一種pd-1蛋白胞外段親和肽l8及其應用的製作方法

2023-04-28 23:38:21

一種pd-1蛋白胞外段親和肽l8及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明基因工程醫學【技術領域】，具體涉及一種PD-1蛋白胞外段的親和肽L8及其應用。該親和肽L8的胺基酸序列為：Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser，即：S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S，分子量為1293.7。該親和肽L8在製備抗腫瘤相關藥物中應用，所述腫瘤為結腸癌瘤或黑色素瘤。該親和肽L8採用Fomc固相多肽合成法合成。本發明所獲得的PD-1蛋白胞外段親和肽L8，作用目標明確，對腫瘤的抑制效果明顯，尤其是對結腸癌或黑色素瘤的抑瘤效果顯著，且無明顯副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，因而具有較好的醫療應用前景。
【專利說明】—種PD-1蛋白胞外段親和肽L8及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程醫學【技術領域】，具體涉及一種ro-1蛋白胞外段的親和肽L8及其應用。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著全球經濟科技的飛速發展，環境問題越來越惡劣，從而使人類的健康受到很大的威脅，尤其是近幾十年來癌症患者的數目直線增長，但傳統的手術治療、放療、化療的技術已經不能取得很好的療效或者是預後性較差。因此，尋找新的治療手段和治療藥物一直是全球範圍內的研究熱點。與傳統的治療方法相比，腫瘤免疫治療能夠激活或者誘導腫瘤患者建立起對腫瘤抗原的特異性免疫應答，清除原發的腫瘤細胞，並且建立免疫記憶，阻止腫瘤的復發和轉移。
[0003]在腫瘤免疫治療中，效應T細胞是主要的殺傷腫瘤的細胞,但T細胞的激活需要兩個信號的刺激，第一信號是識別信號，即腫瘤抗原等內源性抗原被樹突狀細胞(DC)等抗原遞呈細胞(APC)加工處理後以MHC/表位複合物的形式遞呈至APC的表面，該複合物能被T細胞表面的T細胞受體(TCR)識別，從而形成了激活T細胞的第一信號；與此同時，T細胞和APC表面表達的多對共刺激分子相互作用產生了 T細胞活化的第二信號。
[0004]根據產生的效 應不同，可將共刺激分子分為正性共刺激分子和負性共刺激分子。在正性共刺激分子中，最重要的是⑶28和ICOS等分子；在負性共刺激分子中，最重要的是 CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CD152)和 PD-1 (程序性死亡-1,programmed death-1,⑶279)等分子。在腫瘤免疫治療過程中，負性共刺激分子主要介導免疫耐受和逃逸。
[0005]ro-1分子最早是通過削減雜交技術從小鼠處於凋亡狀態的雜交瘤及造血祖細胞系克隆得到的，它被認為與細胞凋亡相關，因而命名為程序性死亡-1 (programmeddeath-1)，在2004年12月第八屆國際人類白細胞分化抗原會議上被命名為⑶279。PD-1共有288個胺基酸組成，相對分子質量是55000，是一種跨膜糖蛋白，其胞外區包含一個IgV樣結構域，有4個重要的N連接糖基化位點，並被重度糖基化。PD-1及其配體I3D-Ll是T細胞活化過程中一對重要的負性共刺激分子，在誘導T細胞無能和免疫耐受維持方面起著非常重要的作用，並介導了腫瘤免疫耐受和逃逸。
[0006]PD-1是一種免疫球蛋白超家族激活誘導的抑制性受體。前人在腫瘤免疫治療過程中遇到的最大挑戰就是由於腫瘤免疫耐受和逃逸所導致的療效不佳。因此，研究通過抑制負性共刺激分子所介導的信號通路以打破機體已經建立的對腫瘤細胞的免疫耐受具有重要的理論意義和應用價值。

【發明內容】

[0007]本發明提供了一種ro-Ι蛋白胞外段的親和肽L8，並經過實驗證明了該親和肽L8具有抗腫瘤活性。[0008]本發明採取的技術方案如下:
