷）、Rho激酶-ROCK 抑制劑（例如，法舒地爾、HA1077)、BDNF、單胺氧化酶（MAO)A抑制劑和/或MAO B抑制劑 (例如，異卡波肼、嗎氯貝胺、司立吉林）、SRC的活化劑、EGFR的抑制劑（例如，RG-14620、厄 洛替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白質）、FAAH的抑制劑（例如，URB597)、MAPK1 (例 如，TO98059)或2 (例如，PD98059)或4或5或7或8 (例如，PD98059)的抑制劑、CDK9的 抑制劑（例如，1，5, 6, 7-四氫-2-(4-吡啶基）-4H-吡咯並[3, 2-c]吡啶-4-酮鹽酸鹽）、 TGR5激動劑（例如，齊墩果酸）、AMPK活化劑（例如，AICAR)、BMP-7、mT0R抑制劑（例如，雷 帕黴素）、腺苷酸環化酶活化劑（例如，毛喉素）、福莫特羅、沙丁胺醇、安非他酮、REV-5901、 24 (S)-羥基膽固醇、1，25-二羥維生素 D3、24, 25-二羥維生素 D3、前列腺素 J2、15d-前列腺 素 J2、9a, 11β-前列腺素 F2、9P, 11a-前列腺素 F2、二十碳三烯酸（20:3n-9)、二十二碳 六烯酸（22:6n-3)、二十二碳三烯酸（22:3n-3)、二十二碳五烯酸、溶血磷脂酸、米酵菌酸、 3-溴-7-硝基吲唑、孕烯醇酮16a腈、地棘蛙素、C0X-2抑制劑（例如，NS-398)，或任何前述 試劑的組合。
[0062] 在一些實施方案中，受試者包括人受試者用羅格列酮的治療導致受試者骨骼肌中 的UCPlmRNA產量增加。在一些實施方案中，受試者用羅格列酮治療可誘導骨骼肌中的褐色 脂肪細胞出現或分化、增強骨骼肌中的現有褐色脂肪細胞中的UCP1基因的表達，或兩者。 舉例來說，在一些實施方案中，骨骼肌中的褐色脂肪細胞的出現或分化可在患有代謝疾病 的受試者中誘導。褐色脂肪細胞可提供具有高線粒體和細胞呼吸和脂肪酸氧化率的葡萄糖 接收器（glucose sink)，以熱量形式耗散能量（解偶聯氧化磷酸化）。受試者代謝率可增 強，並且可誘導體重降低。誘導褐色脂肪細胞的出現或分化還可產生胰島素敏感性、血糖穩 態和心血管疾病風險因素的改善。褐色脂肪細胞可進一步分泌有助於增加胰島素敏感性和 改善血糖穩態或心血管健康的因子。
[0063] 本公開還提供允許識別試劑（例如，化合物、蛋白質、生物材料等）的測定，這些試 劑促進BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞和/或誘導UCP1基因在體外、體內或兩者下的表 達。這類試劑可通過篩選化合物、蛋白質、生物材料等來識別。舉例來說，在一些實施方案 中，分離的CD34+細胞可用於針對誘導UCP1基因表達和/或CD34+細胞分化成褐色脂肪細 胞的能力來對試劑進行篩選。用這種方式識別的試劑可用於各種研究、診斷和治療用途，包 括例如治療代謝疾病如肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常等。在一些實施方案中， 通過根據本公開的測定來識別的試劑加以優化以改善其物理化學和/或藥代動力學性質。
