人源抗sars冠狀病毒基因工程抗體的製作方法

2023-04-29 02:20:41

專利名稱：人源抗sars冠狀病毒基因工程抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防和治療用人源基因工程抗體的製備及應用，尤其是特異性針對SARS冠狀病毒的具有中和SARS病毒感染功能我國SARS恢復期病人來源的中和性抗SARS病毒基因工程抗體。
嚴重急性呼吸道症候群(Severe acute respiratory syndrome，SARS)或稱非典型肺炎已嚴重威脅人民健康和生命安全。從2002年11月起在我國廣東省流行一種「非典型性肺炎」.在2003年2月底，在香港發生肺炎流行，多數是與病人密切接觸者和醫務工作者，對抗菌治療無效.未鑑定出已知的細菌和病毒病原.因而，此病暫稱為嚴重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome，SARS).隨後本病很快就傳播全國許多城市，並擴散到北美，歐洲，和其它亞洲國家。目前首都北京已受到嚴重影響。經過中國、美國、加那大、德國等13個國家科學家的共同努力，WHO於4月16號宣布SRAS主要由變異的冠狀病毒引起，並命名為「SARS冠狀病毒」(SARS-CoV)，是全球SARS流行的主要病原。SARS病毒基因組為無節段的單鏈(+)鏈RNA，30Kb，是最長的RNA病毒.5』端有甲基化的帽子結構，3』端有聚(A)尾，直接有mRNA的功能，具有感染性。基因組主要編碼病毒多聚酶，糖蛋白M和S蛋白，核蛋白N蛋白以及一些非結構蛋白(6.7)。目前對SARS病毒感染尚無特異性預防治療藥物或疫苗，快速研製一種可用於緊急預防SARS病毒感染的工程抗體預防製劑迫在眉睫，極為重要。
通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進展並越來越顯示出其重要意義及實際運用前景80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術興起和整個基因工程抗體技術研究領域的發展，使當今世界人源或基因工程抗體的開發研究取得很大進展並已由基礎研究階段步入實質性應用研究和開發階段。含有特異性抗體的人源或動物血清免疫球蛋白用以預防和治療傳染病已歷史悠久。而人源基因工程抗體的發展，給這一領域的生物製品發展帶來了新的希望和遠大前景。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內保護肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實驗證明，如鼠抗 A肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內100％保護動物免受病毒攻擊.在SARS治療中，已有用病人恢復期血清治療獲得良好效果的報導，我們相信特異性中和抗體對SARS病毒應當具有良好的預防和治療效應。
人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預防和治療帶來了新的希望，在抗病毒感染生物藥領域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(Antibody Drug)。
本發明的目的是通過基因工程手段和噬菌體表面表達技術結合運用，直接從人抗體基因庫中篩選出抗SARS病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來可能的臨床抗病毒預防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發明陳述的人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體包括1、人源抗SARS病毒基因工程抗體包括26株Fab抗體基因、基因產物及其應用，分別命名為SARSFab1，SARSFab61，SARSFab44，SARSFab59，SARSFab32，SARSFab42，SARSFab35，SARSFab6，SARSFab7，SARSFab51，SARSFab54，SARSFab14，SARSFab52，SARSFab15，SARSFab33，SARSFab58，SARSFab5，SARSFab46，SARSFab62，SARSFab63，SARSFab64，SARSFab53，SARSFab13，SARSFab37，SARSFab50，SARSFab20。其主要特徵在於這些重組抗體是由存在於抗體輕鏈和重鏈基因可變區中的高變區(CDRs)特異性基因序列決定的並在原核細胞中獲得有效表達的特異性結合SARS病毒的功能性抗體。
2、人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特徵在於特異性的輕鏈和重鏈可變區基因來源於對人源抗SARS病毒抗體基因庫的特異性富積篩選，該抗體庫的建立來源我國多個SARS恢復期病人血淋巴細胞基因。其輕鏈和重鏈可變區相應的三個CDR區序列組合極其CDR區之間框架區序列組成了每個抗體可變區序列特徵，分別隸屬於抗體重鏈家族VH1，VH3和VH6，抗體輕鏈家族VK1，VK2和VK3。抗體蛋白功能由存在於抗體基因輕鏈和重鏈可變區的決定族互補區域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列極其互補所決定，6個相應的CDR區胺基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區域，決定本專利申請中每個抗體的抗原結合特徵和抗SARS病毒功能特徵。決定每株抗體特異性和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區胺基酸詳細序列如實例9中圖4所示。
3、人源抗SARS病毒基因工程抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58和SARSFab59，其主要功能特徵在於特異性識別SARS病毒顆粒抗原，與SARS病毒具有明顯的免疫螢光反應(IFA)和酶聯免疫(ELISA)反應，具有抗SARS病毒感染的中和活性功能。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區胺基酸詳細序列如摘要附圖所示。
4、根據上述權利要求2，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於權利要求2中所述的每個抗體可變區輕重鏈6個CDR區胺基酸序列的組合為本抗體專有的抗體序列特徵，任何新的工程抗體可變區基因或相關產物基因不應含有與上述任何一種抗體完全相同的序列特徵。
