一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片、製備方法、試劑盒及檢測方法與流程

2023-04-29 17:00:16 7

本發明涉及晶片檢測領域，更具體地，涉及一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片、製備方法、試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：細胞應激是原核或真核細胞遭受各種明顯的環境變化或遭遇射線，活性氧等導致大分子損傷時，產生的一系列適應性變化，最終導致基因表達的改變，增強細胞抗損傷能力和在不利條件下的生存能力。目前，常見的細胞應激過程主要有細胞凋亡、細胞自噬、細胞增殖、細胞遷移、細胞乾性、蛋白翻譯等。針對不同的外界刺激會產生不同的細胞應激反應，主要體現在細胞內蛋白表達差異上。例如對細胞進行飢餓處理，細胞為了應對無營養攝入情況，內底物蛋白會被核糖體雙層膜包裹，接著自噬小泡的外膜與溶酶體膜或者液泡膜融合，釋放出包裹底物蛋白的泡狀結構到溶酶體或者液泡中，最終將其降解。在這一過程中，lc3和p62等蛋白會發生明顯的降解，這也成為細胞自噬發生的標誌性蛋白。當前科研研究中，針對不同研究方向大家一般只關注對應的一到兩個細胞應激過程，缺少對外界刺激細胞應激全面、準確、快速的檢測手段。一般情況下，開展分子機制及細胞分子生物學仍然普遍採用wb、elisa、免疫組化等常規蛋白表達測試手段，但是這些手段測試過程繁瑣、技術複雜、試劑昂貴。為了高通量地針對細胞應激條件下蛋白進行定性或定量的分析的問題，蛋白晶片的開發非常必要。然而蛋白晶片的開發存在不少需要克服的難點：1、蛋白晶片的基礎是抗原抗體親和反應，在抗體固定於載體表面時，其特異性和親和力受到限制，往往出現特異性低，結合不穩定的情況；2、不同的蛋白質在臨床樣品中的豐度不同，抗體抗原反應的親和力不同，樣品稀釋不當，很容易出現假陰性的情況；3、蛋白質之間存在著交叉反應，嚴重影響檢測結果的準確度，隨著檢測抗體數量的增加，需要克服交叉反應的難度越大。只有克服以上難點，才能製備出特異性好，交叉反應小，準確率高的蛋白晶片，從而避免假陽性和假陰性的出現。技術實現要素：本發明的一個目的在於提供一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片；本發明的另一目的在於提供一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片的製備方法；本發明的另一目的在於提供一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的試劑盒；本發明的另一目的在於提供一種細胞應激反應中蛋白表達的檢測方法；本發明所採取的技術方案是：一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片，其包括固體載體及列陣式固定在固體載體上的應激反應標誌物的獨立地特異性抗體；所述的應激反應標誌物為下述各類標誌蛋白的一類或多類：細胞增殖標誌蛋白、細胞凋亡標誌蛋白、細胞自噬標誌蛋白、細胞遷移標誌蛋白、蛋白質翻譯標誌蛋白、細胞乾性標誌蛋白、細胞應激標誌蛋白。作為上述微陣列晶片的優選，應激反應標誌物為下述各類標誌蛋白的一類或多類，各類標誌蛋白含有多個獨立地標誌蛋白，其中：細胞增殖標誌蛋白為pcna、ki67、cyclind1；細胞凋亡標誌蛋白為prap、caspase3、caspase9、caspase8、caspase12、bcl-2、bad；細胞自噬標誌蛋白為lc3-ⅰ、lc3-ⅱ、p62、atg3、atg5、atg7、atg12；細胞遷移標誌蛋白為fak、cofilin、profilin、cdc42、α-tubulin；蛋白質翻譯標誌蛋白為eif2b、eif4ebp1、p70s6k、mtor、eif4e、s6rp；細胞乾性標誌蛋白為oct3/4、ssea-3/4/1、sox2、nanog、cd34、abcg2、stro-1、nestin、psa-ncam、sca-1、cd44、cd166、cd133；細胞應激標誌蛋白為hif1、hif2、p53、atf4、hsp70、hsp90、ros、nrf2、atf6。作為上述微陣列晶片的優選，固體載體為醛基化修飾的玻片。作為上述微陣列晶片的優選，微陣列晶片的固體載體上還列陣式固定有陽性對照蛋白的特異性抗體和/或陰性對照蛋白的特異性抗體。一種製備檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片的方法，包括如下步驟：按點間距離為300～400μm，點樣量為350～450pl，將濃度為300～500μg/ml的特異性抗體溶液以列陣式點樣於醛基化修飾的玻片上，室溫乾燥後，固定，封閉，孵育後，獲得微陣列晶片。