[0064]在體外和體內的 BAT 祖細胞中的 UCPl、FABP4(aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC_l α 和 / 或COX IV的表達可根據本公開提供的方法來增強。在一些實施方案中，暴露於成脂培養基 可用於刺激 BAT 祖細胞中的 UCP1、FABP4 (aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC-1 α 和 / 或 COX IV 的 表達增加。試劑如PPARY活化劑、調節劑或抑制劑（例如，羅格列酮）、PPARa活化劑或調 節劑（例如，氯貝丁酯、GW9578)、PPARS活化劑或調節劑（例如，GW501516或GW0742)、雙重 PPARa和PPAR δ活化劑或調節劑、泛-PPAR( a、δ、Y )活化劑或調節劑（例如，GW4148)、 TOE1抑制劑（例如，長春西汀或ΙΒΜΧ)、TOE3抑制劑（例如，氰胍佐旦或ΙΒΜΧ)、TOE4抑制 劑（例如，咯利普蘭或IBMX)、TOE7抑制劑（例如，BMS586353或BRL50481或IBMX)、前列 腺素 J2、9 a，11 β -前列腺素 F2、9 β，11 a -前列腺素 F2、由垂體腺苷酸環化酶活化多肽 (ADCYAP1 或 PACAP)基因衍生的肽（PACAP 前肽、PACAP 相關肽、PACAP-38 或 PACAP-27)、 NRIP1(RIP140)抑制劑、PTEN抑制劑（例如，雙過氧（聯吡啶）氧代釩酸鉀或雙過氧（5-羥 基吡啶-2-羧基）氧代釩酸二鉀）、a 1-腎上腺素能完全或部分激動劑（例如，苯福林 或西拉唑啉）、a 2-腎上腺素能拮抗劑（例如，育亨賓）、RXRa活化劑或調節劑（例如， LGD1069(Targretin)或9-順式維A酸）、PGC-la活化劑、PGC-Ιβ抑制劑或活化劑、脂肪 連接蛋白或脂肪連接蛋白受體AdipoRl和/或Adip 〇R2的活化劑、N0S抑制劑或活化劑（例 如，1400W、2-乙基-2-異硫脲或NG-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME)或腺苷）、Rho激酶-ROCK 抑制劑（例如，法舒地爾、HA1077)、BDNF、單胺氧化酶（MAO)A抑制劑和/或MAO B抑制劑 (例如，異卡波肼、嗎氯貝胺、司立吉林）、SRC的活化劑、EGFR的抑制劑（例如，RG-14620、厄 洛替尼或ZD1839-吉非替尼或Argos蛋白質）、FAAH的抑制劑（例如，URB597)、MAPK1 (例 如，TO98059)或2 (例如，PD98059)或4或5或7或8 (例如，PD98059)的抑制劑、CDK9的 抑制劑（例如，1，5, 6, 7-四氫-2-(4-吡啶基）-4H-吡咯並[3, 2-c]吡啶-4-酮鹽酸鹽）、 TGR5激動劑（例如，齊墩果酸）、AMPK活化劑（例如，AICAR)、BMP-7、mT0R抑制劑（例如，雷 帕黴素）、腺苷酸環化酶活化劑（例如，毛喉素）、福莫特羅、沙丁胺醇、安非他酮、REV-5901、 24 (S)-羥基膽固醇、1，25-二羥維生素 D3、24, 25-二羥維生素 D3、前列腺素 J2、15d-前列腺 素 J2、9a, 11β-前列腺素 F2、9P, 11a-前列腺素 F2、二十碳三烯酸（20:3n-9)、二十二碳 六烯酸（22:6n-3)、二十二碳三烯酸（22:3n-3)、二十二碳五烯酸、溶血磷脂酸、米酵菌酸、 3-溴-7-硝基吲唑、孕烯醇酮16a腈、地棘蛙素、C0X-2抑制劑（例如，NS-398)或其組合也 可用於刺激 BAT 祖細胞中的 UCP1、FABP4 (aP2)、PPAR γ 2、mtTFA、PGC-1 α 和 / 或 COX IV 表 達增加。 實施例
[0065] 本發明教導的方面可進一步鑑於以下實施例來了解，這些實施例不應被視為以任 何方式限制本發明教導的範圍。
[0066] 實施例1 :肌肉血管細胞的分詵和分化。