一種F1D-1蛋白胞外段的親和肽L8,其胺基酸序列為:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-SerJP:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T_S，分子量為 1293.7。
[0009]所述PD-1蛋白胞外段的親和肽L8在製備抗腫瘤相關藥物中應用，所述腫瘤為結腸癌瘤或黑色素瘤，所述抗腫瘤為抑制腫瘤生長或消除腫瘤。
[0010]所述F1D-1蛋白胞外段的親和肽L8採用Fomc固相多肽合成法合成,簡要步驟如下: (1)選用Rink樹脂與待合成肽即I3D-1親和肽L8的C端的第一個Fmoc-胺基酸羧基以共價鍵形式連接，再以該胺基酸的N端作為該條多肽合成的起點，並讓其與下一個胺基酸的羧基端發生脫水縮合反應，形成肽鍵；
(2)然後，將N端的Fmoc-胺基酸的保護基進行脫保護，再讓第二個胺基酸的N端與後面的胺基酸的羧基反應，如此不斷重複這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最後，將合成的多肽從樹脂上切割下來，經過乙醚沉澱與洗滌，得到粗肽；
(4)經脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，得純度大於95%的本發明Η)_1親和肽L8。
[0011]本發明所提供的ro-1蛋白胞外段親和肽L8是通過固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作時所獲得的；通過對其進一步的動物實驗驗證，其對腫瘤的抑制效果明顯，無明顯副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，具有較好的醫療應用前景。ro-1蛋白胞外段親和肽L8的製備方法較為成熟、完善，便於製備相應的生物醫藥製品，因而本發明具有較好的實際應用推廣意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8的ES1-MS質譜分析鑑定結果；
圖2為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠體重變化的影響結果圖；圖3為ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠移植瘤體積變化的影響結果圖；
圖4為Η)-1蛋白胞外段親和肽L8對荷CT26的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影響；
圖5為Η)-1蛋白胞外段親和肽L8對荷B16F10的C57BL/6J小鼠生存期的影響結果圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。
[0014]實施例1
為便於本領域技術人員具體實施本發明，發明人對PD-1蛋白胞外段的親和肽L8的篩選過程簡要說明如下:
UPD-1胞外段蛋白的表達與純化，簡要步驟如下:
(O首先構建含有ro-Ι胞外段序列的pET-28a(+)-hro-l重組質粒；
(2)將重組質粒轉入大腸桿菌Transetta(DE3)中；
(3)IPTG誘導目的蛋白的表達；
(4)利用鎳金屬螯合親和層析柱純化蛋白，透析復性後得到有活性的目的蛋白。
[0015]具體步驟如下:(I)以PHA (植物血凝素)刺激的健康人PBMCs (外周血單核細胞)為材料，使用Trizol試劑盒提取總RNA，經逆轉錄後得到其cDNA。利用Primer5.0設計人I3D-1胞外段的引物(正向引物為:CCACGCATATGCCAGGATGGTTCTTAGACTC，反向引物為:GGCCGGAATTCTTATTGGAACTGGCCGGCTGG)，然後利用此引物，以PBMCs的cDNA為模板擴增出目的基因，經Nde I和EcoRI酶雙酶切目的基因和質粒pET28a(+)後，將雙酶切產物在16°C的條件下連接過夜。再將連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5ci中，挑取陽性菌落獲取重組質粒，對其進行雙酶切驗證和DNA測序。
