低分子量和極低分子量肝素獲取工藝的製作方法
2023-04-29 02:46:36 1
低分子量和極低分子量肝素獲取工藝的製作方法
【專利摘要】本發明指的是涵蓋肝素-苯索氯胺鹽中肝素鈉鹽化、有機介質解聚和形成鹼性金屬鹽或鹼土鹽的鹽化階段的低分子量(HBPM)和極低分子量(HMBPM)肝素製備工藝。也可以指通過本發明中所述工藝獲取的產物。
【專利說明】低分子量和極低分子量肝素獲取工藝
[0001] 發明目的
[0002] 本發明指的是低分子量（HBPM)和極低分子量（HMBPM)肝素製備工藝。
[0003] 發明背景
[0004] 肝素是一種由糖醛酸（L-艾杜糖醛苷或D-葡萄糖醛酸）和D-氨基葡萄糖交替組 成的黏多糖硫酸脂。L-艾杜糖醛苷可以是2-0-硫酸化的，D-氨基葡萄糖可以為N-硫酸 化和/或6-0-硫酸化的，小範圍內也可以是N-乙醯化或3-0-硫酸化的（《肝素寡糖主要 成分量化和映射》LinhardtRJ,RiceKG,KimYSetal.BiochemJ1988;254:781-787)。 肝素優先作為鈉鹽而使用，但也可以作為其他鹼性金屬鹽或鹼土鹽而使用，並且主要作為 抗血栓和抗凝血藥物而應用（《主要動靜脈血栓栓塞抗凝治療》TranHAM,GinsbergJS。 《基本原則和臨床實踐》ColmanRW，MarderVJ,ClowesAW,GeorgeJN，GoldhaberSZ(Ed)， LippincottWilliams和Wilkins;2006:1673-1688)。
[0005] 根據分子量，肝素可分為普通肝素（HNF)、低分子量肝素（HBPM)和極低分子量肝 素（HMBPM)。HBPM和HMBPM通過HNF原分子的解聚獲得。
[0006] 如在其他類型肝素中出現的一樣，HBPM的抗血栓作用需要抗凝血酶III(ATIII)。 通過特定的糖胺序列，肝素與抗凝血酶相連，形成HBPM-ATIII-Xa因子三元複合物。該抑制 作用也稱為抗血栓作用。相反的，在抗凝血作用中，凝血酶中和需要HBPM-ATIII-IIa因子 三元複合物的形成，為此，至少需要18種糖類。
[0007] HBPM中肝素鈉的改進很大程度上是因為與抗凝血作用相比，抗血栓作用中ATIII 的活性較強。
[0008] 另一方面，在普通肝素以及通過解聚方法獲得的多種HBPM或HMBPM(酶、亞硝酸、 0消除等）中，存在能夠讓我們通過具體的雙糖單位成分量化法確定多糖量的方法，即結 合到N-磺基-3-0-磺基-D-葡糖胺（ANS，3S)中的D-葡糖醛酸（G)。該方法可獲得肝素 結構中雙糖佔比與多糖成分間的比例關係，即確定相關肝素的抗FXa活性（低分子量肝素： 二維核磁共振光譜結構分化。GuerriniM，GuglieriS，NaggiA，SasisekharamR和Torri G。血栓與止血學術研討會2007;33:478-487)。
[0009] 在現有技術中已經記錄了多種HBPM製備方法。在EP01955436專利文件中描述了 通過涵蓋肝素-苯索氯胺鹽中肝素鹽鹽化、肝素-苄索氯銨鹽鹽化、肝素苄酯鈉鹽提純和獲 取、苄索氯銨鹽中肝素鈉鹽化、有機介質中的強鹼解聚、苄酯皂化以及產物提純（若有需要 的話）階段的工藝獲取HBPM的過程。在本發明中生成相應的季銨鹽肝素來取代需要事先 形成的肝素苄酯中間體，季銨鹽肝素提取物可作為基體。本發明中所描述的工藝是最簡單 的，可省略製備肝素苄酯中間體的步驟，既節省費用也節約了生產時間。
[0010] EP1070503專利文件描述了具備以下特性的低分子量肝素獲取工藝，平均分子量： 2000-4000D，抗FXa活性：10〇-15〇n/mg，抗Flla活性小於或等於l〇n/mg。通過以非水性 介質為基體的苄索肝素處理獲得HBPM的具體步驟為：肝素-苯索氯胺鹽中肝素鈉鹽化、以 有機介質為基礎的初級解聚、苄酯鈉鹽鹽化、初級解聚後獲得的中間體苄酯鈉鹽形成、以有 機介質為基礎的二級解聚、苄酯鈉鹽鹽化和最後的提純。
[0011] 除非所形成的鹽是苯索肝素鹽，否則在ES2003197專利文件中也將描述此前 EP1070503專利文件中所建議的相同工藝。本工藝所使用的基體為TritonB-氫氧化四烴 銨，在文件中講述到可使用任何氫氧化四烴銨化物，但沒有教授如何在本工藝中影響基體 並且解釋在使用任何氫氧化四烴銨時，該物質不是具有決定性的元素。
