檢測微生物的方法

2023-04-29 07:57:41

專利名稱：檢測微生物的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測微生物的方法，該方法例如用於半導體用洗液的質量控制、傳染病的診斷、環境微生物的檢測、食品中微生物的檢查等方面。
檢測微生物是出於各種目的，例如，半導體用洗液的質量控制、傳染病的診斷、環境微生物的檢測、食品中微生物的檢查。
作為檢測微生物的方法，可以舉出的例子有①培養法，它包括把試樣直接加入培養基並對這樣形成的菌落進行計數；②全細胞計數法，它包括，通過過濾試樣在濾膜上收集試樣中的細胞，然後固定、螢光染色、顯微觀察法進行細胞計數；③聚合酶鏈式反應(PCR)法，它包括考察菌株的核酸(多核苷酸)鏈特徵的存在；④流式細胞計數法，它包括，對細胞進行螢光標記，再行檢測；⑤ATP檢測法，它包括，檢測細胞中腺苷5′-三磷酸(ATP)來進行細胞計數。所有這些方法都存在一些問題，並且不是能進行簡便、快速檢測的方法。
例如，培養法的缺點是，由於培養通常需要24小時或更長時間(在一些情況下，真菌綱的檢測需要1周或更長時間)，該方法不能進行快速檢測。另外的缺點是，在一些情況下，由於不能用常規方法培養某些細菌，所以試樣中的微生物被漏掉了。全細胞計數法的缺點在於，為進行細胞計數需要象螢光顯微鏡、圖象分析儀等這樣的昂貴設備。PCR法的缺點是難於計量微生物細胞的總數。流式細胞計數法的缺點在於，例如微生物檢測極限低，而且由於固定用試劑(例如福馬林)的噪音使測量精度降低。ATP檢測法的缺點是，為進行檢測需要昂貴的測量設備。
為解決這類問題，開發了一種方法，它包括把要進行微生物檢測的試樣與含有前酚(pro-pheno1)氧化酶系統非活性型因子的昆蟲體液(下文中昆蟲體液縮寫為「PPO試劑」)混合使它們反應，例如觀測由於至少一種微生物細胞壁成分(例如(1→3)-β-D-葡聚糖(下文簡稱「β-葡聚糖」)或肽聚糖的染色度，以及根據觀測結果檢測微生物。不過，由於這種方法涉及象下面這樣的問題，所以也不是優選方法。由於該方法中試樣直接與PPO試劑混合，所以檢測易於受象試樣中鹽濃度這樣的因素影響。具體地說，鹽濃度高時，檢測靈敏度降低，這就需要很大精力去確定檢測條件。為檢測高鹽濃度試樣中的微生物，通常不可避免的是，微生物檢測針對適當稀釋的試樣進行。因此，降低了檢測靈敏度和測量精度。被不是得自微生物的β-葡聚糖所汙染的樣品，這種情形中，檢測結果可能是假陽性的。
鑑於這些情況，要用本發明解決的問題是提供一種簡便、快速且高精度地檢測各種試樣中微生物的方法。
本發明提供一種檢測微生物的方法，該方法包括，把試樣濾過一個濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統非活性型因子的昆蟲體液反應，以及根據由此引起的顏色變化檢測試樣中的微生物。


圖1表示實施例1得到的德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)檢測結果。
圖2表示實施例1得到的大腸桿菌(Escherichia coli)檢測結果。
圖3表示實施例2得到的大腸桿菌檢測結果。
圖4是表示實施例3所得結果的示意圖，其中試樣含有枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
圖5是表示實施例3所得結果的示意圖，其中試樣含有德氏乳桿菌。
圖6是表示採用了各種細菌的實施例3所得結果的示意圖。
圖7是表示實施例4所得結果的示意圖。
圖8是表示對比例3所得結果的示意圖。
本發明檢測微生物的方法包括，把試樣濾過一個濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與PPO試劑反應，以及根據由此引起的顏色變化檢測試樣中的微生物。
