用於植物的啟動子分子的製作方法

2023-04-29 14:55:01

專利名稱：用於植物的啟動子分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，更準確地講涉及用於在植物中表達轉基因的多核苷酸分子。本發明涉及從大豆(Glycine max)中分離的P-Gm.701202739和P-Gm.701209813啟動子，還涉及從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離的P-At.TT2啟動子。這些啟動子可用於在農作物中表達具有農學重要性的轉基因。
背景技術：
植物遺傳工程的目標之一是產生具有重要農學特徵或性狀的植物。遺傳工程的最新進展已經為含有和表達外源基因的轉化植物提供了必要工具。植物轉化和再生方面的技術進展，使得研究人員能夠從異源來源或天然來源提取外源多核苷酸分子(例如基因)，並將該多核苷酸分子摻入到植物基因組中。然後，在植物細胞中表達該基因，顯示出附加特徵或性狀。在一種方法中，某種基因在正常情況下並不表達它的植物細胞或植物組織中的表達，可以賦予所需表型效應。在另一種方法中，某種基因或基因部分以反義方向轉錄，可以通過阻止或抑制內源基因的表達而產生所需效應。
啟動子是包含5′調節元件的多核苷酸分子，在活細胞中的總體基因表達上起重要作用。植物中起作用的分離的啟動子可用於通過遺傳工程方法改變植物表型。該方法中產生轉基因植物的第一步包括將各種遺傳元件裝配成多核苷酸構建體。該構建體包括可轉錄多核苷酸分子(目標基因)，當它通過與目標基因操作性連接的啟動子在植物細胞中表達(轉錄)時，賦予所需表型。構建體中的啟動子對於其中同時含有的目標基因來說可以是同源或異源的。再通過各種植物轉化方法，將構建體導入植物細胞中，產生轉化植物細胞，從轉化植物細胞再生轉基因植物。啟動子控制著與其操作性連接的目標基因的表達，因此能影響由轉基因在植物中表達而賦予的特徵或性狀。
為了產生具有不同優良特性的轉基因植物，最好是具有多種啟動子以提供基因表達，使得基因以產生所需效應所必需的數量而被有效轉錄。遺傳改良種質的商業化發展業已進步到可以將多種性狀引入農作物的階段，這一方法通常稱為基因堆積方法(gene stackingapproach)。在該方法中，可以將賦予不同目標性狀的多個基因引入植物。通常，在將多個基因引入植物時，重要的是每個基因都被調節或控制以達到優化表達，這導致對多種調節元件的需求。基於這些方面和其它方面的考慮，基因表達和調節元件多樣性的優化控制在植物生物技術中顯然是很重要的。
多種不同類型或類別的啟動子都可用於植物遺傳工程。可以根據時間範圍、發育範圍、轉基因表達水平或組織特異性等特徵，對啟動子進行分類。例如，稱為組成型啟動子的啟動子能夠在多種組織中有效轉錄操作性連接的基因並表達這些基因。通過以所需方式(例如組成型、組織增強型或發育誘導型)分離有待轉錄和表達的基因上遊5′調節區，可以獲得不同類型的啟動子。
大量的在植物細胞中有活性的啟動子在文獻中已有記載。它們包括在根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)根瘤誘導質粒上攜帶的胭脂鹼合酶(nos)啟動子和章魚鹼合酶(ocs)啟動子以及花椰菜花葉病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus，CaMV)19S或35S啟動子(美國專利5,352,605)，具有複製增強子的CaMV 35S啟動子(美國專利5,164,316、5,196,525、5,322,938、5,359,142和5,424,200)和玄參花葉病毒(Figwort Mosaic Virus，FMV)35S啟動子(美國專利5,378,619)。這些啟動子和許多其它啟動子已經用於產生構建體，用於在植物中進行轉基因的表達。以下美國專利文獻中描述了其它有用的啟動子5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,614,399、5,633,441、6,232,526和5,633,435，所述文獻全部通過引用結合到本文中。
為了產生植物油和其它性狀，基因在種子中表達也需要啟動子。種皮是母本源組織。一旦發生受精，種皮負責通過保護胚並提供充足養分而維持種子內受精生命的完整性，直到出現利於生長的條件時。本發明描述了在種皮中表達的啟動子。
儘管先前的工作已經提供了大量啟動子，用於指導在轉基因植物中的轉錄，但是仍然需要具有有利表達特性的新啟動子。具體地講，需要能夠指導外源基因在種子中表達的啟動子，用於產生油。許多先前已鑑定的啟動子在轉基因植物中無法提供所需表達模式或表達水平，以完全實現所選種子特異性油相關基因表達的益處。因此，植物遺傳工程領域需要用於含油種子的新啟動子。
發明概述本發明涉及在種皮中表達的啟動子。種皮啟動子可用於產生具有所需種子性狀的轉基因植物。它們包括但不限於改變養分攝入、碳貯藏、代謝和轉運、碳/氮生物合成、苯丙酸(phenylpropanoid)生物合成、種子組成或大小、含油量、蛋白質品質或微量營養素品質。
在一個實施方案中，本發明提供啟動子，它包含與選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的多核苷酸序列及其片段基本同源的多核苷酸序列，而且能夠調節操作性連接的多核苷酸分子的轉錄。在具體的實施方案中，本發明提供包含與任何上述序列具有至少約70％序列同一性的多核苷酸序列，包括與SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO5序列中的任何一個或多個序列或其片段具有約75％、80％、83％、85％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、98％、99％或更高序列同一性的序列，而且能夠調節操作性連接的多核苷酸分子的轉錄，例如具有啟動子活性。在具體的實施方案中，本文所提供的序列片段定義為包含任何本文所述啟動子序列的至少約30、40、50、75、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、600、750、800或更多個連續核苷酸，例如SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO5的核酸序列。
在另一個實施方案中，本發明提供包含本文所述啟動子的植物表達構建體，例如包含與選自SEQ ID NO1、2和5的多核苷酸序列或其任何片段或其區域基本同源的多核苷酸序列，其中所述啟動子與可轉錄多核苷酸分子操作性連接，而所述可轉錄多核苷酸分子又與3′轉錄終止多核苷酸分子操作性連接。
在又一個實施方案中，本發明提供用植物表達構建體穩定轉化的轉基因植物，所述構建體包含啟動子，所述啟動子包含與選自SEQID NO1、2和5的多核苷酸序列或其任何片段基本同源的多核苷酸序列，其中所述啟動子與可轉錄多核苷酸分子操作性連接，而所述可轉錄多核苷酸分子又可以與3′轉錄終止多核苷酸分子操作性連接。