[0067] 在胎兒骨骼肌中，通過免疫組織化學發現⑶34和⑶146分別表達於內皮細胞和周 細胞的表面，但是⑶34也由分散於肌原纖維間空間中的細胞來表達。已經發現⑶146+周 細胞包圍⑶34+內皮細胞。在成人骨骼肌中觀察到⑶34+和⑶146+細胞的類似分布。 [0068] 來自七個獨立胎兒肌肉（妊娠16-24周）的血管細胞使用多色螢光活化細胞分 選（FACS)來分選。如同生肌祖細胞（⑶56+) -樣，首先將造血（⑶45+)細胞選出。然後， 分選內皮細胞（CD34+/CD146-)和周細胞（CD34-/CD146+)。其後將 CD34+/CD146-/CD45-/ ⑶56-指定為⑶34+細胞，並且⑶34-/⑶146+/⑶45-/⑶56-指定為⑶146+細胞。圖1A展示 CD34+/CD146-和 CD34-/CD146+ 細胞純化。分離的細胞用 PE-抗-CD34、FITC-抗-CD146、 PE-Cy7-抗-CD56和APC-Cy7-抗-CD45抗體染色並且在FACS Aria細胞分選儀上運作。在 排除⑶45+和⑶56+細胞（左圖）之後，將⑶34+或⑶146+門控內部的細胞分離。⑶34+ 細胞達起始胎兒肌細胞群體的8+1 %。
[0069] 圖 1B 展示對於 CD34+/CD146-/CD45-/CD56-(CD34)、CD34-/CD146+/CD45-/ ⑶56-(⑶146)和總未分選的細胞的RT-PCR分析。肌動蛋白mRNA作為對照來測量。⑶34+ 細胞顯示未受可檢測的⑶45+造血或⑶56+生肌細胞汙染。
[0070] 分選細胞在EGM2培養基中生長4-6天，並且在成脂培養基中生長8-12天，如在材 料和方法中所描述。這些條件維持WAT原代培養物中的白色脂肪細胞分化。圖2展示原代 培養物（PC)中的CD34+(圖2A)和CD146+(圖2B、圖2C)細胞和在培養物中擴增直至繼代 3(P3)的CD34+(圖2D)細胞。實質上所有分選胎兒肌肉CD34+細胞分化成脂肪細胞樣多腔 細胞（圖2A、2D)。顯著地，在細胞培養物中，多腔結構由白色和褐色脂肪細胞共有。相比之 下，胎兒肌肉CD146+細胞在如上所述條件下成長非常緩慢。其未達到細胞融合併且展示周 細胞樣外觀，特徵在於大尺寸、擴展開的形狀和不規則邊界（圖2B和2C)。可檢測到偶然的 多腔細胞（圖2C)在如上所述的條件下在培養物中擴增直至3繼代（4周）的CD34+細胞 的形態類似於在原代培養物中觀察到的形態，但是成熟脂肪細胞的尺寸較小（圖2D)。
[0071] 在某些實施方案中，⑶45+細胞和/或⑶56+細胞可保持於⑶34+/⑶146-群體 中；也就是說，在不首先選出⑶45+細胞和⑶56+細胞中的至少一個的情況下分選⑶34+/ ⑶146-細胞。已經觀察到⑶45+和⑶56+群體可相對較小（例如，每個群體小於來自肌肉 的總間質血管細胞的5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1% )。因此，可分離相對純 褐色脂肪細胞祖細胞群體而不需要選出⑶45+和⑶56+群體中的至少一個。此外，⑶45+ 細胞是造血祖細胞並且在成脂培養基中不顯著生長或分化。CD56+細胞是肌肉前體並且在 成脂培養基中不顯著生長或分化。因此，CD45+細胞和/或CD56+細胞的存在不顯著影響 CD34+細胞的增殖和/或分化。
[0072] 實施例2 :培養CD34+細朐中的UCP1表汰。
[0073] 胎兒肌肉CD34+細胞的顯著脂肪細胞樣分化是進一步表徵的誘因。引人關注的 是，定量RT-PCR顯示這些細胞中的較高水平UCPlmRNA。圖2E展示原代培養物（PC)或擴 增直至繼代3(P3)中的⑶34+細胞中的UCP1 (空列）和瘦蛋白（灰色列）mRNA表達的定 量RT-PCR確定。相對於親環蛋白A歸一化的平均UCPlmRNA水平是1797±510任意單位 (即，使用相應親環蛋白A值來歸一化的任意值土 s. e. m. ;n = 4-7)，對應於相對於測定中 的25ng cDNA，周期閾值（Ct)為22。