在探尋用一種PPO試劑簡便、快速和高精度地檢測各種試樣中微生物的方法的過程中，本發明人做出如下的發現，根據這些發現完成了本發明。當把試樣濾過一個孔徑大小適宜的濾膜，洗滌濾膜再與PPO試劑反應時，可以得到下述優勢。(1)採用一種PPO試劑可以簡便、快速、高精度地檢測一種或多種微生物，而不會有下列問題檢測易受試樣中鹽濃度的影響，並且當鹽濃度高時，檢測靈敏度降低，這就需要很大精力去確定檢測條件；在這種情形中，不可避免的是，微生物檢測針對適當稀釋的試樣進行，降低了檢測靈敏度和測量精度；在試樣被不是得自微生物的β-葡聚糖所汙染的情形中，檢測結果可能是假陽性的。(2)將試樣濾過濾膜得以濃縮，這樣就提高了檢測靈敏度。
對用於本發明檢測方法的試樣沒有特別的限制，只要有必要檢測試樣中微生物的存在即可。例如，試樣包括半導體用洗液、體液(例如血液、血漿、血清和腦脊髓液)、尿、自來水、工廠廢物、食品、飲料、洗滌象血透儀、醫療器械等這樣的儀器後的溶液。
對用於本發明的濾膜沒有特別的限制，只要它具有適宜的孔徑大小並且不與PPO試劑反應(或者與其反應但反應程度不會妨礙微生物的檢測)即可。濾膜的優選實例是板式(膜式)濾膜，這些濾膜由象聚偏氟乙烯、聚碸、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚醯胺、尼龍或纖維素衍生物(例如乙酸纖維素、硝酸纖維素或其混合物)這樣的材料製成，而且容易判斷由β-葡聚糖和/或肽聚糖與PPO試劑反應引起的顏色。當使用一種由通常易於受β-葡聚糖汙染的纖維素衍生物製成的濾膜時，必須檢查濾膜是否受到汙染。如果受到汙染，最好用常規手段除去汙染物。
可以把可商購的濾膜原樣用於本發明。可商購的濾膜的具體例子有Durapore(一種聚偏氟乙烯濾膜，Japan Millipore Ltd.生產)、HTTuffryn(一種聚碸濾膜，Gelman Sciences Inc.生產)、Millex(一種聚四氟乙烯濾膜，Japan Millipore Ltd.生產)、Isopore(一種聚乙烯吡咯烷酮濾膜，Japan Millipore Ltd.生產)、聚醯胺濾膜(購自SartoriusAG)、尼龍濾膜(購自Corning Inc.)、乙酸纖維素濾膜和硝酸纖維素濾膜(購自Iwaki Glass Co.，Ltd.)以及一種纖維素濾膜MF-Milli-pore(購自Japan Millipore Ltd.)。
本發明中，通過適當選擇所用濾膜的孔徑大小，可將待測微生物的種類限制在一定範圍內。例如，要檢測細菌和真菌綱時，孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜是優選的。要檢測象酵母和黴菌這樣的真菌時，孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜是優選的。要檢測黴菌時，孔徑大小為5μm或更大的濾膜是優選的。例如，在試樣含有包括細菌在內的多種微生物的情況下，把試樣濾過一個孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜，把濾液濾過一個孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜，再對後一濾膜進行本發明的檢測，這樣只能檢測到這些微生物中的細菌。
作為用於本發明的濾器，可用下列任一類型的濾器(1)由板式濾膜和支架構成的產品，濾膜和支架相互分開，因此可以單獨滅菌；(2)整體式一次性的滅菌產品。也可使用裝有濾膜的微量滴定板(例如Multiscreen GV Filter Plate，Japan Millipore Ltd.生產)。
當這類濾膜受到肽聚糖或β-葡聚糖汙染時，最好用常規手段除去汙染物。
可以把任何PPO試劑用作本發明中所用的PPO試劑，只要該試劑得自昆蟲體液、含有前酚氧化酶系統非活化型因子且能夠與微生物細胞壁中存在的β-葡聚糖和肽聚糖中的至少一種物質反應激活酚氧化酶即可。既然PPO試劑可以與微生物細胞壁中存在的β-葡聚糖和/或肽聚糖反應而變黑，PPO試劑自身就可用於本發明。但是，PPO試劑也可以與所謂的合成底物混合後使用。這種合成底物是一種酶的底物，這種酶能通過PPO試劑與β-葡聚糖和/或肽聚糖反應而激活，並由於酶的作用產生一種適宜的有色物質或包括螢光物質在內的類似物質。