在另一個實施方案中，本發明提供植物油的製備方法，該方法包括以下步驟將本發明啟動子摻入到含油種子植物基因組中，其中本發明啟動子是與可轉錄多核苷酸分子操作性連接的，所述可轉錄多核苷酸分子使油和/或蛋白質含量發生改變；栽培含油種子植物以收穫含油種子；從所收穫的含油種子中提取油和/或蛋白質。
根據下面的發明詳述和附圖，本發明的上述方面和其它方面將會是顯而易見的。
序列簡述SEQ ID NO1是大豆P-Gm.701202739啟動子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO2是大豆P-Gm.701209813啟動子的多核苷酸序列。
SEQ ID NO3-4是引物序列。
SEQ ID NO5是擬南芥P-At.TT2啟動子的多核苷酸序列。
附圖簡述


圖1顯示pMON65410。
圖2顯示pMON65409。
圖3顯示pMON65427。
圖4顯示pMON65431。
圖5顯示pMON65432。
發明詳述下面提供定義和方法，以便更好地限定本發明並指導本領域普通技術人員實施本發明。除非另有說明，否則術語應理解為相關領域普通技術人員的常規用法。
本文所用的術語「多核苷酸分子」是指基因組來源或合成來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA，即脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基的多聚體，閱讀方向從5′(上遊)端到3′(下遊)端。
本文所用的術語「多核苷酸序列」是指多核苷酸分子的序列。採用37CFR§1.822所提出的DNA鹼基命名法。
啟動子本文所用的術語「啟動子」是指多核苷酸分子，在其天然狀態下位於可讀框(或蛋白質編碼區)翻譯起始密碼子的上遊或5′，並且參與RNA聚合酶II和其它蛋白質(反式作用轉錄因子)的識別和結合，以起始轉錄。「植物啟動子」是在植物細胞中起作用的天然或非天然啟動子。組成型植物啟動子在植物發育過程中的大多數或所有植物組織中都具有功能。任何植物啟動子都可用作5′調節元件，以調節與其操作性連接的一個或多個特定基因的表達。當啟動子與可轉錄多核苷酸分子操作性連接時，它通常引起可轉錄多核苷酸分子的轉錄，其轉錄方式類似於該啟動子正常連接的方式。植物啟動子可以包括通過操作已知啟動子而產生的啟動子，包括人工啟動子、嵌合啟動子或雜合啟動子。這些啟動子也可與一個或多個啟動子順式順式元件組合，例如通過在具有自身部分或全部調節元件的活性啟動子中加入異源調節元件。因此，本發明包括嵌合啟動子或雜合啟動子的設計、構建和使用，所述啟動子包含SEQ ID NO1、2或5中的至少一個順式元件，用於調節操作性連接的多核苷酸序列的表達。
本文所用的術語「順式元件」是指順式作用轉錄調節元件，所述元件具有總體控制基因表達的特點。順式元件可起到結合轉錄因子(調節轉錄的反式作用蛋白因子)的作用。一些順式元件結合不止一個轉錄因子，而轉錄因子可以與不止一個順式元件以不同親和力相互作用。本發明的啟動子最好含有具有基因表達能力或能夠調節基因表達的順式元件。許多技術都可鑑定順式元件，所述技術包括缺失分析，即從啟動子5′端或其內部缺失一個或多個核苷酸；採用DNA酶I足跡法進行DNA結合蛋白分析，甲基化幹擾，電泳遷移率變動分析，通過連接介導的PCR進行體內基因組足跡法，以及其它常規分析；或者通過常規DNA序列比較方法，與已知順式元件基序進行DNA序列相似性分析。可通過誘變(或取代)一個或多個核苷酸，或者通過其它常規方法，進一步研究順式元件的精細結構。可通過化學合成法，或者通過從包含所述元件的啟動子中分離得到順式元件，而且也可以用含有有用的限制酶位點(以便進行後續操作)的附加側翼核苷酸合成順式元件。
在一個實施方案中，本發明的啟動子包含多個順式元件，它們各自對基因表達的總體控制具有不同特點。在一個優選的實施方案中，用專門為鑑定序列內的順式元件、結構域或基序而設計的電腦程式，來鑑定來自SEQ ID NO1、2或5多核苷酸分子的順式元件。順式元件可以根據不同的條件，對基因表達進行正調節或負調節。因此，本發明包括本文所公開的啟動子的順式元件。
本文所用的術語「基本同源」是指通常已證實與本文所述的啟動子具有基本的％序列同一性的多核苷酸分子。尤其重要的是這樣的多核苷酸分子所述多核苷酸分子在植物中行使功能，指導轉錄，並且與本文所述啟動子的多核苷酸序列具有至少約70％序列同一性、至少約80％序列同一性、至少約90％序列同一性、或甚至更高的序列同一性，例如98％或99％序列同一性。能夠調節操作性連接的可轉錄多核苷酸分子的轉錄、並且與本文所述啟動子的多核苷酸序列基本同源的多核苷酸分子，包括在本發明的範圍之內。
本文所用的術語「％序列同一性」是指當兩個序列進行最佳比對時(在比較窗口內，具有合適的核苷酸插入、缺失或空位總數小於20％的參考序列)，參考多核苷酸分子(或其互補鏈)與待測多核苷酸分子(或其互補鏈)相比的線狀多核苷酸序列中的相同核苷酸百分比。用於比對一個比較窗口的最佳序列比對是本領域技術人員眾所周知的，可以採用諸如以下的工具來實施Smith和Waterman的局部同源性算法，Needleman和Wunsch的同源性比對算法，Pearson和Lipman的搜索相似性方法，優選這些算法都用計算機來執行，例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，這些都是市售的GCGWisconsinPackage(Accelrys Inc.，San Diego，CA)的組成部分。待測序列和參考序列比對區段的「同一性分數」是兩個比對序列共享的相同組分數除以參考序列區段(即完整的參考序列或參考序列中較小的指定部分)的總組分數。％序列同一性表示為同一性分數乘以100。一個或多個多核苷酸序列的比較可以是比較全長多核苷酸序列或其部分，或者是比較較長的多核苷酸序列。
本文所用的術語「同源性」是指根據％核苷酸位置同一性來確定的多核苷酸序列之間的相似性水平或％同一性，即序列相似性或同一性。本文所用的術語同源性也指不同多核苷酸分子之間相似功能特性的概念，例如具有相似功能的啟動子可具有同源的順式元件。當多核苷酸分子在某些條件下可以特異性雜交而形成雙鏈體分子時，這些多核苷酸分子就是同源的。在這些條件(稱為嚴格性條件)下，一個多核苷酸分子可用作探針或引物，以鑑定與其具有同源性的其它多核苷酸分子。術語「嚴格性條件」就其功能定義為按照以下文獻中論述的具體雜交方法，使核酸探針與靶核酸(即與特定的目標核酸序列)雜交Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版，第1、2和3卷.J.F.Sambrook，D.W.Russell和N.Irwin，Cold Spring HarborLaboratory Press，2000(本文中稱為Sambrook等)。因此，可以利用本發明核苷酸序列與多核苷酸分子片段的互補序列段選擇性地形成雙鏈體分子的能力。