5、根據上述權利要求2或權利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於根據抗SARS病毒中和抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，和SARSFab59可變區中特異性核苷酸或胺基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同胺基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用於相關基因的改造，而獲得抗SARS病毒中和抗體或相關蛋白或多肽產物。
6、根據上述權利要求和權利要求5，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於基於上述工程抗體基因及其直接或間接的基因產物，可製成噴霧型抗體製劑和注射型抗體製劑用於SARS的預防和治療。
7、根據上述權利要求2或權利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體的用途，其特徵在於利用上述獲得的人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體可變區基因，Fab抗體基因以及上述每個抗體基因特徵下的全抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組系統中表達和生產此抗體或以此為基礎的改建後的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和SARS病毒感染的抗體產物，可在臨床上用於預防和治療由SARS病毒引起的非典型性肺炎。
以下的優先實施例對本發明作詳細說明，但不意味著限制本發明的內容在這些實施例中，為說明本發明，採用噬菌體表達載體為pComb3(Barbas C.III etal，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株為商品化產品XLI-Blu(美國Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13(美國Invitrogene公司)。
實施例1-5為人源抗戊肝病毒基因工程抗體的篩選製備方法；實施例6和7為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體特異性蛋白結合特徵。實例8和9為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的基因特徵；實例10為人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的中和功能特徵。
實例1，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體Fab段基因的PCR擴增用淋巴細胞分離液從6個SARS恢復病人外周抗凝血中分離淋巴細胞，用Tril-Zon(美國Gibco，BRL)提取總細胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過逆轉錄酶(美國Gibco，BRL)逆轉錄成eDNA，用一組IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物，對人源輕鏈和重鏈Fab基因進行PCR擴增。PCR條件為94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘、72℃ 2分鐘，35個循環，上述PCR產物分別經瓊脂糖凝膠回收，經過DNA純化試劑盒QIAquickTMkit(德國QIAGEN公司)純化後，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產物。
實例2，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體噬菌體抗體基因庫的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產物經乙醇沉澱後，用10ul蒸溜水懸起，電轉導入事先製備好的200ul電轉菌XLI-Blu，(電轉條件為Bio-Red電轉儀，0.2cm電轉杯，2.5K伏)，電轉後加10mlSOC培養液，37℃1小時，加入10ml帶有氨苄青黴素和四環素的SB培養液(3)，37℃1小時，加入80-100ml前述SB，37℃2小時後加入輔助噬菌體M13GCM 1 X10 12，1小時後加入卡那黴素(70ug/ml)，37℃搖床培養過夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉澱噬菌體上清，經9000rpm，20分鐘，4℃離心後，用2ml 0.02M PBS PH 7.4重懸沉澱，建立噬菌體抗體庫，分裝保存於-20℃冰櫃中。
實例3，用於抗體庫富集篩選的SARS冠狀病毒抗原的製備篩選抗原為超速離心純化的天然SARS病毒純化顆粒，為SARS病毒感染Vero細胞後收穫的上清，經β-丙內脂滅活後，PEG沉澱，蔗糖墊層超速離心純化而成。使用時用pH 8.6碳酸鹽緩衝液稀釋包被96孔酶標扳。
實例4，噬菌體抗體庫的特異性富集篩選用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的SARS冠狀病毒抗原(1∶10稀釋)，每孔80μl，4℃過夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脫脂奶37℃封閉1小時，棄封閉液；每孔加入80μl噬菌體抗體庫，37℃孵育2小時，棄去孔中未結合的噬菌體，用1×TBST(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液衝洗各孔，衝洗時，用帶有吸頭的移液器反覆吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最後用ddH20洗兩遍，吸淨孔中的液體；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘。加入適量的2M Tris，以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮製備的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室溫孵育15-20分鐘；然後轉入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨苄青黴素20μg/ml，四環素10μg/ml)，立即取10μl塗氨苄青黴素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37℃振蕩培養1小時，加入100mlSB(氨苄青黴素100μg/ml)，37℃1小時後，加入輔助噬菌體VCSM13 1ml，37℃振蕩培養2小時，加入卡那黴素(終濃度70μg/ml)，37℃培養過夜。如此反覆篩選4次。