PPO試劑通常是用常規方法由昆蟲體液製備的，而且該試劑可以通過由遺傳重組製備的前酚氧化酶系統非活性型因子的適當組合來製備。
儘管對針對其體液進行收集的昆蟲沒有特別的限制，昆蟲是越多越好，而且可以用已有方法養殖。昆蟲包括，例如，鱗翅目，如菸草天娥，Gelleria melonella，Hyalphoma ceropia，家蠶等；雙翅目，如Sar-cophage peregria，家蠅等；直翅目，如飛蝗，migratoria Teleogryllus等；以及鞘翅目，如天牛等。但昆蟲並不局限於這些。作為體液，從體腔收集的血液是最容易得到的，所以通常使用血液。
作為從上面列舉的昆蟲收集體液的方法，可以舉一個例子。把昆蟲放到冰上以阻止其移動；把含蔗糖的生理鹽水注射到體腔內，其中蔗糖中含有甘蔗因子，甘蔗因子含有包括葡萄糖、胺基酸和得自甘蔗因子的其它成分在內的高分子量物質，作為雜質或含有甘蔗因子的生理鹽水。把昆蟲放置一會兒，然後從體腔收集血液。把由此獲得的血液離心使不含血細胞，再進行透析，這樣就得到可用作本發明PPO試劑的血漿。在這種血漿中，同時存在一種能與β-葡聚糖發生特異反應以顯示酶活性或誘導酶活性的物質和一種能與肽聚糖發生特異反應以顯示酶活性或誘導酶活性的物質。所以，把血漿用作PPO試劑時，有可能檢測出含有β-葡聚糖或肽聚糖作為細胞壁成分的所有微生物。可使用商購試劑作為這種試劑(例如，SLPTM試劑，購自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。
對上述昆蟲血漿進行適當處理，也可以得到一種與β-葡聚糖反應但不與肽聚糖反應的PPO試劑以及一種與肽聚糖反應但不與β-葡聚糖反應的PPO試劑。也就是說，製備能特異性檢測β-葡聚糖的PPO試劑的方法的實施例披露於JP-A 63-141598(U.S.P.4,970,152)中；製備能特異性檢測肽聚糖的PPO試劑的方法的實施例披露於JP-A 63-141599(U.S.P.4,970,152)中。
下面對這些方法作進一步闡述。
按上述方法獲得的血漿中，同時存在著一種不與內毒素反應但與β-葡聚糖特異性反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質以及一種與肽聚糖特異性反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質。為獲得能特異性檢測β-葡聚糖的PPO試劑，從上述血漿中除去這種能與肽聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質就足夠了。為獲得能特異性檢測肽聚糖的PPO試劑，從上述血漿中除去這種能與β-葡聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質就足夠了。作為從上述血漿中除去能與肽聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質的方法，或者從上述血漿中除去能與β-葡聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質的方法，可以舉出的例子有生物化學領域中常用的分離和純化方法。用採用結合肽聚糖的載體的親和層析可以非常簡便、有效地除去能與肽聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質。採用結合β-葡聚糖的載體的親和層析可以非常簡便、有效地除去能與β-葡聚糖反應以顯示酶活力或誘導酶活力的物質。
例如，本發明的方法實際上是下述這樣實施的。
首先，把適量的試樣濾過一個如上所述的合適的濾膜，在濾膜上截留包括細菌和真菌綱(例如，酵母和黴菌)在內的微生物。然後，用合適的洗液洗滌濾膜，除去試樣中存在的、除微生物之外的物質。把適當體積的上述那種PPO試劑滴到經上述處理的濾膜上，使反應在一定條件(如0～50℃、優選20～40℃)下發生。之後觀察濾膜顏色隨時間的變化。可以檢測出試樣中微生物的存在或者根據這種情況下引起的顏色變化和負對照試驗以及正對照試驗引起的顏色變化的差異可以測定試樣中微生物濃度。負對照試驗是這樣進行的，即除了使用不含β-葡聚糖和肽聚糖的水、緩衝液或類似物質作為試樣外，採用上述相同試劑、使用相同方法。正對照試驗是這樣進行的，即除了使用含有適宜濃度微生物的試樣溶液之外，採用上述相同試劑、使用相同方法。在上述測定中，改變正對照試驗可以進行微生物濃度的半定量測定。