根據所考慮的應用方法，最好採用不同雜交條件，以得到探針對靶序列的不同選擇程度。對於需要高選擇性的應用方法，通常最好採用相對高的嚴格性條件以形成雜合體，例如可選擇相對低鹽和/或高溫條件，例如約0.02M至約0.15M NaCl，溫度約50℃至約70℃。高嚴格性條件例如是用高嚴格性洗滌緩衝液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗滌雜交濾膜至少兩次。本領域技術人員已知促進DNA雜交的合適的中等嚴格性條件，例如用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，約45℃，再用2.0X SSC在50℃進行洗滌。另外，洗滌步驟中的鹽濃度可以選擇低嚴格性(約2.0X SSC，50℃)至高嚴格性(約0.2XSSC，50℃)。另外，洗滌步驟中的溫度可以從低嚴格性條件(室溫，約22℃)升高至高嚴格性條件(約65℃)。溫度和鹽都可變動，或者溫度或鹽濃度中的一項保持恆定，而改變另一項。這樣的選擇條件使得在探針和模板或靶鏈之間幾乎不會產生錯配。通過雜交檢測多核苷酸分子，是本領域技術人員眾所周知的，美國專利4,965,188和5,176,995介紹了雜交分析的示例性方法。
也可通過電腦程式來比對多核苷酸序列，並估計多核苷酸分子在某些嚴格性條件下形成雙鏈體分子的能力，確定同源性。不同來源的共享高度同源性的多核苷酸分子稱為「同源物」。
可以採用本領域技術人員眾所周知的方法，鑑定具有類似於本文所述啟動子的活性的目標啟動子。例如，可以採用目標細胞或目標組織，構建cDNA文庫，並篩選鑑定具有類似於本文所述啟動子的表達模式的基因。再用經過鑑定的基因的cDNA序列來分離基因的啟動子，用於進一步表徵。參見例如美國專利6,096,950、5,589,583和5,898,096，所述文獻通過引用結合到本文中。或者，轉錄概況分析技術或電子RNA印跡技術(transcriptional profiling or electronicnorthern technique)可用於鑑定具有類似於本文所述啟動子的表達模式的基因。一旦鑑定出了這些基因，就可分離出它們的啟動子，用於進一步表徵。參見例如美國專利6,506,565和6,448,387，所述文獻通過引用結合到本文中。電子RNA印跡技術是基於計算機的序列分析，該分析可根據研究人員鑑定的參數，對來自多個cDNA文庫的序列進行電子儀器比較，所述參數包括多個cDNA文庫中EST群體的豐度，或專門針對來自一個文庫或組合文庫的EST系列。轉錄概況分析技術是一種用於上千個基因的基因表達概況的系統監測的高通量方法。這一基於DNA晶片的技術將上千個cDNA序列排列在支持物表面上。這些排列同時與標記的cDNA探針群體(所述探針是從不同細胞或組織類型的RNA樣品製備的)雜交，使得可以直接比較分析表達。該方法可用於分離調節序列，例如與這些基因相關的啟動子。
在另一個實施方案中，可以修飾本文所公開的啟動子。本領域技術人員可製造在多核苷酸序列中具有變異的啟動子。可以修飾或改變SEQ ID NO1、2或5所示的本發明啟動子的多核苷酸序列，以加強它們的控制特性。多核苷酸序列的一個優選改變方法就是採用PCR，修飾所選核苷酸或序列區。這些方法是本領域技術人員眾所周知的。在基於PCR的DNA修飾方法中，可通過模板序列的插入、缺失或取代，從而修飾序列。「變異體」是含有以下變化的啟動子其中原始啟動子的一個或多個核苷酸缺失、添加和/或取代，優選同時基本保持啟動子功能。例如，可以從啟動子的5′端或3′端缺失一個或多個鹼基對，以產生「截短的」啟動子。也可以在啟動子內部插入、缺失或取代一個或多個鹼基對。就啟動子片段而論，變異型啟動子可以包括影響與其操作性連接的最小啟動子轉錄的變化。最小啟動子即基礎啟動子是能夠募集和結合基礎轉錄機器的多核苷酸分子。真核細胞基礎轉錄機器的一個實例是RNA聚合酶II複合體及其輔助蛋白。可以通過例如標準DNA誘變技術製備變異型啟動子，或者通過化學方法合成變異型啟動子或其部分。
可以通過許多方法設計或改造新的嵌合啟動子。許多啟動子含有激活、增強或限定啟動子強度和/或特異性的順式元件。例如，啟動子可含有限定轉錄起始位點的「TATA」盒以及位於轉錄起始位點上遊並能調節轉錄水平的其它順式元件。例如，可通過將第一啟動子片段(其中含有來自一個啟動子的激活物順式元件)與第二啟動子片段(其中含有來自另一個啟動子的激活物順式元件)融合，製備嵌合啟動子；所得嵌合啟動子可增加操作性連接的可轉錄多核苷酸分子的表達。可以構建啟動子，使啟動子片段或元件是操作性連接的，例如通過將這樣的片段放置在最小啟動子上遊。本發明的順式元件和片段可用於構建這樣的嵌合啟動子。本發明的嵌合啟動子和變異型啟動子的構建方法，包括但不限於將不同啟動子或啟動子重複部分或區域的控制元件組合起來(參見例如美國專利4,990,607、5,110,732和5,097,025，所有這些文獻都通過引用結合到本文中)。本領域技術人員熟知介紹大分子(例如多核苷酸分子、質粒等)的構建、操作和分離、以及重組生物的產生和多核苷酸分子的篩選分離的具體條件和方法的標準來源資料。
在另一個實施方案中，包含SEQ ID NO1、2或5所示的多核苷酸序列的啟動子包括能夠調節操作性連接的可轉錄多核苷酸分子的任何長度的所述多核苷酸序列。例如，SEQ ID NO1、2或5所公開的啟動子可以是截短的或部分缺失的，並且依然能夠調節操作性連接的多核苷酸分子的轉錄。在一個相關實施方案中，本文所公開的啟動子的順式元件可以賦予特定特異性，例如能夠賦予在某些組織中增強操作性連接的多核苷酸分子的表達，因而也能夠調節操作性連接的多核苷酸分子的轉錄。因此，包含SEQ ID NO1、2或5所示多核苷酸序列的啟動子的任何片段、部分或區域，都可用作調節性多核苷酸分子，包括但不限於本文所公開的多核苷酸分子的順式元件或基序。可聯合採用取代、缺失、插入或它們的任何組合，以產生最終構建體。
多核苷酸構建體本文所用的術語「構建體」是指任何來源的、且能夠基因組整合或自主複製的任何重組多核苷酸分子，例如質粒、粘粒、病毒、自主複製的多核苷酸分子、噬菌體或線狀或環狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，包含其中一個或多個多核苷酸分子以功能操作性方式連接的多核苷酸分子。
本文所用的術語「操作性連接(的)(operably linked)」是指第一多核苷酸分子(例如啟動子)與第二可轉錄多核苷酸分子(例如目標基因)連接起來，經過該連接，這兩個多核苷酸分子的排列方式使得第一多核苷酸分子能影響第二多核苷酸分子的功能。優選這兩個多核苷酸分子是單個毗連多核苷酸分子的一部分，更優選是相鄰的。例如，如果啟動子在細胞中調節或介導目標基因的轉錄的話，啟動子則與目標基因操作性連接。
