蘭花組織培養快速繁殖方法
2023-04-29 00:57:31
專利名稱：蘭花組織培養快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，具體是蘭花組織培養快速繁殖方法，主要是通 過蘭花幼芽或種子在誘導培養基上誘導出初始(類)原球莖，然後通過液固二相增殖培 養基在溫控搖床內控溫、控速搖動培養達到高效增殖目的。
背景技術：
原球莖或類原球莖，是蘭科植物特有的一種再生方式，誘導和增殖培養原球莖或類 原球莖，是蘭科植物獲得快速繁殖的有效途徑。蘭科植物，其種子、幼芽一般通過組織 培養大都能誘導出原球莖或類原球莖，統稱為(類)原球莖，再通過分化和生根培養就 能形成大量微型植株，因此，(類)原球莖的誘導和快速繁殖是蘭科植物工廠化生產小 苗的關鍵技術。
蘭科植物是繁殖最困難的一類單子葉植物，尤其是中國蘭花， 一般繁殖係數很低， 最多一年2 3倍，而那些名貴品種繁殖係數更低些， 一般在0.5 1之間，如蒔養不當， 可能越養越少。隨著甜幾年掏蘭熱毀滅性破壞，國蘭種質資源已瀕臨滅絕的邊緣。因此， 加快蘭花、特別是中國蘭花繁殖速度，更好地保護中國蘭花品種資源，使頗具天姿國香 的中國蘭花能走進千家萬戶，已成為當前我國蘭花科學研究的重點和熱點。
傳統的蘭花繁殖方法多採用分株繁殖法，繁殖係數小，產業化程度低，遠遠不能滿 足市場消費需求。雖有一些中國蘭花組織培養研究報導，但組織培養成功的限於個別種， 且原球莖生長易於褐化，研究進展緩慢。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種蘭花組織培養快 速繁殖方法，以達到高效誘導和增殖、減輕褐化和有效繼代的目的。
本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為該蘭花組織培養快速繁殖方法，其 特徵在於包括以下步驟
a、誘導培養；將蘭科植物的種子或幼芽接種在誘導培養基上，誘導出芝麻粒大小 的初始(類)原球莖；所述誘導培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的半 固體培養基，具體成分和含量為KN03 1200~1500mg/L、 NH4N03 1000~1350mg/L、
KH2P04 110~140 mg/L、 MgS04 '71120 230 300 mg/L、 CaCl2 200-280 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 '4H20 22.3 mg/L、 ZnS04 '71120 8.6 mg/L、 Na2Mo04 '2H20 0.25 mg/L、 CuS04 5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 6H20 0.025 mg/L、 Na2 . EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 7H20 27.8 mg/L、 C6H1206 2H20 100mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 C12H17C1N40S HCl 0.1 mg/L、 CgHuC^N HCl 0.5 mg/L、 NC5H4COOH 0.5 mg/L、蔗糖 20~30mg/L、 6-BA0.01~0.5mg/L、活性炭0.01 0.1%、瓊脂糖4~5g/L， pH值5.0 5.4;
b、增殖及繼代培養；將初始(類)原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，每 隔四周，將增值後的初始(類)原球莖切割後進行繼代培養，使(類)原球莖快速增殖， 繼代培養所用培養基與所述增值培養基相同；所述增殖培養基是以改良MS為基本培養 基並附加其他成分的液固二相培養基，其中上層為液相培養基，下層為固相培養基；所
述液相培養基的具體成分和含量為KN03 600~1200mg/L、 NH4N03 500-1100mg/L、 KH2PO450~120 mg/L、 MgS04 '7H20 120~250 mg/L、 CaCl2 100 250 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 '4H20 22.3 mg/L、 ZnS04 '71120 8.6 mg/L、 Na2Mo04 '2H20 0.25 mg/L、 CuS04 5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 . 6H20 0.025 mg/L、 Na2 EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 7H20 27.8 mg/L、 C6H1206 2H20 100mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 Ci2H17ClN4OS HCl 0.1 mg/L、 QHuCbN HCl 0.5 mg/L、 NC5H4COOH 0.5 mg/L、蔗糖 30mg/L、 6-BA0.1 lmg/L、 NAA0.01 0,5 mg/L、活性炭0.1~0.5%、香蕉泥0 100g/L， pH值5.2~5.4;所述固相培養基與所述液相培養基相比，僅在於其還添加有瓊脂糖 6~7g/L。
所述誘導培養所採用的培養條件為先於2(TC 25'C條件下暗培15 20天，然後在 20°C~25°C、 1000 1500Lux條件下誘導培養2~3個月。