實例5，人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體可溶性表達產物的製備將帶有陽性抗體輕重鏈基因插入的陽性克隆擴增後按常規方法提取質粒DNA，用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨立表達的蛋白，連接後轉化XL1-Blu菌，從過夜生長的氨苄碟子中挑取單個菌落，接種SB或TB細菌培養液，當細菌長至OD600＝0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃誘導表達10-12小時。收穫細菌，離心後加入原培養液1/10體積的PBS(0.02M pH7.4)重懸，反覆凍融三次，4℃12,000rpm離心30分鐘，上清即為表達的Fab抗體。備用於進一步的檢測和鑑定。陰性對照為載體pComb3轉化菌按同樣方法製備的細菌裂解液。
實例6.人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體的檢測隨機挑選192個經3次富集篩選後滴定的單菌落，在96孔培養板中培養過夜，次日以1∶50的比例轉接另一96孔培養板，37℃培養至OD600＝0.2～0.3時，加入IPTG(終濃度為1mM)，30℃誘導表達12-16h。4℃4000r/min離心菌體15min，上清用於Fab表達和抗原結合的檢測。用超速離心純化的天然SARS病毒純化抗原和抗人Fab抗體(美國sigma公司，1∶1000稀釋使用)包被96孔板，加入待測樣品上清，用酶標抗人Fab二抗(sigma公司，1∶1000稀釋使用)檢測。結果顯示共獲得139株人源Fab表達陽性克隆。如

圖1所示，是用抗人Fab抗體包被對經3輪(圖1A)和4輪(圖1B)收穫的共192個克隆表達上清中人源Fab抗體的ELISA檢測。139株人源Fab表達陽性克隆中，有55個克隆對SARS病毒特異性結合，如圖2所示，是用天然SARS病毒純化抗原包被(圖2A)和重組SARS核蛋白抗原包被(圖2B)對收穫的55個Fab抗體陽性克隆表達上清中抗SARS病毒特異性抗體的ELISA檢測，其中9株Fab克隆被確定為抗SARS病毒核蛋白抗體。
實例7.間接免疫螢光(IFA)試驗檢測用SARS冠狀病毒感染Vero細胞，37℃培養3天後，滴加至玻璃底片上，丙酮固定15min，加入Fab表達上清，37℃溫育30min，Tween/PBS衝洗，晾乾，加入FITC標記的抗人Fab抗體，37℃溫育30min，衝洗，晾乾，伊文氏藍染色後螢光顯微鏡觀察結果(陰性對照為陰性血清對照)。結果與上述ELISA結果完全相符，55個克隆均為免疫螢光反應陽性。如圖3所示，是為選用的2株單抗(SFab20和SFab 15)與SARS病毒結合後在共聚焦顯微鏡不同倍數(20倍和100倍)下顯示的免疫螢光反應。說明獲得的人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體對SAR冠狀病毒結合具有很高的特異性。
實例8.人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區基因的核苷酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit(美國Qiagen)製備質粒DNA進行核酸序列分析。測序為自動測序。至少3個克隆被用於確定同一相同的序列。用DNASTAR序列分析軟體進行分析處理，比較Internet V-Base基因庫中的IgG序列，上述55株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體中，有些抗體具有相同的重鏈基因和不同的輕鏈基因，有些抗體則具有相同的輕鏈基因和不同的重鏈基因，共發現26株帶有不同的抗體輕重鏈可變區序列極其組合的抗體，其輕重鏈可變區核苷酸序列整理如下1.輕鏈可變區核苷酸序列SARSFab1GAGCTCACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAAACGTTCGGCCAAGGGSARSFab14GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAATCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGGSARSFab7GAGCTCACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCAGACGTTCGGCCAAGGG
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SARSFab59CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab32CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab42CTCGAGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab35CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCACTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACATCCCGGGTATAGTAGTGGCTGGCCCCCGGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab6CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCGGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab7CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCAGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab51CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGGAGCAATAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCCGCGGTATAGCAGTGGCTGGCCTCCCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