本文所用的術語「可轉錄多核苷酸分子(transcribablepolynucleotide molecule)」是指能夠轉錄成為RNA分子的任何多核苷酸分子。將構建體導入細胞，其方式使得可轉錄多核苷酸分子轉錄成為功能性mRNA分子，後者再翻譯，因而表達成為蛋白質產物，這樣的方法是已知的。也可構建能夠表達反義RNA分子的構建體，以便抑制特定目標RNA分子的翻譯。對於本發明的實踐，製備和使用構建體和宿主細胞的常規組合物和方法都是本領域技術人員眾所周知的(參見例如Sambrook等)。
本發明的構建體通常含有啟動子、可轉錄多核苷酸分子和3′轉錄終止多核苷酸分子，它們依次操作性連接。另外，構建體可以包括但不限於來自植物基因的3′-非翻譯區(3′UTR)(例如增加mRNA的mRNA穩定性的3′UTR，例如馬鈴薯PI-II終止區或者章魚鹼或胭脂鹼合酶3′終止區)的額外調節性多核苷酸分子。構建體可以包括但不限於mRNA多核苷酸分子的5′非翻譯區(5′UTR)，它在翻譯起始中起到重要作用，並且也可以是植物表達構建體中的遺傳元件。例如，已經證明，來源於熱激蛋白基因的非翻譯5′前導序列多核苷酸分子能增強植物中的基因表達(參見例如美國專利5,659,122和5,362,865；美國公布的申請2002/0192812，所述文獻通過引用結合到本文中)。這些另外的上遊和下遊調節性多核苷酸分子的來源相對於啟動子構建體中存在的其它元件，是天然或異源的。
因此，本發明構建體包含SEQ ID NO1、2或5中提供的那些啟動子或如上所述經過修飾的那些啟動子，所述啟動子是與可轉錄多核苷酸分子操作性連接的，在將所述構建體導入植物細胞後，能指導所述可轉錄多核苷酸分子以所需水平或在所需組織或以某種發育模式的轉錄。在某些情況下，所述可轉錄多核苷酸分子包含基因的蛋白質編碼區，所述啟動子提供待翻譯和表達為蛋白產物的功能性mRNA分子的轉錄。也可以構建各種構建體，用於反義RNA分子或其它類似抑制性RNA的轉錄，以便抑制目標宿主細胞中的特異性RNA分子的表達。
用於摻入本發明構建體的示例性可轉錄多核苷酸分子包括例如來源於不是目標基因物種的DNA分子或基因，或者甚至起源於相同物種的基因或存在於相同物種的基因，但是通過不是經典繁殖或育種技術的遺傳工程方法摻入受體細胞中。外源基因或遺傳元件是指導入受體細胞的任何基因或DNA分子。外源DNA中所包括的DNA類型可以包括植物細胞中已存在的DNA，來自其它植物的DNA，來自不同生物體的DNA或外部產生的DNA，例如含有基因的反義信息的DNA分子或編碼基因的人工形式或修飾形式的DNA分子。
可以採用所述標記基因，將本發明的啟動子摻入構建體中，然後在穩定植物系統中，用提供基因表達指示的瞬時分析進行測試。本文所用的術語「標記基因」是指任何可轉錄多核苷酸分子，其表達可用某種方法進行篩選或評分。用瞬時測定法測試標記基因表達的方法是本領域技術人員已知的。採用各種植物、組織和DNA轉移系統瞬時表達標記基因已有報導。例如，瞬時分析類型可以包括但不限於在任何瞬時植物試驗中，採用任何目標植物物種，通過組織的電穿孔或微粒轟擊進行的直接基因轉移。這樣的瞬時系統包括但不限於來源於不同組織的原生質體的電穿孔或特定目標組織的微粒轟擊。本發明包括使用任何瞬時表達系統，以評價與任何可轉錄多核苷酸分子(包括但不限於所選報導基因、標記基因或農學目標基因)操作性連接的啟動子或啟動子片段。考慮用於測試瞬時通過合適轉移系統，植物組織的實例包括但不限於葉基組織、愈傷組織、子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉和表皮組織。
任何可評分或可篩選的標記基因都可用於瞬時測定。用於本發明啟動子或啟動子片段的瞬時分析的優選標記基因包括GUS基因(美國專利5,599,670，所述文獻通過引用結合到本文中)或GFP基因(美國專利5,491,084，所述文獻通過引用結合到本文中)。將含有與標記基因操作性連接的啟動子或啟動子片段的構建體轉移到組織中，通過合適機制，根據標記對這些組織進行分析。採用定量或定性分析作為工具，評價穩定植物中的啟動子或啟動子片段(當操作性連接有農學目標基因時)的潛在表達概況。
因此，在一個優選的實施方案中，將SEQ ID NO1、2或5所示的本發明多核苷酸分子或其片段、變異體或衍生物摻入到構建體中，使得本發明的啟動子與提供可選擇、可篩選或可評分標記的可轉錄多核苷酸分子操作性連接。用於實施本發明的標記包括但不限於編碼以下酶和蛋白的可轉錄多核苷酸分子β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、綠色螢光蛋白(GFP)、螢光素酶(LUC)、賦予抗生素抗性的蛋白或賦予除草劑耐受性的蛋白。有用的抗生素抗性標記，包括編碼賦予卡那黴素(nptII)、潮黴素B(aph IV)、鏈黴素或壯觀黴素(aad，spec/strep)和慶大黴素(aac3和aacC4)抗性的蛋白的標記，是本領域已知的。已經證明了轉基因植物耐受的除草劑，本發明的方法可用於包括但不限於草甘膦、草銨膦(glufosinate)、磺醯脲類、咪唑啉酮類、溴苯腈、delapon、cyclohezanedione、原卟啉原(protoporphyrionogen)氧化酶抑制劑和異氟草類除草劑(isoxasflutole herbicides)。編碼除草劑耐受性相關蛋白的多核苷酸分子是本領域已知的，包括但不限於編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，描述於美國專利5,627,061、5,633,435和6,040,497；aroA，描述於美國專利5,094,945，具有草甘膦耐受性；編碼溴苯腈腈水解酶的多核苷酸分子(Bxn)，描述於美國專利4,810,648，具有溴苯腈耐受性；編碼八氫番茄紅素去飽和酶的多核苷酸分子(crtl)，描述於Misawa等，PlantJ.，4833-840(1993)和Misawa等，Plant J.，6481-489(1994)，具有達草滅(norflurazon)耐受性；編碼乙醯羥酸合酶的多核苷酸分子(AHAS，aka ALS)，描述於Sathasiivan等，Nucl.Acids Res.，182188-2193(1990)，具有磺醯脲類除草劑耐受性；bar基因，描述於DeBlock等，EMBO J.，62513-2519(1987)，具有草銨膦和雙丙氨醯膦耐受性。