[0016](2)將測序正確的重組質粒轉化至Transetta (DE3)，用終濃度為0.5mM的IPTG，30 0C，過夜誘導目的蛋白的表達。
[0017](3)將菌體離心(12000rpm，3min)棄上清，PBS(ρΗ7.4)洗一遍後重懸超聲破碎，離心後棄上清，用Binding Buffer重懸，離心(12000rpm, IOmin), 0.45 μ m微孔濾膜過濾後利
用鎳金屬螯合親和層析柱純化蛋白。
[0018](4)將純化後的蛋白進行尿素濃度梯度透析復性，最後得到有活性的目的蛋白PD-1胞外段。
[0019]利用噬菌體展示十二肽庫篩選ro-1的親和肽，簡要步驟如下:
(1)採用固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作；
(2)經過4飛輪的篩選後，與靶蛋白ro-1胞外段有親和力的噬菌體單克隆逐輪得到富集，回收率提高了約100倍。
[0020](3)然後從第四輪和第五輪中挑選陽性克隆進行測序，共得到3個插入十二肽序列，即親和肽序列，其中L8肽出現的次數最多。
[0021]具體過程如下:
(I)測定噬菌體滴度:接種ER2738單菌落於5~10mL LB培養基中，搖床培養至對數期(OD600~0.5)。
[0022]用LB培養基將噬菌體進行10倍系列稀釋。稀釋範圍:擴增的噬菌體培養物上清:IO8^lO11 ;未擴增的淘選洗脫物:1(T104。
[0023]將已達到對數期的菌體每200μ L裝入一微量離心管中，然後每管加入10μ L不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫孵育5min。將感染菌體加入45°C預溫的上層瓊脂培養管中，快速混勻，立即傾注於37°C預溫的LB/IPTG/Xgal平板上，使其均勻鋪開。待平板冷卻15min後，倒置於37°C培養過夜。第二天檢查平板，計數有約IO2個噬菌體的平板上的斑數。然後用此數目乘以稀釋因子即得到每10 μ L噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。
[0024](2)淘選過程
包被:將150 μ L的100 μ g/mL的靶分子溶液(溶於0.1M ρΗ8.6的NaHCO3)加入96孔微量板中，反覆旋轉直至表面完全溼潤，於4°C密閉溼盒中孵育過夜。
[0025] 封閉:甩出每孔中的包被液(在乾淨的紙巾上用力拍甩以除盡殘餘溶液)，每孔加滿封阻液，4°C作用至少I小時。
[0026]洗滌:按上述方法除去封阻液，再用TBST (TBS+0.l%[v/v]Tween-20)緩衝液快速洗板6次。此操作要快以避免板乾燥。
[0027]結合:用TBST緩衝液稀釋原肽庫使100 μ L緩衝液中含有的2 X IO11個噬菌體。然後加到已包被好的板上，室溫溫和振蕩l(T60min。[0028]洗滌:甩去未結合的噬菌體，用TBST緩衝液快速洗板10次。
[0029]洗脫:每孔加入100 μ L 的洗脫液(0.2M Glycine-HCl [pH2.2], lmg/mLBSA), 25°C溼盒中輕微搖動l(T60min，洗脫液吸入另一乾淨微量離心管中，然後加入1M Tris-HCl(pH9.1)中和上述洗脫液。
[0030]滴度測定:按上述測定滴度的方法對洗脫中和液中噬菌體的滴度進行測定。
[0031]擴增:將ER2738過夜培養菌以1:100的體積比稀釋於20mL LB中(用250mL三角瓶盛裝)，加入未擴增洗脫物。37°C劇烈搖動培養4.5小時。