上述方法中，也可進行下列步驟把裝有濾膜的微量滴定板(例如Multiscreen GV Filter Plate，Japan Milipore Ltd.生產)用作濾器將許多試樣過濾，洗滌濾膜，再與PPO試劑進行反應，之後用微量滴定板讀數器觀察濾膜的顏色變化。根據觀察結果檢測出每個試樣中微生物的存在或每個試樣中微生物濃度。用這種方法檢測微生物時，可對大量試樣快速地進行目標檢測。
另外，由於上述檢測是這樣進行的，即把試樣濾過一個濾膜，洗滌濾膜，然後使濾膜與一種PPO試劑反應，所以，幾乎沒有試樣中的鹽、水溶性β-葡聚糖等影響檢測的可能性。
對上述方法中所用洗液沒有特別的限制，只要該洗液未受到β-葡聚糖和肽聚糖的汙染而且不會降低濾膜性能即可。洗液的適宜例子有水和pH6～8、含有10～150mM(優選20～40mM)緩衝液(例如，Goods緩衝液或磷酸鹽緩衝液)或鹽(例如NaCl)的溶液。
把一種鹼液(10mM～4M，優選50mM～1M)用作洗液，可以洗掉水不溶性β-葡聚糖。所以，在估計含有水不溶性β-葡聚糖的試樣中，可以特異性地檢測出得自試樣所含細菌的肽聚糖。方法是用這種洗液洗滌濾膜再選擇性地使用上述那種普通洗液。
在檢測含脂試樣(如化妝用膏、飼料漿等)或含有機溶劑的試樣時，可以消除試樣中這些物質的影響。方法是，把適當的有機溶劑用作洗液洗滌濾膜，接著用上述的普通洗液洗滌濾膜。
下面結合實施例和對比例更詳細地闡述本發明，這些例子不是限制性的而是用於舉例說明。
實施例1(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購PPO試劑(SLPTM試劑，購自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；3ml)溶於6ml裝於SLPTM試劑盒(購自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而製備的。
·濾膜使用Millex 4mm GV(Japan Millipore Ltd.生產)。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產的注射用水。
·3％氯化鈉水溶液使用一種溶液，該溶液是這樣製備的，即把250℃熱處理2小時的氯化鈉(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產；特級)溶於注射用水中達到濃度為3％。(2)試樣把各種懸浮液用作試樣，懸浮液是這樣製備的，即把乳酸菌(德氏乳桿菌)或大腸桿菌以103、104或105細胞/毫升的量懸浮於注射用水中或3％氯化鈉水溶液中。(3)檢測方法用2ml洗液洗滌濾膜，接著把每種預定試樣各1ml濾過經洗滌的濾膜。用2ml洗液洗滌該濾膜，之後把0.01ml PPO試劑滴在濾膜上，目視觀察濾膜的著色度。(4)結果圖1表示把用水製備的不同濃度德氏乳桿菌懸浮液作為試樣時所得到的結果。圖2表示把用注射用水製備的不同濃度大腸桿菌懸浮液作為試樣時所得到的結果。圖1和圖2都表示出負對照試驗(NC)的結果。進行負對照試驗是出於對比的目的，採用與製備各種試樣時相同的水作為試樣。
從圖1和圖2可以看出，通過過濾作用而有細胞截留於其上的濾膜比負對照試驗(NC)處理過的濾膜著色速率明顯加快，而且反應開始10～20分鐘之後可以判斷反應是正還是負。同時可以看出，即使在103細胞/毫升的濃度下也能檢測出德氏乳桿菌；即使在104細胞/毫升的濃度下也能檢測出大腸桿菌。
使用由3％氯化鈉水溶液製備的試樣時，得到如上所述的相同結果。對比例1用已知方法檢測微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實施例1中所用的相同。