SARSFab54CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab14CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab52CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTCATATGATGGAAGTAATGAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGGCCCACAAGAGTATAGCAGTGGCTGGCCCCCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab15CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab33CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGTTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab58CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTACTAAATTCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCGGGGTATAGCAGCAGCTGGTGGGTATACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab5CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGAAGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTTATCCCTTGGAGGGATAGTACCAGGGGTCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC
SARSFab46CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGAAGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTTATCCCTTGGAGGGATAGTACCAGGGGTCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCSARSFab62CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAATAATAGATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGATCTATACGGGTATTGTAGTAGTACCAGCTGCCGGG GGAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCSARSFab63CTCGAGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCATCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGACGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCCACTTCATGGACGTCTGGAGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab64CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTATTACCATCTGCCACTTCATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab53CTCGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTCATAAATACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATAGACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACACCCTAGGATATTGTAGTAGTACCAGCTGCCACTTCATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab13CTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGGCTGGGAGGTCCCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGAAGGAAGCATTAAATATTATGCAGACTTCCTGCAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGGAAATGAACAGCCTGAGATCTGACGACACGGCTATATATTACTGTGCGAGACCAAACGTATTATTCTGGCTCGGGGAGGGCAAGGGGGTGATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCSARSFab37CTCGAGTCGGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGGAGGTAAAACGTATTACGATTTTTGGAGTGGTTATTGATGGACCTAGATACCACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACC
SARSFab50CTCGAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAATCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGGAGGTAAAACGTATTACGATTTTTGGAGTGGCTATTGATGGACCTAGATACCACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCSARSFab20CTCGAGCAGTCTGGGGCTGGGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGTTGGAGCAGCTCGGCCGGGGGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC實例9，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區基因的胺基酸序列分析將所獲的25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體核苷酸序列用DNASTAR序列分析軟體進行分析處理，獲得由此推導的胺基酸序列分析。比較Internet V-Base基因庫中的IgG家族序列，其重鏈可變區主要分類在IgG VH3，VH6和VH1家族。其輕便鏈可變區主要分類在IgG VH3，VH6和VH1家族。其基因特徵由VH和VL結構域中的6個CDR區的特異性胺基酸構成。圖4為25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區基因的胺基酸序列極其相互比較。圖中以所列抗體所屬的每個抗體家族中第一行抗體序列為比較的標準序列，「-」符號表示與第一行抗體序列相同的胺基酸。陰影部分為抗體輕重鏈可變區CDR1，CDR2和CDR3區。