[0032]沉澱:將培養物轉入一離心管中，4°C 1000Orpm離心10min，上清液轉入另一離心管中再離心。將上清的上部80%轉入一新鮮管，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4°C沉澱至少60min,最好過夜。4°C 1000Orpm離心PEG沉澱15min。倒掉上清,再短暫離心,吸去殘留上清液。沉澱物重懸於ImLTBS中，懸液轉入微量離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl再沉澱。冰上孵育15~60min,4°C 1000Orpm離心10min,棄上清。沉澱物重懸於200 μ LTBS中，離心lmin，沉澱任何殘餘的不溶物，上清轉入新鮮管中，此即為擴增後的洗脫物。測定其滴度。
[0033](3)再包被一個孔準備下一輪篩選時用，方法同第一輪篩選。經過3飛輪的篩選挑取陽性噬菌體克隆擴增後進行DNA測序。
[0034](4)噬菌體DNA序列測定:製備擴增噬菌體克隆噬菌體單鏈DNA模板。取5 μ L用
0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA提取效果。取20yL DNA測序模板進行全自動測序，測序引物為-96 gill 測序引物，5』 -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3』。
[0035](5)噬菌體DNA序列同源性分析:根據DNA序列推導其所編碼的胺基酸序列，利用DNAMAN軟體對獲得的胺基酸序列進行同源性分析。共得到3個插入十二肽序列，即親和肽序列，其中L8肽出現的次數最多。
[0036]實施例2
根據實施例1篩選得到的L8肽，人工合成親和肽L8。
[0037]PD-1蛋白胞外段的親和肽L8採用Fomc固相多肽合成法合成,簡要步驟如下:
(1)選用Rink樹脂與待合成肽即I3D-1親和肽L8的C端的第一個Fmoc-胺基酸羧基以共價鍵形式連接，再以該胺基酸的N端作為該條多肽合成的起點，並讓其與下一個胺基酸的羧基端發生脫水縮合反應，形成肽鍵；
(2)然後，將N端的Fmoc-胺基酸的保護基進行脫保護，再讓第二個胺基酸的N端與後面的胺基酸的羧基反應，如此不斷重複這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最後，將合成的多肽從樹脂上切割下來，經過乙醚沉澱與洗滌，得到粗肽；
(4)經脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，得純度大於95%的本發明的PD_1親和肽L8。
[0038]一個具體的以合成0.434克的親和肽L8為例，採用Fomc固相多肽合成法合成，具體合成步驟如下:
(1)稱取0.5gRink樹脂放入DMF (N, N- 二甲基甲醯胺)潤洗過的合成儀中，然後加入3-5mLDMF，靜置30min，使 樹脂充分溶脹，然後用真空泵抽去DMF ;脫保護兩次:
所述脫保護是指在合成儀中加入:T5mL脫保護液(哌啶與DMF的體積比為1:3)，250C~28°C下攪拌反應20min，真空泵抽乾；
(2)將步驟(1)中脫保護後的樹脂按以下順序及次數進行洗滌，DMF兩次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF兩次，搖床中震蕩洗滌，每次洗滌兩分鐘，洗滌結束時用真空泵將液體抽乾；
(3)第一個胺基酸的添加:按公式I稱取絲氨酸、HoBt(1-羥基苯丙三唑)及DIC (N,N-二異丙基碳二亞胺)的量，分別為 479.25mg、168.9125mg、192.455μ L，先用 3~5mL DMF溶解絲氨酸和HoBt加入合成儀中，然後直接在合成儀中加入DIC，25°C~28°C下攪拌反應
2.5h ；
所述公式I為:胺基酸的質量=該胺基酸的相對分子質量X2.5 (當量)X樹脂的質
量;
然後洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求，即按以下順序及次數進行洗滌，DMF兩次一MeOH(甲醇)三次一DCM (二氯甲烷)三次一DMF兩次，每次洗滌兩分鐘，搖床中震蕩洗滌,洗滌結束時用真空泵將液體抽乾；