在一個優選的實施方案中，將SEQ ID NO1、2或5所示的本發明多核苷酸分子或其片段、變異體或衍生物摻入到構建體中，使本發明的啟動子與可轉錄多核苷酸分子(即農學目標基因)操作性連接。本文所用的術語「農學目標基因」是指包括但不限於提供優良特性的基因的可轉錄多核苷酸分子，所述特性涉及植物形態學、生理學、生長和發育、產量、營養增加、抗病或抗蟲、或環境或化學品耐受性。農學目標基因的表達最好是為了得到重要的農學性狀。給農作物提供優良農學性狀的農學目標基因可以是例如包括但不限於具有以下特性的遺傳元件除草劑抗性(美國專利5,633,435和5,463,175)、產量增加(美國專利5,716,837)、病害蟲防治(美國專利6,063,597、6,063,756、6,093,695、5,942,664和6,110,464)、真菌病抗性(美國專利5,516,671、5,773,696、6,121,436、6,316,407和6,506,962)、病毒抗性(美國專利5,304,730和6,013,864)、線蟲抗性(美國專利6,228,992)、細菌病抗性(美國專利5,516,671)、澱粉產量(美國專利5,750,876和6,476,295)、改變的油產量(美國專利6,444,876)、高油產量(美國專利5,608,149和6,476,295)、改變的脂肪酸含量(美國專利6,537,750)、高蛋白產量(美國專利6,380,466)、果實成熟(美國專利5,512,466)、增加的動物和人類營養(美國專利5,985,605和6,171,640)、生物聚合物(美國專利5,958,745和美國公布的申請2003/0028917)、環境脅迫抗性(美國專利6,072,103)、藥用肽(美國專利6,080,560)、改良的加工性狀(美國專利6,476,295)、改良的可消化性(美國專利6,531,648)、低棉子糖(美國專利6,166,292)、工業用酶的生產(美國專利5,543,576)、改善的口味(美國專利6,011,199)、固氮(美國專利5,229,114)、雜交種子的生產(美國專利5,689,041)和生物燃料的生產(美國專利5,998,700)，上述專利所記載的遺傳元件和轉基因都通過引用結合到本文中。
或者，可轉錄多核苷酸分子可以通過編碼非轉錄RNA分子而影響上述表型，所述RNA分子引起內源基因表達的靶向抑制，例如通過反義、RNAi或共抑制介導的機制。RNA也可以是催化性RNA分子(即核酶)，該分子經工程化以切割所需內源mRNA產物。因此，編碼表達目標表型或形態學變化的蛋白質或mRNA的任何多核苷酸分子，都可用於實施本發明。
本發明的構建體通常是雙Ti質粒邊界DNA構建體，所述構建體具有從根瘤土壤桿菌中分離的Ti質粒的右邊界區(RB或AGRtu.RB)和左邊界區(LB或AGRtu.LB)，包含T-DNA以及土壤桿菌細胞提供的轉移分子，允許將T-DNA整合到植物細胞基因組中。構建體還含有可在細菌細胞中提供複製功能和抗生素選擇的質粒骨架DNA區段，例如大腸桿菌(E.coli)複製起點(例如ori322)，宿主範圍廣的複製起點(例如oriV或oriRi)和選擇標記的編碼區(例如編碼賦予壯觀黴素或鏈黴素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷轉移酶(aadA)的Spec/Strp，或慶大黴素(Gm，Gent)選擇標記基因)。對於植物轉化來說，宿主細菌菌株通常是根瘤土壤桿菌ABI、C58或LBA4404，但是，植物轉化領域技術人員已知的其它菌株也可用於本發明。
轉化植物和植物細胞本文所用的術語「轉化(的)」是指已經導入外源多核苷酸分子(例如構建體)的細胞、組織、器官或生物體。優選所導入的多核苷酸分子整合到受體細胞、組織、器官或生物體的基因組DNA上，使所導入的多核苷酸分子可以遺傳給後代。「轉基因」或「轉化」細胞或生物體也包括細胞或生物體的後代，以及通過採用這樣的轉基因植物作為雜交親本的育種程序而產生的後代，所述後代因存在外源多核苷酸分子而表現出改變的表型。可以通過任何植物轉化方法，將含有本發明啟動子的植物轉化構建體導入植物中。在本發明的實踐中，通過將植物表達構建體導入植物基因組中而轉化植物的方法與材料可以包括任何熟知的且已證明的方法，包括電穿孔，參見美國專利5,384,253；微彈轟擊法(microprojectile bombardment)，參見美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865；土壤桿菌介導的轉化，參見美國專利5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301；和原生質體轉化，參見美國專利5,508,184，所有上述文獻都通過引用結合到本文中。
專門用於轉化雙子葉植物的方法是本領域技術人員眾所周知的。用這些方法進行轉化和植物再生，已經在許多農作物中有介紹，包括但不限於棉花(Gossypium hirsntum)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)、苜蓿(Medicago sativa)和芸苔屬(Brassica)成員。本領域技術人員顯而易見的是，可以採用和改進許多轉化方法，用於從許多目標雙子葉農作物產生穩定的轉基因植物。
專門用於轉化單子葉植物的方法是本領域技術人員眾所周知的。用這些方法進行轉化和植物再生，已經在許多農作物中有介紹，包括但不限於大麥(Hordeum vulgarae)；玉米(Zea mays)；燕麥(Avenasativa)；鴨茅(Dactylis glomerata)；水稻(Oryza sativa，包括印度變種和日本變種)；高粱(Sorghum bicolor)；甘蔗(Saccharum sp)；葦狀羊茅(Festuca arundinacea)；草坪草(Agrostis)；和小麥(Triticumaestivum)。本領域技術人員顯而易見的是，可以採用和改進許多轉化方法，用於從許多目標單子葉農作物產生穩定的轉基因植物。
許多種子、堅果和種仁都含油，可以提取這些油，用於烹飪(作為其它食物成分，作為營養補充劑)，作為生產肥皂、潤膚油和護髮油、洗滌劑、塗料的原料，以及作為某些基於石油的潤滑劑和燃料的代用品。本文所用的這些種子、堅果和種仁統稱為「含油種子」(National Sustainable Agriculture Information Service(ATTRA)，Fayetteville，AR)。常用作含油種子的種子、堅果和種仁見表1。
表1.含油種子、堅果和種仁
在另一個實施方案中，本發明提供植物油的製備方法，該方法包括以下步驟將本發明啟動子摻入到含油種子植物基因組中，其中本發明啟動子是與可轉錄多核苷酸分子操作性連接的，所述可轉錄多核苷酸分子使油和/或蛋白質含量發生改變；栽培含油種子植物以收穫含油種子；從所收穫的含油種子中提取油和/或蛋白質。
對轉化植物中存在的目標基因、表達水平和/或本發明啟動子所賦予的特性進行分析。本領域技術人員知道，許多方法都可用於分析轉化植物。例如，植物分析方法包括但不限於DNA印跡法或RNA印跡法、基於PCR的方法、生化分析法、表型篩選法、田間評價法和免疫診斷測定法。
本發明的種子可以從能育轉基因植物收穫，用於培育產生本發明轉化植物後代，包括含有本發明構建體並表達農學目標基因的雜交植物系。
本發明的啟動子提供植物組織的差異表達，優選在至少一種植物種子組織(包括種皮、胚、糊粉和內胚乳)中。在本文中，啟動子是指「種子增強型啟動子」。
術語「微量營養素含量」是指種子中的微量營養素含量，即維生素A、E、K、生育酚、生育三烯酚或類胡蘿蔔素含量，表示為每重量單位。