·水與實施例1中所用的相同。
·3％氯化鈉水溶液與實施例1中所用的相同。
·測定裝置採用Toxinometer ET-301(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)。(2)試樣與實施例1中所用的相同。(3)檢測方法把0.1mlPPO試劑和0.1ml含有濃度為104細胞/毫升德氏乳桿菌或大腸桿菌的試樣混合併攪拌後，用Toxinometer ET-301測定Tg值(透射光數量達到一個預定值所需的時間)。(4)結果已用水製成的德氏乳桿菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液都用作試樣時，對德氏乳桿菌而言，Tg值為32.4分鐘；對大腸桿菌而言，Tg值為59.4分鐘。因此可以看出，在這些試樣的情形中，在90分鐘測定時間內反應判斷為正的。另一方面，已用3％氯化鈉水溶液製成的德氏乳桿菌懸浮液和大腸桿菌懸浮液都用作試樣時，對德氏乳桿菌和大腸桿菌而言，在90分鐘測定時間內都不能得到Tg值。所以在這些試樣的情形中，反應不能判斷為正。
作為負對照試驗進行上述相同測定時，即採用製備試樣所用相同注射用水和3％氯化鈉水溶液作為試樣時，不能得到Tg值。也就是說，在兩種情形中反應都不能判斷為正。
由實施例1和對比例1的結果可以看出，應用本發明的方法可以檢測高鹽濃度溶液中的微生物，而常規方法是檢測不出的。
實施例2(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液作為PPO試劑，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購PPO試劑(SLPTM試劑，購自Wako Pure Chemical Indus-tries，Ltd.；3ml)溶於6ml裝於SLPTM試劑盒(購自Wako PureChemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而製備的。
·濾膜使用一次性的無菌針筒式濾膜3mm(尼龍膜，由Corning Inc.生產)。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產的注射用水。
·洗滌血透儀之後的溶液用注射用水充滿含有乙酸中空纖維的血透儀(FB-70A，NiproCorp.生產)，在室溫下放置1小時，之後將充滿的水取出，作為洗滌血透儀之後的溶液。(2)試樣把懸浮液用作試樣，懸浮液的製備是把大腸桿菌懸浮於水中或洗滌血透儀之後的溶液中達到104細胞/毫升的濃度。(3)檢測方法用2ml洗液洗滌濾膜，接著把每種試樣各0.5ml濾過經洗滌的濾膜。用2ml洗液洗滌該濾膜，之後把0.01mlPPO試劑滴在濾膜上，目視觀察濾膜的著色度。(4)結果圖3表示使用大腸桿菌懸浮液(用水製備的)所得的檢測結果。圖3還表示出負對照試驗(NC)的結果。進行負對照試驗是出於對比的目的，採用與製備上述試樣時相同的水作為試樣。
從圖3可以看出，通過過濾作用而有細胞截留於其上的濾膜比負對照試驗(NC)處理過的濾膜著色速率明顯加快，而且反應開始20分鐘之後可以判斷存在104細胞/毫升濃度的大腸桿菌，判斷反應是正還是負。
當採用由洗滌血透儀之後的溶液製備的試樣時，得到如上所述的相同結果。對比例2用已知方法檢測微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實施例2中所用的相同。
·水與實施例2中所用的相同。
·洗滌血透儀之後的溶液與實施例2中所用的相同。
·測定裝置使用Toxinometer ET-301(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產)。(2)試樣與實施例2中所用的相同。(3)檢測方法把0.1mlPPO試劑和0.1ml每種試樣混合併攪拌後，用Toxi-nometer ET-301測定Tg值(透射光數量達到一個預定值所需的時間)。(4)結果把用水製備的大腸桿菌懸浮液用作試樣時，得到的Tg值為59.4分鐘。把製備大腸桿菌懸浮液所用的相同的水用作負對照的試樣時，在90分鐘測定時間內得不到Tg值。從這些事實可以看出，在用水製備的大腸桿菌懸浮液的情形中，可以在90分鐘測定時間內判定反應是正還是負。