用分光光度計測定波長為290nm處樹脂和第一個胺基酸的吸光度0D，根據公式計算取代值，加封頭液封頭兩次，每次20min，在搖床中震蕩，然後洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求；
取代值計算公示為:取代值=OD/ (1.65Xmwsg), Hiwi為樹脂的質量；
(4)第二個胺基酸即蘇氨酸的添加:合成時是從C端到N端方向進行，對步驟(3)中第一個胺基酸添加後樹脂脫保護兩次，方法及步驟同步驟(1)中的脫保護；
然後洗滌，洗滌方法及步驟同步驟(2)中洗滌；
然後挑取樹脂茚檢呈藍色時，按公式2稱取第二個胺基酸蘇氨酸、HoBt、DIC的量，分別為298.125mg、101.3475mg、94.65 μ L，先用3~5mL DMF溶解絲氨酸和HoBt加入合成儀中，然後直接在合成儀中加入DIC，25°C~28°C下攪拌反應2.5h。反應結束後按步驟(2)的方法洗滌樹脂，洗滌結束後挑取樹脂茚檢呈無色；
所述公式2為:胺基酸的量=該胺基酸的相對分子質量(此處為蘇氨酸)X2.5X樹脂的質量(此處為0.5) X取代值(此處為步驟(3)中取代值計算結果)；
(5)後續胺基酸的添加:後續胺基酸的添加方法同第二個胺基酸的添加過程，直至加完所有胺基酸；其中茚檢樣品時，顯色要求有所調整，茚檢時，若前一個胺基酸是脯氨酸、絲氨酸和組氨酸時則茚檢呈紅棕色；
(6)切割多肽:從樹酯上切割多肽，按步驟(1)中的脫保護方法進行兩次；洗滌，洗滌按以下順序及次數進行洗滌，DMF兩次一MeOH三次一DCM三次一DMF 一次一DCM兩次，每次兩分鐘；
所述切割為，將切割試劑加入合成儀中，攪拌柱攪拌三小時，然後將合成儀中的液體抽入球形燒瓶中，並用DCM衝洗3遍，把球形燒瓶裝在旋轉蒸發儀上蒸發I小時；在旋轉蒸發後加2mLTFA冰切30min ;在球形燒瓶中加入乙醚再蒸發4飛次，最後加入冰乙醚在冰上靜置30min，白色沉澱即為析出的粗肽；
將含粗肽的乙醚溶液離心2000rpm，2min，得粗肽沉澱，把粗肽在37°C烘箱中烘乾，烘乾約需3h ；
所述切割 試劑需現配現用，其具體組成配比為:三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、l，2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95mL ；
(7)粗肽純化:利用RP-HPLC純化粗肽，純化體系為:乙腈，I%。；TFA=309T50% ;流速5min/mL,檢測波長是228nm。
[0039]純化後所得精肽即為本發明ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8，於-80°c保存備用。
[0040]對製備的ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8進行質譜鑑定，結果如圖1，符合預期。
[0041]實施例3
為進一步檢驗親和肽L8的抗腫瘤活性，發明人以實施例2製備的親和肽L8進一步做了抗腫瘤相關實驗具體實驗情況如下:
抑瘤率實驗
實驗品種:荷結腸癌CT26的BABL/c小鼠，小鼠購買於北京華阜康生物科技股份有限公司。
[0042]實驗過程如下:
(O於每隻小鼠的右前肢腋下荷IXlO6個瘤細胞，待小鼠的瘤體積達到5(T100mm3時按瘤體積隨機分組，分為4組，分別為L8高劑量組、L8低劑量組、5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)，每組6隻。
[0043]所述高劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶於生理鹽水配成0.25mg/mL的溶液；所述低劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶於生理鹽水配成0.0625mg/mL的溶液。具體製備時，將ro-1親和肽L8直接溶於生理鹽水後，過濾除菌，_20°C分裝保存，備用。