[0074] 出於比較，培養物中分化的小鼠褐色脂肪細胞中的相對於親環蛋白A歸一化的平 均UCPlmRNA水平是7715±2649 (η = 10)任意單位。因此，人⑶34+細胞中的UCPlmRNA水 平達小鼠褐色脂肪細胞培養物中的UCPlmRNA水平的幾乎四分之一。人胎兒BAT不用作定 量RT-PCR分析的陽性對照，因為由於終止妊娠之後過去的時間，RNA降解風險較高。將克隆 擴增子並且測序，並且發現與人UCP1100%相同。在擴增直至繼代3的胎兒肌肉⑶34+細胞 中，仍然觀察到原代培養細胞中所檢測的UCPlmRNA表達水平43 %的高UCPlmRNA表達。在 未分化胎兒肌肉CD34+細胞中或在原代培養物的CD146+細胞中，未檢測到UCPlmRNA表達。 在原代培養和擴增細胞中，瘦蛋白mRNA水平分別是9. 9 ±5. 5和71 ±52任意單位（圖2E)。
[0075] 實施例3 :⑶34+細朐的額外表型。
[0076] 為了更好地表徵培養物中擴增的胎兒肌肉⑶34+細胞的基因表達模式，執行基因 晶片分析。具有顯著檢測P值（P〈〇. 01)的若干代表基因 mRNA的表達水平展示於表1並 且與人肌肉活檢中的那些表達水平比較。選擇以下蛋白質mRNA :UCP1作為參考基因，涉及 控制生熱作用和線粒體發生的線粒體轉錄因子A (mtTFA)和過氧化物酶體增殖物活化受體 (PPAR γ )和PPAR γ輔助活化劑-1 a (PGC-1 α )、線粒體呼吸鏈琥珀酸脫氫酶（SDH)和細胞 色素氧化酶IV (COX IV)、脂肪酸降解途徑的酶、肉鹼棕櫚醯轉移酶IB (CPT1B)、醯基-輔酶A 脫氫酶長鏈（ACAD)和C-4至C-12直鏈（ACADM)，和骨骼肌標誌物肌細胞生成素、生肌因子 5 (Myf5)和生肌分化1 (MyoDl)。在BAT中高度表達並且可充當UCP1活性[16]抑制因子的 Cidea選擇為BAT標誌物。這些基因的GenBank登記號展示於補充數據中。
[0077] 表 1
[0078]

【權利要求】
1. 一種褐色脂肪組織（BAT)祖細胞， 其中所述BAT祖細胞從人骨骼肌中分離並且能夠分化成褐色脂肪細胞， 其中所述BAT祖細胞表達與內皮細胞相關的第一細胞表面標誌物，所述第一細胞表面 標誌物在基於抗體的測定中使用第一抗體可檢測到；並且 其中所述BAT祖細胞大致上不含與內皮細胞相關的第二細胞表面標誌物，所述第二細 胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第二抗體大致上不可檢測到。
2. 如權利要求1所述的BAT祖細胞，其進一步包括以下各項中的至少一個： 其中所述BAT祖細胞大致上不含與造血細胞相關的第三細胞表面標誌物，所述第三細 胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第三抗體大致上不可檢測到； 其中所述BAT祖細胞大致上不含與生肌細胞相關的第四細胞表面標誌物，所述第四細 胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第四抗體大致上不可檢測到；和/或 其中所述BAT祖細胞大致上不含與周細胞相關的第五細胞表面標誌物，所述第五細胞 表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用第五抗體大致上不可檢測到。
3. 如權利要求1或2所述的BAT祖細胞，其中所述第一細胞表面標誌物是CD34並且所 述第一抗體是抗-⑶34抗體。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述第二細胞表面標誌物是 ⑶31並且所述第二抗體是抗-⑶31抗體。