術語「含油量」是指油水平，可以通過例如低解析度1H核磁共振(NMR)(Tiwari等，JAOCS，51104-109(1974)或Rubel，JAOCS，711057-1062(1994))或近紅外透射(NIT)光譜(Orman等，JAOCS，69(10)1036-1038(1992)；Patrick等，JAOCS，74(3)273-276(1997))而測得。
術語「蛋白質品質」是指無論是游離的還是摻入在蛋白質中的一種或多種必需胺基酸水平，即組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸水平。
本文所用的術語「油組成」是指樣品中不同脂肪酸或油組分的比例。這樣的樣品可以是植物或植物部分，例如種子。這樣的樣品也可以是一批植物部分。
在一個優選的實施方案中，本文所用的術語「％含量」是指某一特定組分相對於其它類似相關組分的總重量百分比。
本文所用的術語「增加的油」或「油增加」包括油產量增加或油組成改變。
下面的實施例用於證明本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解，以下實施例所公開的技術代表本發明人發明的技術，能夠很好地用於實施本發明。然而，本領域技術人員應當理解，根據本說明書，在不偏離本發明的精神和範圍的情況下，可以在所公開的具體實施方案中進行許多改變，但仍得到相同或相似的結果，因此附圖中提供或顯示的所有內容都是說明性的而非限制性的。
實施例實施例1啟動子P-Gm.701202739和P-Gm.701209813的分離通過文庫扣除和電子RNA印跡技術，使用PhytoSeq資料庫SOYMON035，鑑定出用於種皮表達的EST增強型。從大豆栽培品種A3244中提取DNA，用於構建GenomeWalker(BD Biosciences，PaloAlto，CA)文庫。通過PCR擴增，從GenomeWalker文庫中分離出兩個來自上述EST的啟動子701202739H1(0.76kb)和701209813H1(0.78kb)。
克隆推定的大豆種皮啟動子5′-上遊調節序列，經過證實這些序列是P.701202739H1(SEQ ID NO1)(pMON57315)和701209813H1(SEQ ID NO2)(pMON57314)。
實施例2啟動子P-At.TT2的分離擬南芥TT2基因編碼R2R3MYB結構域蛋白，該蛋白質參與發育中的種皮內原花色素的積蓄。首先通過用BLAST針對孟山都(Monsanto)擬南芥序列資料庫ArabGDNA搜索編碼序列(AJ299452)，鑑定出啟動子序列，該資料庫ArabGDNA包括所有來源的所有擬南芥基因組序列。Pl Clone MOK9(AB015477)含有TT2編碼序列(鹼基對64541-67240)。設計引物，從擬南芥基因組DNA(Strain ID CS3176)擴增TT2編碼區上遊序列(對應於Pl MOK9的鹼基對64658-65620)。將TT2的預測ATG轉變成NcoI位點，並將SrfI位點添加到第二引物的5′端，便於進行克隆。引物序列是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。將啟動子序列(SEQ ID NO5)克隆到PCR2.1 Topo(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，得到pMON65418。
實施例3用於轉化擬南芥的構建體pMON65410(T-Gm.701202739-0:3:1::GUS)pMON57315用PstI和NcoI進行消化，從pMON57315上切取含有P-Gm.701202739-0:3:1的698bp片段。將該片段與已用Sse8387I和NcoI消化的pMON69802連接在一起。所得質粒含有驅動大腸桿菌uidA基因的P-Gm.701202739-0:3:11並具有油菜籽蛋白3′UTR(napin 3′UTR)，該質粒稱為pMON65410。用已知方法測定核酸序列，證明克隆連接的完整性。該載體隨後用於轉化擬南芥。
pMON65409(P-Gm.7012009813-0:3:1::GUS)pMON57314用PstI和NcoI進行消化，從pMON57314上切取含有P-Gm.701209813-0:3:1的704bp片段。將該片段與已用Sse8387I和NcoI消化的pMON69802連接在一起。所得質粒含有驅動大腸桿菌uidA基因的P-Gm.701209813-0:3:11並具有油菜籽蛋白3′UTR，該質粒稱為pMON65409。用已知方法測定核酸序列，證明克隆連接的完整性。該載體隨後用於轉化擬南芥。
根據Bent等，Science，2651856-1860(1994)或Bechtold等，C.R.Acad.Sci，Life Sciences，3161194-1199(1993)，獲得了轉基因擬南芥植物。將含有轉化載體pMON65410或pMON65409的根瘤土壤桿菌菌株ABI培養物在LB(10％細菌用胰蛋白腖、5％酵母膏和10％NaCl/卡那黴素(75mg/L)、氯黴素(25mg/L)和壯觀黴素(100mg/L))上培養過夜。將細菌培養物離心，重懸於5％蔗糖+.05％Silwet-77溶液中。將整株擬南芥植物的地上部分(在約5-7周齡)浸泡在所得溶液中2-3秒。用紙巾吸乾植株上的過量溶液。將浸泡過的植株側放在加罩平板上，移到19℃培養室。16-24小時後，打開罩子，讓植株直立向上。當植株達到成熟度時，停止澆水2-7天後收穫種子。所收穫的種子通過不鏽鋼篩網(40孔/英寸)，除去碎屑。將所收穫的種子放入紙質錢袋(papercoin envelope)中在室溫下貯藏，直至分析用。
用蒸氣相消毒方案，對擬南芥種子進行表面消毒。將裝有種子的開口容器放入乾燥器中，乾燥器裡還放有一個裝有100ml家用漂白劑的燒杯。將3ml濃HCl加入到漂白劑中，立即密封乾燥器。密封乾燥器後，抽真空進行氯氣燻蒸消毒。種子保持幾小時。將消過毒的種子播種到補充了50mg/L草甘膦的的擬南芥出芽培養基(MSSalts(1X)、蔗糖(1％)、肌醇(100mg/L)、硫胺素-HCl(1mg/L)、吡哆醇-HCl(500mg/L)、煙酸(500mg/L)、MES pH 5.7(0.05％)和Phytagar(0.7％))中。
實施例4轉基因擬南芥植物中啟動子的表徵採用組織化學染色法，分析用pMON65409或pMON65410轉化的擬南芥植物中β-葡糖醛酸糖苷酶(大腸桿菌uidA基因的產物)的表達。將16株草甘膦抗性幼苗移栽到2英寸花盆(裝有MetroMix 200)內，每個花盆移栽一株幼苗，在上述條件下培育，直到最初結的長角果開始變幹。從每株T1植物上切取組織(蓮座葉、莖生葉、莖、花、花芽和發育中的長角果)，隨後進行組織化學染色。從每株T1植物上切取組織(蓮座葉、莖生葉、莖、花、花芽和發育中的長角果)，隨後進行組織化學染色。