實例10，人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的中和功能測定將實例9中所述與SARS病毒結合的25株人源抗SARS冠狀病毒基因工程Fab抗體細菌裂解上清過濾除菌後，與100TCID50的SARS冠狀病毒100ul以1∶1混合，4℃反應過夜，以200ul感染24孔板內單層Vero細胞，陽性對照為SARS病人恢復期血清，陰性對照為無關的人源Fab抗體細菌裂解上清。在37℃培養4天後，觀察細胞病變情況。結果顯示加入Fab抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，SARSFab59和SARS病人恢復期血清的細胞孔未出現在細胞病變人源Fab抗體細胞孔中，可見細胞出現不同程度的病變，在此稀釋度後有病變出現，說明這Fab抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，SARSFab59和SARS病人恢復期血清具有明顯的中和活性，可完全中和含100TCID50的病毒。如說明書附圖5所示，為6株中和性人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體的可變區基因的胺基酸序列極其相互比較。說明書附圖6是抗SARS冠狀病毒的中和試驗結果。圖6左上為加入非中和抗體SARSFab20的結果，細胞出現明顯病變。圖6右上為加入非中和抗體SARSFab64的結果，細胞出現明顯病變。圖6左下和圖6右下為加入中和抗體SARSFab15和SARSFab58的結果，細胞為正常狀態，未出現病變。
權利要求
1.人源抗SARS病毒基因工程抗體包括26株Fab抗體基因、基因產物及其應用，分別命名為SARSFab1，SARSFab61，SARSFab44，SARSFab59，SARSFab32，SARSFab42，SARSFab35，SARSFab6，SARSFab7，SARSFab51，SARSFab54，SARSFab14，SARSFab52，SARSFab15，SARSFab33，SARSFab58，SARSFab5，SARSFab46，SARSFab62，SARSFab63，SARSFab64，SARSFab53，SARSFab13，SARSFab37，SARSFab50，SARSFab20。其主要特徵在於這些重組抗體是由存在於抗體輕鏈和重鏈基因可變區中的高變區(CDRs)特異性基因序列決定的並在原核細胞中獲得有效表達的特異性結合SARS病毒的功能性抗體。
2.人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體，其主要基因特徵在於特異性的輕鏈和重鏈可變區基因來源於對人源抗SARS病毒抗體基因庫的特異性富積篩選，該抗體庫的建立來源我國多個SARS恢復期病人血淋巴細胞基因。其輕鏈和重鏈可變區相應的三個CDR區序列組合極其CDR區之間框架區序列組成了每個抗體可變區序列特徵，分別隸屬於抗體重鏈家族VH1，VH3和VH6，抗體輕鏈家族VK1，VK2和VK3。抗體蛋白功能由存在於抗體基因輕鏈和重鏈可變區的決定族互補區域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列極其互補所決定，6個相應的CDR區胺基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區域，決定本專利申請中每個抗體的抗原結合特徵和抗SARS病毒功能特徵。決定每株抗體特異性和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區胺基酸詳細序列如實例9中圖4所示。
3.人源抗SARS病毒基因工程抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58和SARSFab59，其主要功能特徵在於特異性識別SARS病毒顆粒抗原，與SARS病毒具有明顯的免疫螢光反應(IFA)和酶聯免疫(ELISA)反應，具有抗SARS病毒感染的中和活性功能。決定每株中和抗體功能的抗體輕鏈和重鏈可變區胺基酸詳細序列如摘要附圖所示。
4.根據上述權利要求2，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於權利要求2中所述的每個抗體可變區輕重鏈6個CDR區胺基酸序列的組合為本抗體專有的抗體序列特徵，任何新的工程抗體可變區基因或相關產物基因不應含有與上述任何一種抗體完全相同的序列特徵。
5.根據上述權利要求2或權利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於抗SARS病毒中和抗體SARSFab1，SARSFab6，SARSFab15，SARSFab32，SARSFab58，和SARSFab59可變區中特異性核苷酸或胺基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同胺基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用於相關基因的改造，而獲得抗SARS病毒中和抗體或相關蛋白或多肽產物。
6.根據上述權利要求和權利要求5，人源抗SARS病毒基因工程抗體基因的用途，其特徵在於基於上述工程抗體基因及其直接或間接的基因產物，可製成噴霧型抗體製劑和注射型抗體製劑用於SARS的預防和治療。
7.根據上述權利要求2或權利要求3，人源抗SARS病毒基因工程抗體的用途，其特徵在於利用上述獲得的人源抗SARS病毒中和性基因工程抗體可變區基因，Fab抗體基因以及上述每個抗體基因特徵下的全抗體基因，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞及任何重組系統中表達和生產此抗體或以此為基礎的改建後的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和SARS病毒感染的抗體產物，可在臨床上用於預防和治療由SARS病毒引起的非典型性肺炎。
全文摘要
人源抗SARS冠狀病毒基因工程抗體，是指來源於中國SARS恢復期病人抗體基因文庫的特異性結合SARS冠狀病毒的人源基因工程抗體，包括抗體基因、基因產物及其應用。其主要特徵在於此重組抗體是由存在於抗體輕鏈和重鏈基因可變區中的高變區(CDRs)特異性基因序列決定的並在原核和真核細胞中獲得有效表達的特異性結合SARS病毒結構蛋白的中和性和非中和性的各種功能抗體。其今後的可能用途在於利用此抗體CDR區或部分或全基因，可在原核、酵母、昆蟲和真核細胞及任何表達系統中改造和生產不同形式的基因工程抗體，可在臨床上以噴霧，注射等預防或治療SARS冠狀病毒相關疾病。
文檔編號C12N15/52GK1513874SQ0314999
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月4日 優先權日2003年8月4日
發明者梁米芳, 李德新, 杜潤蕾, 李川, 劉琴芝, 張全福 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制