5. 如權利要求2至4中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述第三細胞表面標誌物是 ⑶45並且所述第三抗體是抗-⑶45抗體。
6. 如權利要求2至5中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述第四細胞表面標誌物是 ⑶56並且所述第四抗體是抗-⑶56抗體。
7. 如權利要求2至6中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述第五細胞表面標誌物是 ⑶146並且所述第五抗體是抗-⑶146抗體。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述BAT祖細胞在增殖培養基 中增殖。
9. 如權利要求8所述的BAT祖細胞，其中所述增殖培養基包括骨形態形成性蛋白 質-7(BMP7)。
10. 如權利要求1至9中任一項所述的BAT祖細胞，其中所述BAT祖細胞在分化培養基 中分化成褐色脂肪細胞。
11. 如權利要求10所述的BAT祖細胞，其中所述分化培養基是基本分化培養基（MDM)。
12. 如權利要求10所述的BAT祖細胞，其中所述分化培養基包括過氧化物酶體增殖物 活化受體Y (PPARY)激動劑。
13. -種從骨骼肌中分離的細胞群體，其包括至少一種如權利要求1至12中任一項所 述的BAT祖細胞。
14. 一種用於識別BAT祖細胞的方法，其包括： 提供從骨骼肌分離的細胞群體； 使所述細胞群體與分別對於第一和第二細胞表面標誌物具有特異性的第一和第二抗 體接觸，其中所述第一和第二細胞表面標誌物各自與內皮細胞相關；並且 在基於抗體的測定中確定表達第一細胞表面標誌物並且大致上不含第二細胞表面標 志物的BAT祖細胞。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述第一細胞表面標誌物是CD34並且所述第一抗 體是抗-⑶34抗體。
16. 如權利要求14或15所述的方法，其中所述第二細胞表面標誌物是CD31並且所述 第二抗體是抗-CD31抗體。
17. 如權利要求14至16中任一項所述的方法，其進一步包括以下各項中的至少一個： 使所述細胞群體與對於與造血細胞相關的第三細胞表面標誌物具有特異性的第三抗 體接觸，所述第三細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用所述第三抗體大致上不可 檢測到； 使所述細胞群體與對於與生肌細胞相關的第四細胞表面標誌物具有特異性的第四抗 體接觸，所述第四細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用所述第四抗體大致上不可 檢測到；和/或 使所述細胞群體與對於與周細胞相關的第五細胞表面標誌物具有特異性的第五抗體 接觸，所述第五細胞表面標誌物在所述基於抗體的測定中使用所述第五抗體大致上不可檢 測到。
18. 如權利要求17所述的方法，其中所述第三細胞表面標誌物是CD45並且所述第三抗 體是抗-⑶45抗體。
19. 如權利要求17或18所述的方法，其中所述第四細胞表面標誌物是CD56並且所述 第四抗體是抗-CD56抗體。
20. 如權利要求17至19中任一項所述的方法，其中所述第五細胞表面標誌物是CD146 並且所述第五抗體是抗-⑶146抗體。
21. 如權利要求14至20中任一項所述的方法，其進一步包括通過選擇表達所述第一細 胞表面標誌物並且不表達所述第二細胞表面標誌物的細胞來分離所述細胞群體。