[0012] 同時，通過對現有技術的了解，在該行業中具備較大的興趣開發HBPM和HMBPM制 備的有效工藝，該工藝可獲得最大的ATIII糖胺序列，並且省略掉肝素-苄索氯銨鹽鹽化、 苄索氯銨鹽中肝素鈉鹽化以及苄酯皂化階段。
[0013] 發明描沐
[0014]
【發明者】已經發現了一個高收益和高選擇性的HBPM和HMBPM獲取新工藝，從而獲得 最具選擇性的製備過程。此外，與其他熟知的工藝相比，所發明的工藝是最簡單的。發明人 員已經證實在通過0消除機制進行的HBPM和HMBPM半合成工藝中，苯索肝素鹽解聚提取 物的專門作用為強鹼作用，可以阻止ATIII活性糖胺的保留，因為在其結構中糖胺呈現為 三硫酸單糖，與含有較低硫化度單糖的其他分子破裂結構相比，更能阻礙活性糖胺的保留。
[0015] 工藝的特點是第一階段為鹽化（即一種鹽轉化為另一種鹽的反應）、使用磷基或 胍基進行的解聚以及最終的鹽化。
[0016] 因此，發明的第一階段指的是涵蓋以下階段的發明成分獲取工藝：
[0017]a)苯索肝素鹽中鹼性金屬肝素鈉或鹼土肝素鈉的鹽化
[0018] b)添加磷基或胍基的有機介質解聚；以及
[0019]c)形成鹼性金屬鹽或鹼土鹽的鹽化
[0020] 圖片描沐
[0021] 以一組發明樣例（但不僅限於此）的圖片、插圖描述本文件。
[0022] 圖1 :使用TritonB解聚的樣本4中所述產物的13C-1HHSQC光譜異頭信號區域 (H1-C1關係）展現，在氘化水（D20)中記錄為298K。在光譜中我們可以觀察到組成糖胺的 5個單糖的相關5個關係峰值。ANSred、還原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-0硫酸化的 L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、來自ANS、3S和ANS-(G) 的D-葡糖醛酸、來自D-葡糖醛酸環的N-磺基-D-葡糖胺。畫圈突顯G-(ANS，3S)單元的 H1-C1關係峰值，因為這是最具糖胺特點的信號，並且可視為參考以便在多個樣本中確定該 信號出現的數量。
[0023] 圖2:使用BEMP解聚的樣本4中所述產物的13C-1HHSQC光譜異頭信號區域 (H1-C1關係）展現，在氘化水（D20)中記錄為298K。在光譜中我們可以觀察到組成糖胺的 5個單糖的相關5個關係峰值。ANSred、還原末端的N-磺基-D-葡糖胺；I2S、2-0硫酸化的 L-艾杜糖醛苷；ANS、3S、3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖；G-(ANS，3S)、來自ANS、3S和ANS-(G) 的D-葡糖醛酸、來自D-葡糖醛酸環的N-磺基-D-葡糖胺。畫圈突顯G-(ANS，3S)單元的 H1-C1關係峰值，因為這是最具糖胺特點的信號，並且可視為參考以便在多個樣本中確定該 信號出現的數量。
[0024] 發明詳沐
[0025] 在本發明中，"磷基或胍基"術語指的是強親核性中性基團，如 Pl-t-Bu，P2-t-Bu，t-BuP4 和BEMP(2-叔-丁基亞氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全 氫-1，3, 2-二吖磷英）和TTMG(2-叔-丁基-1，1，3, 3-四甲基胍），非介子溶劑中的強鹼 (MeCNpKaBEMP= 27. 6,DMSOpKat-BuP4H+ = 32)。
[0026] 如上所述，發明的第一方面指的是涵蓋以下階段的HMBPM和/或HBPM成分獲取工 乙：
[0027]a)苯索肝素鹽中鹼性金屬肝素鈉或鹼土肝素鈉的鹽化
[0028] b)添加磷基或胍基的有機介質解聚；以及
[0029]c)形成鹼性金屬鹽或鹼土鹽的鹽化
[0030] 最終產物需要在階段b)和階段c)中進行淨化時，需添加有機和/或無機過氧化 物。
[0031] 階段a)中的鹼性金屬肝素鹽或鹼土肝素鹽最好是鹼性金屬普通肝素鹽或鹼土普 通肝素鹽。
[0032] 所使用的過氧化物最好是過氧化氫。其他有機過氧化物範例為：過氧化甲乙酮、過 氧化苯甲醯、過氧化丙酮。無機過氧化物範例為含有（〇2)_2和IA及IIA組金屬物的複合 物。