[0044]5Fu用生理鹽水稀釋到所用劑量(10mg/Kg)後使用，即lmL5Fu原液加19mL生理鹽水稀釋即可。
[0045](2)皮下給藥的方式注射，L8高劑量組按照200(^g/Kg，L8低劑量組按照50(^g/Kg，共給藥?天。
[0046]5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)同樣採用皮下注射的給藥方式，注射量為0.2mL。各組每天的上午給藥。實驗期間小鼠自由進食和飲水。
[0047](3)每日測量小鼠體重並記錄，繪製曲線，以檢驗L8毒副作用，結果如圖2所示；每日測量腫瘤的長(a)短(b)徑，並按公式計算腫瘤體積並繪製腫瘤生長曲線，結果如圖3所示，計算公示為:V=1/2X (aXb2)。
[0048]給藥結束的第二天將小鼠脫頸處死取出腫瘤並稱重，結果如圖4所示。
[0049]從圖2可以得知，L8給藥組的體重變化在正常範圍內，因此，L8肽沒有明顯的毒副作用。
[0050]從圖3、圖4我們可知，L8給藥組的瘤體積和瘤重比陰性對照生理鹽水組都要小，且L8肽的濃度越高，效果越明顯，因此L8肽有一定的抗腫瘤活性。
[0051]生存期實驗
實驗品種:荷B16F10的C57BL/6J小鼠。小鼠購買於北京華阜康生物科技股份有限公司。
[0052]實驗過程如下:
(I)於每隻小鼠的右前肢腋下荷5X IO5個瘤細胞，待小鼠的瘤體積達到5(T100mm3時按瘤體積隨機分組，分為4組，分別為L8高劑量組、L8低劑量組、5Fu組(陽性對照組)和生理鹽水組(陰性對照組)，每組6隻。
[0053]所述高劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶於生理鹽水配成0.25mg/mL的溶液；所述低劑量是指將ro-Ι親和肽L8直接溶於生理鹽水配成0.0625mg/mL的溶液。具體製備時，將ro-1親和肽L8直接溶於生理鹽水後，過濾除菌，-20°C分裝保存，備用。
[0054]5Fu用生理鹽水稀釋到所用劑量(10mg/Kg)後使用，即lmL5Fu原液加19mL生理鹽水稀釋即可。
[0055](2)皮下給藥的方式注射，L8高劑量組按照200(^g/Kg，L8低劑量組按照50(^g/Kg，共給藥9天。實驗期間小鼠自由進食和飲水。
[0056](3)給藥9天後停藥觀察生存期，記錄小鼠的死亡時間。
[0057]實驗結果如圖5所不,從圖中可以看出，L8妝聞劑量能明顯延長荷瘤小鼠的生存期，直接證明了 L8肽具有抗腫瘤作用。
[0058]現有技術已經表明，PD-1作為一種免疫球蛋白超家族的激活誘導的抑制性受體，PD-1及其配體ro-Ll是T細胞活化過程中一對重要的負性共刺激分子，在誘導T細胞無能和免疫耐受維持方面起著非常重要的作用，並介導了腫瘤免疫耐受和逃逸。本發明通過固相篩選法進行噬菌體展示十二肽庫的篩選工作時所獲得的ro-Ι蛋白胞外段親和肽L8，作用目標明確，對腫瘤的抑制效果明顯，尤其是對結腸癌或黑色素瘤的抑瘤效果顯著，且無副作用，能夠明顯提高實驗動物的生存期，因而具有較好的醫療應用前景。PD-1蛋白胞外段親和肽L8的製備方法較為成熟、完善，便於製備相應的生物醫藥製品，因而本發明具有較好的實際應用推廣意義。
【權利要求】
1.一種ro-1蛋白胞外段的親和肽L8，其特徵在於，該親和肽L8的胺基酸序列為:Ser-Leu-Pro-Ser-Thr-Thr-Thr-Met-Arg-Leu-Thr-Ser,即:S-L-P-S-T-T-T-M-R-L-T-S,分子量為 1293.7。
2.權利要求1所述ro-1蛋白胞外段的親和肽L8在製備抗腫瘤相關藥物中的應用，所述腫瘤為結腸癌瘤或黑色素瘤。
3.權利要求1所述ro-Ι蛋白胞外段的親和肽L8的製備方法，其特徵在於，採用Fomc固相多肽合成法製備。
【文檔編號】A61P35/00GK103897036SQ201410110200
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月24日 優先權日:2014年3月24日
【發明者】高豔鋒, 李雯雯, 李國棟, 祁元明, 劉蓓媛 申請人:鄭州大學