作為上述方法的優選，醛基化修飾的方法是：將清洗乾淨的玻片用含4.0～6.0％(v/v)氨基甲氧基矽烷的乙醇溶液處理20～40min，乾燥，再用含1.5～3.5％(v/v)戊二醛的pbs溶液處理50～70min，乾燥，獲得醛基化修飾的玻片。一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片的試劑盒，含有上述微陣列晶片。作為上述試劑盒的優選，還含有細胞裂解液、組織裂解液、稀釋液、洗液、酶標二抗、發光底物中的一種或多種。作為上述試劑盒的優選，所述稀釋液為蛋白穩定劑；和/或洗液為中性緩衝液；和/或酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的二抗；和/或發光底物為螢光素555。細胞應激反應中蛋白表達的檢測方法，包括如下步驟：將待檢細胞樣品進行裂解，獲得蛋白裂解液，點樣於權利要求1～4任一項所述的微陣列晶片上，孵育，清洗；再加入酶標二抗，孵育，清洗；再加入發光底物，孵育，清洗；讀取螢光信號，以陽性對照蛋白為內參，以內參為標準進行歸一化處理，獲得半定量檢測結果。本發明的有益效果是：(1)本發明的微陣列晶片的組成上，選用了7類共計50個應激反應標誌物，可同時檢測包括細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、細胞自噬、蛋白質翻譯、細胞乾性、細胞應激這些方面的蛋白表達，可以明確不同刺激條件下細胞應激反應應對的內部細胞蛋白表達的變化，從而實現快速篩選和評價，為廣大科研人員提供更多的方向選擇性；(2)本發明的微陣列晶片選用醛基化修飾的玻片作為固體載體，採用氨基甲氧基矽烷和戊二醛先後進行氨基化和醛基化修飾，在玻片表面形成活化的醛基，與蛋白質的氨基縮合反應，形成共價鍵，使特異性抗體結合更穩定，活性更高。(3)本發明經過微陣列點樣設計，點樣濃度的優選，二抗-發光底物多分子體系的構建等優化，製備成指標多、通量高、速率快的微陣列晶片，一次性能檢測300個樣品，且點樣量低，僅需100μl，並且能夠有效排除光譜晶片測試的假陽性和假陰性，提高檢測的準確度，通過大量樣本分析發現準確率大於82％；克服了westernblot、elisa、免疫組化等檢測指標單一的弊端，此外交叉反應測試顯示晶片的指標測試靈敏度高、特異性好；(4)本發明的微陣列晶片製備方法簡便，檢測快速，整個流程只需2天完成，並且製作成本較低，有廣闊的產業化前景。(5)本發明通過玻片的表面修飾、改善，製備得到一種新型的晶片，可以大大提高蛋白指標的吸附能力與親和力。附圖說明圖1：肺癌細胞a549對順鉑刺激條件下凋亡標誌蛋白表達量歸一化處理結果，圖中，a：westernblot測試結果；b：本發明微陣列晶片的測試結果；圖2：肝癌細胞hepg2飢餓處理條件下自噬標誌蛋白表達量歸一化處理結果，圖中，a：westernblot測試結果；b：本發明微陣列晶片的測試結果。具體實施方式以下實施例用以說明本發明，但不用來限制本發明範圍。在不背離本發明精神和實質情況下，對本發明的方法、步驟、條件所做的修改或者替換，均屬於本發明的範圍。本發明涉及的試劑的配方如下：pbs溶液：3.58gna2hpo4、0.25gnah2po4、8gnacl、0.2gkcl、1l去離子水；封閉液：0.1gbsa、100mlpbs；1％pbst溶液：5mltween20、500mlpbs；5％bsa溶液：5gbsa、100mlpbs。螢光素555，購於streptavidin,hilytefluortm555conjugated辣根過氧化物酶標記的羊抗人igg，購於jacksonimmunoresearch實施例1、檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片的製備方法(1)醛基化修飾的玻片的製備用去離子水800ml加熱到95℃，加入約洗衣粉5g，將新玻片浸泡在洗衣粉水中3h；取出玻片，用1mm的koh去離子水溶液中浸泡1h；取出玻片，用去離子水清洗3次，每次5min，晾乾，得到清洗乾淨的玻片；將清洗乾淨的玻片用含5％氨基甲氧基矽烷(v/v)的乙醇溶液浸泡30min；取出玻片，用丙酮洗3次，每次5min；再用去離子水清洗3次，每次5min，氮氣吹乾，獲得氨基化修飾的玻片；將氨基化修飾的玻片用含2.5％戊二醛(v/v)的pbs溶液浸泡1h；取出玻片，用pbs洗3次，每次5min；再用去離子水清洗3次，每次5min，氮氣吹乾，獲得醛基化修飾的玻片。