另一方面，把用洗滌血透儀之後的溶液製備的大腸桿菌懸浮液用作試樣時，以及把製備大腸桿菌懸浮液所用的同一種洗滌血透儀之後的溶液用作負對照試樣時，都得到Tg值約為6分鐘。由此發現，不能檢測出試樣(大腸桿菌懸浮液)中微生物的存在。可以推測，這一結果是由於洗滌血透儀之後的溶液中β-葡聚糖的溶解。
從實施例2和對比例2的結果可以看出，應用本發明的方法可以檢測出洗滌血透儀之後的溶液中的微生物，而用常規方法是檢測不出的。
實施例3(1)試劑和裝置·PPO試劑使用一種溶液，該溶液是通過把得自家蠶血液的可商購PPO試劑(SLPTM試劑，購自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.；3ml)溶於6ml裝於SLPTM試劑盒(購自Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)中的溶劑中而製備的。
·濾膜使用Multiscreen GV濾板(購自Japan Millipore Ltd.)。
·水和洗液使用Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.生產的注射用水。(2)試樣把各種懸浮液用作試樣，懸浮液的製備是將預定的細菌懸浮於注射用水中，達到預定的各種濃度(細胞/毫升)。(3)檢測方法用0.2ml洗液洗滌過的Multiscreen GV濾板用來過濾0.2ml試樣。過濾0.2ml洗滌水後，一層膜片粘附到濾板的底部。然後，把0.1mlPPO試劑滴於孔中，在30℃下用微量滴定板讀數器(商標為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產)測定650nm處吸光度的變化，得到起始時間(達到650nm處預定OD(光密度)值0.2所需的反應時間)。(4)結果圖4表示含有枯草桿菌的各試樣的結果。圖5表示含有德氏乳桿菌的各試樣的結果。圖6表示含有各種細菌的試樣的結果。
圖6中，線條-·-表示含有Streptococcus mutans(屬於革蘭氏陽性細菌)的試樣的結果，線條-▲-表示含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，屬於革蘭氏陽性細菌)的試樣的結果；線條-□-表示含有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，屬於革蘭氏陰性細菌)的試樣的結果，線條-△-表示含有副溶血弧菌(Vibrioparahaemomolyticus，屬於革蘭氏陰性細菌)的試樣的結果。
正如圖4～6結果所清楚表示的那樣，根據本發明可以檢測各種細菌的濃度(細胞/毫升)。
實施例4(1)試劑和儀器·PPO試劑與實施例3中所用的相同。
·濾膜與實施例3中所用的相同。
·水和洗液與實施例3中所用的相同。(2)試樣把預定的細菌懸浮於含有預定NaCl濃度的注射用水中來製備各試樣，得到預定濃度(細胞/毫升)。(3)檢測方法用0.2ml洗液洗滌過的Multiscreen GV濾板用來過濾0.2ml試樣。過濾0.2ml洗滌水後，一層膜片粘附到濾板的底部。然後，把0.1mlPPO試劑滴於孔中，在30℃下用微量滴定板讀數器(商標為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產)測定650nm處吸光度的變化，得到起始時間(達到650nm處預定OD值0.2所需的反應時間)。(4)結果結果示於圖7。圖7中，線條-○-表示採用不含NaCl的試樣所得到的結果，線條-■-表示採用含100mM NaCl的試樣所得到的結果，而線條-△-表示採用含200mM NaCl的試樣所得到的結果。
對比例3用已知方法檢測微生物。(1)試劑和裝置·PPO試劑與實施例4中所用的相同。