將如上所述製備的組織在含有以下成分的溶液中於37℃保溫24小時50mM NaPO4(pH7.2)、100μM鐵氰化鉀、100μM亞鐵氰化鉀、0.03％Triton X-100、20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖醛酸(X-gluc)。通過在70％乙醇/30％H2O中、在37℃保溫過夜，除去染色組織中的葉綠素。立即對染色組織拍照，或者將其移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，於4℃保存，直到進行拍照。
對於pMON65409，所篩選的5個植株中有5株(5/5)在至少一個時間點檢測到種子的活性水平。對於pMON65410，所篩選的5個植株中有5株(5/5)在至少一個時間點檢測到種子的活性水平。
實施例5用於轉化油菜(Canola)的構建體
pMON65431(P-Gm.701202739-0:3:1::GUS)pMON57315用NotI和NcoI進行消化，從pMON57315上切取含有P-Gm.701202739-0:3:1的745bp片段。將該片段與已用NotI和NcoI消化的pMON65424連接在一起。所得質粒含有驅動大腸桿菌uidA基因的P-Gm.701202739-0:3:11並具有油菜籽蛋白3′UTR，該質粒稱為pMON65431。用已知方法測定核酸序列，證明克隆連接的完整性。該載體隨後用於轉化油菜。
pMON65432(T-Gm.701209813-0:3:1::GUS)pMON57314用NotI和NcoI進行消化，從pMON57314上切取含有P-Gm.701209813-0:3:1的746bp片段。將該片段與已用NotI和NcoI消化的pMON65424連接在一起。所得質粒含有驅動大腸桿菌uidA基因的P-Gm.701209813-0:3:11並具有油菜籽蛋白3′UTR，該質粒稱為pMON65432。用已知方法測定核酸序列，證明克隆連接的完整性。該載體隨後用於轉化油菜。
pMON65427(P-At.TT2-0:3:2::GUS)pMON65418用SmaI和NcoI進行消化，從pMON65418上切取含有P-At.TT2-0:3:2的966bp片段。將該片段與已用PmeI和NcoI消化的pMON65424連接在一起。所得質粒含有驅動大腸桿菌uidA基因的P-At.TT2-0:3:21並具有油菜籽蛋白3′UTR，該質粒稱為pMON65427。用已知方法測定核酸序列，證明克隆連接的完整性。該載體隨後用於轉化油菜。
將載體pMON65422、65431和pMON65432導入根瘤土壤桿菌菌株ABI中，用於轉化到歐洲油菜(Brassica napus)中。採用Moloney和Radke的美國專利5,720,871所述方案，轉化油菜植物。簡而言之，將歐洲油菜(B.napus)cv Ebony的種子種在2英寸花盆內，花盆內裝有Metro Mix 350(The Scotts Company，Columbus，OH)。讓各植株在24℃培養室中生長，經過16/8小時光周期，光強度400μEm-2sec-1(HID燈)。2-1/2周後，將各植株移栽到6英寸花盆內，在培養室中於白天15℃/夜晚10℃的溫度進行培育，16/8小時光周期，光強度800μEm-2sec-1(HID燈)。
剛好在抽薹之前，或者在抽薹時但開花之前，從植株上切取梢頭四節，如下進行表面消毒70％v/v乙醇1分鐘，2％w/v次氯酸鈉20分鐘，用無菌去離子水清洗3次。將6-7個莖段切成5mm圓片，保持底端的方向。
將用於轉化油菜的土壤桿菌培養物在含有50mg/L卡那黴素、24mg/L氯黴素和100mg/L壯觀黴素的2ml Luria肉湯LB(10％細菌用胰蛋白腖、5％酵母膏和10％NaCl)中，在24℃搖床上培養過夜。用MS培養基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.，15473-497，1962)製備1∶10的稀釋液，得到約9×108細胞/ml。給莖的圓片(外植體)接種1.0ml土壤桿菌，過量部分從外植體上吸去。將外植體底部朝下放置在裝有以下成分的培養基平板上1/10MS鹽、B5維生素(1％肌醇、0.1％硫胺素HCl、0.01％煙酸、0.01％吡哆醇HCl)、3％蔗糖、0.8％瓊脂，pH 5.7，1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(BA)。平板上再鋪上1.5ml含有以下成分的培養基MS鹽、B5維生素、3％蔗糖，pH 5.7，4.0mg/L對氯苯氧基乙酸、0.005mg/L激動素，再蓋上無菌濾紙。
2-3天共培養後，將外植體移入深的培養平板中，其中裝有MS鹽、B5維生素、3％蔗糖，0.8％瓊脂，pH 5.7，1mg/L BA，500mg/L羧苄青黴素，50mg/L頭孢噻肟，200mg/L卡那黴素或175mg/L慶大黴素，用於選擇。每個平板放入7個外植體。3周後，將它們轉移到新鮮培養基中，每板5個外植體。將外植體在25℃培養室中培養，持續光照(冷光)。
將轉化植株在22℃培養室中培育幾周，16-8小時光-暗周期，光強度220μEm-2sec-1，然後移入溫室。將植株在溫室內保持在標準條件下。授粉後，在不同階段收穫發育中的種子，貯藏在-70℃。收穫成熟種子，在受控條件(溫度約為17℃，溼度約為30％)下貯藏。
實施例6轉基因油菜植物中啟動子的表徵從用pMON65427、pMON65431或pMON65432轉化的各R0植株中，在授粉後的不同時間點，收穫多達5個長角果。將長角果用18號針頭劃開，讓染色液接觸到發育中的種子。將長角果在含有以下成分的溶液中於37℃保溫約24小時50mM NaPO4(pH 7.2)、100μM鐵氰化鉀、100μM亞鐵氰化鉀、0.03％Triton X-100、20％甲醇和2.5mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖醛酸(X-gluc)。通過在70％乙醇/30％H2O中、在37℃保溫過夜，除去染色組織中的葉綠素。立即對染色組織拍照，或者將其移到70％乙醇/30％甘油(v/v)溶液中，於4℃保存，直到進行拍照。根據樣品是否呈藍色記錄為陽性(+)或陰性(-)。
對於pMON65431，所篩選的10個植株中有6株(6/10)在至少一個時間點檢測到種子的活性水平。各轉化子的時程數據見表2和表3。
表2.發育中的油菜種子的P-Gm.701202739-0:3:1表達
表3.發育中的油菜種子的P-Gm.701209813-0:3:1表達
對於pMON65427，所篩選的10個植株中有10株(10/10)在至少一個時間點檢測到的種子活性水平。各轉化子的時程數據見表4。
表4.發育中的油菜種子的P-At.TT-0:3:2表達
上文說明並描述了本發明的原理，對於本領域技術人員顯而易見的是，只要不偏離這些原則，可以對本發明的安排和細節進行修改。我們要求保護所附權利要求書的精神和範圍內的所有修改。本說明書中引用的所有出版物和公開的專利文件都通過引用結合到本文中，其程度如同每個出版物或專利申請都通過具體和單獨的引用結合到本文中一樣。
序列表110Monsanto Technology LLCRuezinsky，Diane M.