22. 如權利要求14至21中任一項所述的方法，其進一步包括通過選擇表達所述第一細 胞表面標誌物並且不表達第二細胞表面標誌物，以及第三、第四和第五細胞表面標誌物中 的至少一個細胞表面標誌物的細胞來分離所述細胞群體。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述選擇包括選擇表達⑶34並且不表達⑶31、 CD45、CD56 或 CD146 的細胞。
24. 如權利要求14至23中任一項所述的方法，其進一步包括分離所述BAT祖細胞。
25. 如權利要求14至24中任一項所述的方法，其進一步包括在增殖培養基中培養所述 BAT祖細胞，從而離體擴增BAT祖細胞。
26. -種用於誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞的方法，其包括： 提供如權利要求1至13中任一項所述的BAT祖細胞； 使所述BAT祖細胞暴露於分化培養基；並且 在所述分化培養基中培養所述BAT祖細胞以誘導所述BAT祖細胞分化成褐色脂肪細 胞。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述分化培養基是基本分化培養基（MDM)。
28. 如權利要求26或27所述的方法，其中所述分化培養基包括過氧化物酶體增殖物活 化受體Y (PPARY)激動劑。
29. 如權利要求26至28中任一項所述的方法，其進一步包括使所述BAT祖細胞暴露於 增殖培養基。
30. 如權利要求29所述的方法，其中所述增殖培養基包括骨形態形成性蛋白 質-7(BMP7)。
31. 用於治療個體的代謝疾病或病狀的BAT祖細胞， 其中： 所述BAT祖細胞從所述個體或供體的骨骼肌中獲得； 所述BAT祖細胞通過在培養基中培養來繁殖；並且 將所述培養的細胞移植至所述個體。
32. 如權利要求31所述的BAT祖細胞，其中經由在分化培養基中離體培養來誘導所述 BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞。
33. 如權利要求31或32所述的BAT祖細胞，其中所述代謝疾病是肥胖症、超重、葡萄糖 耐量受損、胰島素抵抗、2型糖尿病、血脂異常、高血壓、心血管疾病、代謝症候群、帕-魏二 氏綜合症或1型糖尿病。
34. -種用於識別誘導BAT祖細胞分化成褐色脂肪細胞的試劑的方法，其包括： 提供如權利要求1至13中任一項所述的BAT祖細胞； 使所述BAT祖細胞與試劑接觸； 確定是否所述BAT祖細胞表現出分化成褐色脂肪細胞的指標。
35. 如權利要求34所述的方法，其中所述分化指標可為以下各項中的一個或多個的增 加：UCP1蛋白質或mRNA的表達、FABP4(aP2)蛋白質或mRNA的表達、PPARY2蛋白質或mRNA 的表達、mtTFA蛋白質或mRNA的表達、PGC-1 α蛋白質或mRNA的表達、解偶聯呼吸、呼吸率、 代謝率、葡萄糖利用率、脂肪酸氧化率和其組合。
36. -種用於識別誘導UCP1的表達或活性水平的試劑的方法，其包括： 提供如權利要求1至13中任一項所述的BAT祖細胞； 使所述BAT祖細胞與試劑接觸； 確定是否所述BAT祖細胞表現出UCP1表達或活性的增加。
37. -種使用如權利要求34至36中任一項所述的方法來識別的試劑，其用於製造治療 患者的代謝疾病的藥物。
38. -種使用如權利要求34至36中任一項所述的方法來識別的試劑，其用於製造治療 或預防患者的體溫過低的藥物。
【文檔編號】G01N33/48GK104066836SQ201280055539
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2012年11月9日 優先權日:2011年11月10日
【發明者】奧利弗·D·博斯, 米哈埃拉·克裡桑, 讓-保羅·賈科比諾 申請人:釋放能量醫藥股份有限公司, 奧利弗·D·博斯, 米哈埃拉·克裡桑, 讓-保羅·賈科比諾