·水與實施例4中所用的相同。
·微量滴定板使用帶蓋子的96孔微量滴定板(3860-096)，Iwaki Glass Co.，Ltd.生產。(2)試樣按實施例4中所述相同方式製備試樣，不同的是改變NaCl濃度。(3)檢測方法把0.1ml PPO試劑和0.1ml試樣混合後，在30℃下用微量滴定板讀數器(商標為Spectra Max 250，Molecular Devices Co.生產)測定650nm處吸光度的變化，得到起始時間(達到650nm處預定OD值0.2所需的反應時間)。(4)結果結果示於圖8。圖8中，線條-○-表示採用不含NaCl的試樣所得到的結果，線條-·-表示採用含25mM NaCl的試樣所得到的結果，線條-□-表示採用含50mM NaCl的試樣所得到的結果，線條-■-表示採用含100mM NaCl的試樣所得到的結果。
通過對圖7和圖8所示結果的比較可以清楚地看到，根據本發明可以檢測含高鹽濃度的試樣中的微生物，而用已知方法是不能檢測到的。
如前所述，本發明提供了一種簡便、快速、高精確度地檢測各種試樣中微生物的方法。用本發明檢測方法檢測各種試樣中微生物可以產生下述顯著效果，這種效果是常規方法所不能具有的。所以本發明對本領域作出突出貢獻。
(1)可以快速檢測微生物。
可以在數小時內完成檢測。
(2)檢測不受與微生物一起存在於試樣中的物質的影響。
PPO試劑易受試樣中鹽濃度和游離β-葡聚糖的影響，造成檢測靈敏度的下降。但由於本發明的方法涉及一個洗滌步驟，因而可以消除這種影響。
(3)可以通過過濾作用濃縮試樣中的微生物。
既然試樣濾過一個濾膜，試樣中微生物得到濃縮，所以可提高檢測靈敏度。
(4)適當增加正對照數目，可以進行定量測定和定性試驗(限制試驗)。
(5)既可檢測活細胞，也可檢測死細胞。
(6)也可檢測革蘭氏陽性細菌。
(7)檢測不受製備試樣所用溶劑的影響。
甚至對於只溶於有機溶劑中的樣品，可以進行目的檢測而不受有機溶劑的影響。方法是預先經濾膜過濾，並用洗液洗滌。
(8)改變PPO試劑的種類可以測定細菌或真菌，或者對二者進行測定。例如，使用可以與β-葡聚糖和肽聚糖反應的PPO試劑，可以測定細菌和真菌。
使用可與β-葡聚糖反應但不與肽聚糖反應的PPO試劑，可以測定真菌。
使用可與肽聚糖反應但不與β-葡聚糖反應的PPO試劑，可以測定細菌。
(9)改變濾膜孔徑大小可以選擇待檢測的微生物。
例如，要檢測細菌和真菌時，孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜是優選的。要檢測象酵母和黴菌這樣的真菌時，孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜是優選的。要檢測黴菌時，孔徑大小為5μm或更大的濾膜是優選的。對含有包括細菌在內的多種微生物的試樣，僅能檢測出細菌，例如，方法是把試樣濾過一個孔徑大小為1.2μm～3μm的濾膜，把濾液濾過一個孔徑大小為0.2μm或0.45μm的濾膜，然後再用後一濾膜檢測微生物。
權利要求
1.一種檢測微生物的方法，它包括把含有微生物的試樣濾過一個濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統非活性型因子的昆蟲血液反應，以及根據由此引起的顏色變化檢測試樣中的微生物。
2.根據權利要求1的方法，其中的昆蟲血液是一種與β-葡聚糖反應但不與肽聚糖反應的昆蟲血液。
3.根據權利要求1的方法，其中的昆蟲血液是一種與肽聚糖反應但不與β-葡聚糖反應的昆蟲血液。
4.根據權利要求1的方法，其中的顏色變化是用目測觀察的。
全文摘要
一種簡便、快速、高精度地檢測微生物的方法，它包括把試樣濾過一個濾膜，洗滌濾膜，把濾膜上的殘留物與含有前酚氧化酶系統非活性型因子的昆蟲血液反應，以及根據由此引起的顏色變化檢測試樣中的微生物。
文檔編號C12Q1/26GK1149628SQ96109370
公開日1997年5月14日 申請日期1996年7月30日 優先權日1995年7月31日
發明者土谷正和 申請人:和光純藥工業株式會社