[0033]階段c)後獲得的產物需要進行淨化處理。最好通過濃度為5-20% (p/v)，pH值 為6-7. 5,氯化鈉濃度為3-15% (p/v)的水溶液，並且使用甲醇沉澱法進行提純。通過濃度 為7. 5-12. 5% (p/v)，pH值為6. 5-7. 25,氯化鈉濃度為5-10% (p/v)的水溶液，使用甲醇 沉澱法進行產物稀釋。
[0034] 使用有機溶劑進行解聚，有機溶劑最好為二氯甲烷，二氯乙烷，氯仿，二甲基甲醯 胺和/或甲醯胺。在20-40°C溫度環境下所使用的有機溶劑優先考慮二氯甲烷。
[0035] 至少連續添加2次鹼性物進行階段b)的解聚。最好連續添加3次。
[0036] 重量比例：苯索肝素鹽和每個添加物基體之間的體積比為1:0. 5和1:0. 05,最好 為 1:0.3 和 1:0.1。
[0037] 重量比例：苯索肝素鹽和過氧化氫之間的體積比為1:1和1:0. 01，最好為1:0. 2 和 1:0.05〇
[0038] 使用醋酸鈉醇類溶液中反應介質沉降方法進行階段c)的鹽化，最好在10% (p/v) 醋酸鈉甲醇溶液中進行。
[0039] 本發明的第二階段為通過含有大比例糖胺和較大的抗血栓活性的發明工藝所獲 得的產物。
[0040] 範例
[0041] 接下來所示具體範例用於說明本發明的屬性。這些範例僅用於解釋性說明，不限 制本發明的描述內容。
[0042]範例1
[0043] 100g的肝素鈉稀釋在725ml的水中，在該溶液中添加880ml的苯扎氯銨/50 %p/ v水。過濾產物、使用水進行清洗並且冷凍乾燥。可獲得233g苯索肝素鹽。
[0044] 將在上一階段獲得的10g苯索肝素鹽稀釋在30ml的二氯甲烷中，並且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加BEMP(2-叔-丁基亞氨基-2-二乙胺基-1，3-二甲基全 氫-1,3, 2-二吖磷英）：
[0045] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0046] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0047] -1. 72ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0048] 在溶液中添加1ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此後在60ml的 醋酸鈉甲醇（10%P/V)溶液中進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗。所獲 得的產物在5ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，並且使用 125ml的甲醇溶劑進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗並且在35°C的溫度 下在真空爐中進行乾燥。獲得3. 39g產物。
[0049] 將2g解聚產物在14. 5ml的水中稀釋，在所獲得的溶液中添加17. 6ml的苯扎氯 銨/50%p/v水。過濾產物、使用水進行清洗並且冷凍乾燥。所獲得的4. 84g產物稀釋在 14. 5ml的二氯甲烷中，並且加熱到35°C。在該溶液中添加0. 83ml的BEMP並且在35°C下維 持16小時的反應活性。16小時後在26ml的醋酸鈉甲醇（10%p/v)溶液中進行沉澱。通 過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗。所獲得的產物在5ml的水中進行稀釋、中和、添加 氯化鈉，直至達到10%P/V的濃度，並且使用50ml的甲醇溶劑進行沉澱。
[0050] 通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗並且在35°C的溫度下在真空爐中進行幹 燥。
[0051] 獲得1. 32g產物（52. 1 %收益）。所獲得的產物特點如下所示：
[0052]-介質分子量：2903Da.
[0053]-抗FXa活性：193UI/mg.
[0054]-抗Flla活性：9. 3UI/mg.