(2)晶片的點印將應激反應標誌物獨立地特異性抗體(sigma-aldrich,usa)及陽性對照蛋白的特異性抗體及陰性對照蛋白的特異性抗體分別用pbs稀釋至400μg/ml，吸取每個蛋白樣品30μl加入到384孔板中，其中，三個正極分別是：200倍稀釋的螢光素555、400倍稀釋的螢光素555、800倍稀釋的螢光素555，負極為pbs。用用點樣儀(nano-plottertmnp2.1)將獨立地特異性抗體點樣至準備好的醛基化修飾的玻片上，點樣量為400pl，點間距離為400μm，矩陣情況如表1所示，點樣操作完成後，將玻片置於室溫乾燥。上述應激反應標誌物為下述7類標誌蛋白，其中：細胞增殖標誌蛋白為pcna、ki67、cyclind1；細胞凋亡標誌蛋白為prap、caspase3、caspase9、caspase8、caspase12、bcl-2、bad；細胞自噬標誌蛋白為lc3-ⅰ、lc3-ⅱ、p62、atg3、atg5、atg7、atg12；細胞遷移標誌蛋白為fak、cofilin、profilin、cdc42、α-tubulin；蛋白質翻譯標誌蛋白為eif2b、eif4ebp1、p70s6k、mtor、eif4e、s6rp；細胞乾性標誌蛋白為oct3/4、ssea-3/4/1、sox2、nanog、cd34、abcg2、stro-1、nestin、psa-ncam、sca-1、cd44、cd166、cd133；細胞應激標誌蛋白為hif1、hif2、p53、atf4、hsp70、hsp90、ros、nrf2、atf6。陽性對照蛋白為gadph、beta-actin；陰性對照蛋白為bsa，blue，biotin-protein；每張晶片都有陰陽極作對照。表1、微列陣晶片點樣列陣分布示意表positive1casp3p62cdc42positive8stro-1cd133nrf2positive2caps9atg3α-tubulinoct3/4positive11positive14atf6positive3caps8atg5positive7ssea-3/4/1nestinhif1positive15negativecasp12atg7eif2bsox2positive12hif2pcnabcl-2atg12eif4ebp1nanogpsa-ncamp53ki67badpositive6p70s6kpositive9sca-1atf4cyclind1positive5fakmtorcd34positive13hsp70positive4lc3-1cofilineif4epositive10cd44hsp90parplc3-2profilins6rpabcg2cd166ros(3)微陣列晶片的後處理將乾燥好的玻片用16孔玻片孵化器固定，每孔加入100μl封閉液，孵育封閉30min；封閉完成後，除掉封閉液，甩幹，即完成微陣列晶片的製備。實施例2、檢測細胞應激反應中蛋白表達的試劑盒的製備一種檢測細胞應激反應中蛋白表達的試劑盒，包括如下組分：(1)檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片、(2)細胞裂解液、(3)組織裂解液、(4)稀釋液、(5)洗液、(6)酶標二抗、(7)發光底物；各組分的選擇及作用如下：(1)檢測細胞應激反應中蛋白表達的微陣列晶片：優選為實施例1的微陣列晶片；(2)細胞裂解液：含有loadingbuffer，蛋白酶抑制劑，購於北京碧雲天生物技術有限公司；(3)組織裂解液，含有loadingbuffer和pmsf，購於北京碧雲天生物技術有限公司；(4)稀釋液：是蛋白穩定劑，本實施例為5％bsa溶液；作用是稀釋待測蛋白至可檢測濃度範圍；(5)洗液：是中性緩衝液，本實施例為1％pbst溶液，作用是在固體載體表面孵育蛋白樣品及酶標二抗後，需用洗液清洗掉固體載體表面未結合的抗體和酶標二抗；(6)酶標二抗：辣根過氧化物酶標記的二抗，本實施例為辣根過氧化物酶標記的羊抗人igg；作用是細胞蛋白中的應激蛋白可與固體載體上的一抗結合，二抗可與一抗結合；(7)發光底物：本實施例為螢光素555，其作用是二抗上的標記物可與發光底物反應，從而發出可檢測的光；上述試劑盒能夠快速、方便地檢測細胞增殖、凋亡、自噬、增殖、遷移、蛋白質翻譯、乾性、應激相關標誌蛋白表達的情況，通過大量樣本分析發現準確率大於82％。實施例3、細胞應激反應中蛋白表達的檢測方法細胞應激反應中蛋白表達的檢測方法，包括如下步驟：(1)利用組織裂解液和/或細胞裂解液，將待樣品進行裂解，獲得蛋白裂解液，用稀釋液稀釋至合適的檢測濃度；(2)在微陣列晶片上每孔加入100μl稀釋的蛋白裂解液，常溫孵育4h，去掉未反應蛋白裂解液樣品，用洗液和pbs溶液分別清洗5次，甩幹；(3)在微陣列晶片上每孔加入100μl，1000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人igg，常溫孵育4h，去掉未反應的酶標二抗溶液，用洗液、pbs分別清洗5次，甩幹；(4)在微陣列晶片上每孔加入100μl的1000倍稀釋的螢光素555，避光孵育1h。