Tzafrir，IrisConner，Timothy W.
120用於植物的啟動子分子130MONS055US140未知1412005-09-12150U.S.60/609,7701512004-09-141605170PatentIn version 3.32101211663212DNA213大豆(Glycine max)4001cgtaaacctt tttatataag ttttatccaa ctgtagtaca gatgatttag ttcactaaaa60ttgtttatat accttttact caagttacca ataattttct ttcagtatta tcgagagtca120agttagtacc gaaaaaccta ttgtattatt cttgagttac agtgcgctag gctcagcatt180actgagagct ttttcgatgt catcgatata aaatttaacg agatggtgga gtatttattg240atgaatatta agtcatcaat atacaatgag tttttgctat tacaactcag taaatctttt300gtgcaattaa ttattttgct ttcaattgat cccttgtgta cgttacattg atgctaatgg360atgaaattag ccaacagaac tcttaatatg aaaaatgaga gtatctggtc tgaaattata420catttttttt accatcacaa ttgaacataa aagaaggact atcacaattg ataaggatat480tagcaattaa ggaaatagat tccttatatt agcttccacc tcaaaactga attttgttgt540aattaaggaa aaaatgctga catccataat tatgagtatc tcataacgtg acaaaaaaag600ttaaatatct gtattttgga taaatatttt ttaagcttta ttttatttta tctgagggtc660ata 6632102211669212DNA213大豆(Glycine max)4002
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223合成引物4003gcccgggcgg tttaccggaa ttgtatgtca atgg34210421129212DNA213人工序列220
223合成引物4004tcccatggtc acttttctct ctcttgtgc 292105211964212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)4005ggtttaccgg aattgtatgt caatggtgtt aaccacatga cgtcctatac ttcatatatg60tggtcatgta atacatctac ttcgtgtcta cttcgtgtag ctggatatac aatgtatagt120aggtatgtgt gaccatgtat tctcttatac tttgtttacc tagcaatctt ttttttaaat180taaaataaat atgcggttta gatatgaaac tacccaacaa atttaacatt ttaaacgttc240ataacgtaaa acgacgtcgt tatagacaca tattttccat gtgtctgctg acttatcatc300
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1.一種啟動子，它包含選自以下的多核苷酸序列(a)包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO5序列的多核苷酸序列，(b)包含(a)的多核苷酸序列片段的多核苷酸序列，其能夠調節操作性連接的可轉錄多核苷酸分子的轉錄；和(c)包含與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列，其能夠調節操作性連接的可轉錄多核苷酸分子的轉錄。
2.權利要求1的啟動子，其中所述啟動子包含與(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有約90％同一性至約99％序列同一性的多核苷酸序列。
3.權利要求1的啟動子，其中所述啟動子包含與(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有約80％同一性至約89％序列同一性的多核苷酸序列。
4.權利要求1的啟動子，其中所述啟動子包含與(a)的多核苷酸序列或(b)的片段具有約70％同一性至約79％序列同一性的多核苷酸序列。
5.一種構建體，它包含與可轉錄多核苷酸分子操作性連接的權利要求1的啟動子。
6.權利要求5的構建體，其中所述可轉錄多核苷酸分子是農學目標基因。
7.權利要求5的構建體，其中所述可轉錄多核苷酸分子是標記基因。
8.用權利要求5的構建體穩定轉化的轉基因植物或其部分。
9.權利要求8的轉基因植物，其中所述植物是選自以下的雙子葉植物菸草、番茄、馬鈴薯、大豆、棉花、油菜、向日葵和苜蓿。
10.權利要求8的轉基因植物，其中所述可轉錄多核苷酸分子使所述轉基因植物種子的含油量發生改變。
11.權利要求8的轉基因植物，其中所述可轉錄多核苷酸分子使所述轉基因植物種子的蛋白質品質發生改變。
12.權利要求8的轉基因植物，其中所述可轉錄多核苷酸分子使所述轉基因植物的微量營養素含量發生改變。
13.用權利要求5的構建體轉化的轉基因種子。
14.用權利要求5的構建體轉化的轉基因細胞。
15.來自權利要求13的轉基因種子的油，其中所述油包含可檢測核酸，所述核酸包含權利要求1的啟動子。
16.來自權利要求13的轉基因種子的膳食，其中所述膳食包含可檢測核酸，所述核酸包含權利要求1的啟動子。
17.一種製備植物油的方法，該方法包括以下步驟a)獲取權利要求13的種子；和b)從所述種子中提取油。
18.一種製備膳食的方法，該方法包括以下步驟a)荻取權利要求8的植物或其部分；和b)從所述植物或其部分製備膳食。
19.一種製備食物或飼料的方法，該方法包括以下步驟a)獲取權利要求8的植物或其部分；和b)從所述植物或其部分製備食物或飼料。
全文摘要
本發明涉及用於在植物中調節基因表達的多核苷酸分子。具體地講，本發明涉及從大豆(Glycine max)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離的啟動子，所述啟動子可用於調節異源多核苷酸分子在植物中的基因表達。本發明也涉及含有所述異源多核苷酸分子的表達構建體和轉基因植物。
文檔編號A01H5/10GK101056975SQ200580038233
公開日2007年10月17日 申請日期2005年9月12日 優先權日2004年9月14日
發明者D·M·呂津斯基, I·查夫裡爾, T·W·康納 申請人:孟山都技術有限公司