[0055]範例2
[0056] 將50g的肝素鈉稀釋在365ml的水中，在該溶液中添加221g的苯扎氯銨/50%p/ v水。
[0057] 過濾產物、使用水進行清洗並且冷凍乾燥。可獲得128. 18g苯索肝素鹽。
[0058] 將在上一階段獲得的5g苯索肝素鹽稀釋在15ml的二氯甲烷中，並且加熱到35°C。 在該溶液中按3次份額添加BEMP:
[0059]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0060]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0061]-0.86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0062] 在溶液中添加0.50ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此後在30ml 的醋酸鈉甲醇（10%P/V)溶液中進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗。所 獲得的產物在2. 5ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，並且使 用75ml的甲醇溶劑進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗並且在35°C的溫度 下在真空爐中進行乾燥。獲得1. 40g產物。
[0063] 將1.40g解聚產物在10ml的水中稀釋，在所獲得的溶液中添加6. 18g的苯扎氯銨 /50%p/v水。過濾產物、使用水進行清洗並且冷凍乾燥。所獲得的3. 40g苯索肝素鹽稀釋 在10ml的二氯甲烷中，並且加熱到35°C。在該溶液中按三次份額添加BEMP:
[0064] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0065]-0.58ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0066] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0067] 在溶液中添加0.34ml過氧化氫，在35°C下維持16小時的反應活性，此後在20ml 的醋酸鈉甲醇（10%p/v)溶液中進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗。將 所獲得的產物在1. 7ml的水中進行稀釋、中和、添加氯化鈉，直至達到10%p/v的濃度，並且 使用50ml的甲醇溶劑進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇清洗並且在35°C的 溫度下在真空爐中進行乾燥。獲得〇.85g產物（43.6%收益）。所獲得的產物特點如下所 示：
[0068]-介質分子量：2787Da.
[0069] -抗FXa活性：121. 5n/mg.
[0070] -抗Flla活性：8. 2n/mg.
[0071]範例3
[0072] 將在範例2中獲得的0.50g產物稀釋在5ml的水中，進行中和，添加氯化鈉，直至 濃度達到10%P/V，並且使用6ml甲醇溶劑進行沉澱。通過離心方式篩出沉澱物，使用甲醇 清洗並且在35°C的溫度下在真空爐中進行乾燥。獲得0. 13g產物。所獲得的產物特點如下 所示：
[0073]-介質分子量：3, 534Da.
[0074]-抗FXa活性：125. 2n/mg.
[0075] -抗Flla活性：19. 4UI/mg.
[0076] 重複範例2所述步驟，但要使用TTMG基體，而不是BEMP基體。
[0077] 所獲得的產物特點如下所示：
[0078]-介質分子量：3704Da.
[0079] -抗FXa活性：118. 5n/mg.
[0080] -抗Flla活性：16. 2n/mg.
[0081] 範例4.比較性範例
[0082] 在本範例中研宄的是在發明工藝中改變基體的效果。使用TritonB和BEMP分別 進行相同的實驗，以便展示在發明工藝中使用磷基的影響情況。
[0083] 將50g的肝素鈉稀釋在水中，在該溶液中添加221g的苯扎氯銨/50%p/v水。過 濾產物、使用水進行清洗並且冷凍乾燥。可獲得128. 18g苯索肝素鹽。
[0084] 將在上一階段獲得的25g苯索肝素鹽稀釋在75ml的二氯甲烷中，並且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加TritonB:
[0085] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0086] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0087] -6. 25ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0088] 在溶液中添加2. 5ml的過氧化氫，接下來進行淨化以便獲得相關鈉鹽。所獲得的 產物進行鹽化，從而在上述條件和比例下獲得苯索肝素鹽。
[0089] 將在上一階段獲得的15. 68g苯索肝素鹽稀釋在47ml的二氯甲烷中，並且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加TritonB:
[0090] -3. 92ml的TritonB。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0091] -3. 92ml的TritonB。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0092] -3. 92ml的TritonB?在35°C下維持8小時的反應活性。
[0093] 獲得的產物特點如下：
[0094] -介質分子量：2387Da.
[0095]-抗FXa活性：94n/mg.