去掉多餘螢光素555，用洗液、pbs分別清洗5次，甩幹；(5)將玻片加載到掃描儀(luxscantm10k-b)內，設置掃描參數：power＝100％、pmt＝550，讀取螢光信號。(6)以陽性對照蛋白為內參，以內參為單位進行歸一化處理，獲得半定量檢測結果。實施例4、本發明體系中增殖和凋亡、自噬標誌蛋白指標交叉反應測試由於交叉反應涉及的蛋白比較多，僅展示具有代表性的增殖和凋亡、自噬蛋白抗體的交叉反應測試結果，測試方法如下：抗體對時間的交叉反應的測試。不同抗體晶片首先與單個抗原(濃度150ng/ml)孵育培養，按照實施例3的洗片標準進行洗片。與每種抗原對應的檢測抗體反應，經cy3-鏈黴親和素孵育，晶片掃描後讀數。以每種抗原的捕獲抗體為橫軸，以加入抗原和對應檢測抗體為縱軸繪圖。表2、增殖和凋亡標誌蛋白抗體交叉反應的結果抗體/抗原pcnaki67cyclind1parpcasp3caps9caps8casp12bcl-2badpcna34512123132142999293153241215ki6721428754270345298330321361353321cyclind119220138134230258294201249251301parp18310229423415284222304320341329casp320115327111931289348602503559542caps919818326314013234129421321298342caps828115223113916221941093320184156casp1224118222115616223930229120223234bcl-219915329017213521231031032194169bad21013230113014225122430134130123表3、自噬標誌蛋白抗體交叉反應的結果抗體/抗原lc3-1lc3-2p62cdc42atg3atg5atg7atg7lc3-129021313430394403443242209lc3-243030120351372443393402432p6239239037120352282342309302cdc4232033132132102269376234332atg342434235245234021403441345atg539240236244229329210362346atg734045342345623534540212432atg1232134234246330928534938921統計結果如表2和表3所示，每種抗體對可以特異地識別自己的檢測抗原而與其他的抗原沒有交叉反應。實施例5、順鉑刺激條件下凋亡標誌蛋白的檢測利用實施例3的檢測方法及westernblot檢測方法，將1.5μm順鉑刺激12h後的肺癌a549細胞樣品進行檢測，均以未刺激的肺癌a549細胞樣品為對照。應激蛋白晶片結果數據用分析軟體genepro6.0software進行螢光信號讀取，讀取得到各個指標的處理前後的螢光信號值，以陽性對照蛋白gapdh為內參，以內參為標準進行歸一化處理，用grapa6.0軟體進行結果分析(t檢驗)。結果示意如圖1所示，圖中a為本發明方法檢測結果，圖中b為westernblot檢測結果，由於該細胞樣本中bcl-12指標表達較低，圖中不做展示，與未刺激的對照組相比，兩種檢測方法均顯示凋亡通路標誌蛋白parp下調，而標誌蛋白casp3、casp8、casp9、caspase12、bad則上調，並且本發明方法與westernblot檢測結果差異不大，可以準確的反應應激反應蛋白的變化。實施例6、飢餓處理條件下自噬標誌蛋白的檢測利用實施例3的檢測方法及westernblot檢測方法，將飢餓處理12h後的肝癌hepg2細胞樣品進行檢測，均以未飢餓處理的肝癌hepg2細胞樣品為對照。應激蛋白晶片結果數據用分析軟體genepro6.0software進行螢光信號讀取，讀取得到各個指標的處理前後的螢光信號值，以內參gapdh為標準進行歸一化處理，用grapa6.0軟體進行結果分析(t檢驗)。結果示意如圖2所示，圖中a為本發明方法檢測結果，圖中b為westernblot檢測結果，由於該細胞樣本中其餘4個指標表達較低，圖中不做展示，與未刺激的對照組相比，兩種檢測方法均顯示細胞自噬標誌蛋白lc3-1、p62p下調，而標誌蛋白lc3-ⅱ則上調，並且本發明方法與westernblot檢測結果差異不大，可以準確的反應應激反應蛋白的變化。當前第1頁12