[0096] 使用BEMP基體解聚進行相同的實驗。
[0097] 將5g苯索肝素鹽稀釋在15ml的二氯甲烷中，加熱到35°C。在該溶液中按3次份 額添加BMP:
[0098] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0099] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0100] -0. 86ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0101] 在溶液中添加〇. 5ml的過氧化氫，接下來進行淨化以便獲得相關鈉鹽。所獲得的 產物進行鹽化，從而在上述條件和比例下獲得苯索肝素鹽。
[0102] 將在上一階段獲得的3. 40g苯索肝素鹽稀釋在10ml的二氯甲烷中，並且加熱到 35°C。在該溶液中按3次份額添加BEMP:
[0103] -0.58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0104] -0. 58ml的BEMP。在35°C下維持16小時的反應活性。
[0105]-0.58ml的BEMP。在35°C下維持8小時的反應活性。
[0106] 所獲得的產物特點如下：
[0107]-介質分子量：2787Da.
[0108] -抗FXa活性：121. 5n/mg.
[0109] 在該比較性範例中可以看出工藝中的磷基明顯增加了產物的抗FXa活性。
[0110] 樣本中可通過核磁共振（RMN)技術，使用13C-1HHSQC定量二維實驗（異核單量 子相干），根據MarcoGuerrini等人所述方法確定單糖平均含量。通過二維方法提高分辨 率，可確定一維光譜中重疊信號的數量，因而該技術最適用於研宄複合碳水化合物。這些分 子在1H-維光譜中呈現出較嚴重的重疊問題，這就難以確定1D中隔絕峰值的區域，進而難 以定量。
[0111] N-磺基-3-0-硫酸化的D-氨基葡萄糖G- (ANS，3S)中的D-葡糖醛酸單元數量呈 現在從天然肝素中獲取的GAG中，其數量多少直接與GAG的抗Xa活性相關，如M.Guerrini 等人所述。該糖屬於與III抗凝血酶具備相互作用的糖胺，並且僅在活躍序列中可以檢測 到。該葡糖醛酸異頭碳與直接相連的氫化物的關係信號出現在典型區域內，並且不會在 HSQC光譜中重疊，因此可使用其確定樣本中糖胺的比例分量。
[0112] 使用TritonB和BEMP解聚獲得的產物的13C-1HHSQC光譜分別在圖1和圖2中 所示，在圖片中多糖葡糖醛酸單元的相應異頭質子1H-13C的關係信號通過圓圈突顯出來。
[0113] 光譜中該信號的強度數值可使我們確定糖胺比例。
[0114] 表1?使用TritonB和BEMP的不同成分比例
[0115]
【權利要求】
1. HMBPM和/或HBPM成分獲取步驟，因為涵蓋以下階段： a) 肝素-苯索氯胺鹽中鹼性金屬肝素鹽或鹼土肝素鹽的鹽化； b) 通過添加磷基或胍基進行的有機介質解聚；以及 c) 形成鹼性金屬鹽或鹼土鹽的鹽化。
2. 根據專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為階段b)到階段c)談論的是在階段b) 獲得的過氧化氫產物。
3. 根據專利申請權項1和2中任意一條進行的獲取步驟，因為階段c)後獲得的產物需 要進行提純。
4. 根據專利申請權項3所進行的獲取步驟，因為階段c)後獲得的產物需通過濃度為 7. 5-12. 5% (p/v)，pH值為6. 5-7. 25,氯化鈉濃度為5-10% (p/v)的水溶液，並且使用甲醇 沉澱法進行提純。
5. 根據專利申請權項1-4所進行的獲取步驟，因為需要在20-40°C的溫度下，在二氯甲 烷中進行解聚。
6. 根據專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為在階段b)中苯索肝素鹽與每個添加基 體的重量：體積比為1:0. 5和1:0. 05。
7. 根據專利申請權項1所進行的獲取步驟，因為在階段b)中苯索肝素鹽與每個添加基 體的重量：體積比為1:0. 3和1:0. 1。
8. 根據專利申請權項2所進行的獲取步驟，因為在階段c)中苯索肝素鹽與過氧化氫的 重量：體積比為1:0. 1和1:0. 01。
9. 根據專利申請權項2所進行的獲取步驟，因為在階段c)中苯索肝素鹽與過氧化氫的 重量：體積比為1:0. 2和1:0. 05。
10. 通過專利申請權項1-9所獲得的產物。
【文檔編號】C08B37/10GK104507972SQ201380041068
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2012年8月2日
【發明者】古伊萊莫·弗蘭科羅德裡格斯, 伊本·古蒂耶羅阿杜裡斯 申請人:羅維藥品實驗室有限公司