所述增殖及繼代培養所採用的培養條件相同，培養條件為在溫控搖床內搖動培養，
搖床溫度23。C 25。C，搖床轉速10~150rpm。
本發明的優點通過選擇合適的誘導培養基、增殖培養基及繼代培養基並結合控溫 搖床溫和搖動培養實現高效增殖，兼備了液體培養基和固體培養基的長處， 一方面保持 了原球莖或類原球莖固體培養基生長健壯的優勢，另一方面發揮了液體培養基快速增殖 的長處；而且由於原球莖或類原球莖根植於固體培養基，避免了液體培養搖動乃至滾動 摩擦所帶來的組織褐化現象，使組織生長條件更加優越。再者，誘導培養基其無機鹽含 量較傳統MS培養基相比約減少了 20%~35%;增殖培養基其無機鹽含量較傳統MS培 養基相比約減少了 30% 50%。
具體實施例方式
下面結合蘭科蘭屬植物代表種春蘭的初始原球莖(或類原球莖)高效誘導和增殖培
養來說明蘭花組織培養快速繁殖方法
具體實施例方式
實施例l、春蘭幼芽初始原球莖誘導和增殖培養-原球莖誘導階段
選擇具有健壯、無病幼芽的春蘭植株預先防菌或殺菌處理1 2周，用自來水衝洗幹 淨，用無菌手術刀切下幼芽，用75%的酒精擦淨或置於75%酒精裡浸泡lmin左右，取 出用無菌水衝洗1次，再在0.1%HgCl2中浸泡15min，取出用無菌水衝洗2~3次，用無 菌濾紙吸乾水分，剝離幼芽外葉，取莖尖置於半固體狀的以改良MS基本培養基和附加 成分混配的原球莖誘導培養基，誘導培養基成分及含量為KN03 1200-1500mg/L、 NH4NO3 1000~1350mg/L、 KH2P04 110~140 mg/L、 MgS04 . 7H20 230~300 mg/L、 CaCl2 200~280 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 4H20 22.3 mg/L、 ZnS04 7H20 8.6 mg/L、 Na2Mo04 2H20 0.25 mg/L、 CuS04 5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 6H20 0.025 mg/L、 Na2 EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 7H20 27.8 mg/L、 C6H1206 2H20 100 mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 C12H17C1N40S HCl 0.1 mg/L、 C8Hu03N HCl 0.5 mg/L、 NC5H4COOH0.5mg/L，附加成分為蔗糖(Sugar) 2(K30mg/L、 6-BA0.01 0.5mg/L、活 性炭(AC) 0.01~0.1%、瓊脂糖(Agar) 4 5g/L， pH值5,0~5.4。莖尖朝上。培養條 件置於23。C土rC光照培養箱，先暗培養2 3周，再轉到1500 Lux條件下光照培養， 轉接3 4次，約2 3個月，可見籽麻粒大小初始原球莖(或類原球莖)。
原球莖增殖培養和繼代培養階段
將初始(類)原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，每隔四周，將增值後的初 始(類)原球莖切割後進行繼代培養，使(類)原球莖快速增殖，繼代培養所用培養基 與所述增值培養基相同；所述增殖培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的 液固二相培養基，其中上層為液相培養基，下層為固相培養基；所述液相培養基的具體 成分和含量為KNO3600~1200mg/L、 NH4N03 500-1100mg/L、 KH2P04 50~120 mg/L、 MgS04 7H20 120~250 mg/L、 CaCl2 100~250 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 4H20 22.3 mg/L、 ZnS04 7H20 8.6 mg/L、 Na2Mo04 2H20 0.25 mg/L、 CuS04 '5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 '61120 0.025 mg/L、 Na2 'EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 '7H20 27.8 mg/L、 C6H1206 2H20 100 mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 C12H17C1N40S HCl 0.1 mg/L、 QHnCbN HCl 0.5 mg/L、 NC5H4COOH 0.5 mg/L,其無機鹽含量較傳統MS 培養基相比約減少30%~50%。附加成分為Sugar 30 mg/L、6-BA 0.1~lmg/L、NAA 0.01~0.5 mg/L、 AC0.1~0.5%、香蕉泥0~100g/L，下層固體培養基添加Agar 6~7g/L (上層液體培 養基不添加)，pH值5.0 5.4。培養條件在溫控搖床內搖動培養，搖床溫度24'C士rC， 搖床轉速60rpm。轉接1 2次，可使原球莖或類原球莖快速增殖，增殖速度比單一液體 培養基或固體培養基快3 4倍，且生長健壯。
實施例2、春蘭種子初始原球莖誘導和增殖培養 原球莖誘導階段
選擇發育正常、無病的春蘭種莢8~9成熟時剪下，置於低溫冰箱(4°C) 2~3d,先 用自來水衝洗，再用75%酒精擦洗乾淨，浸泡於0.ie/。HgCl2中20min,取出用無菌水衝 洗2 3次，用無菌濾紙洗幹水分，用無菌手術刀解剖種莢，取少許種子接種於半固體改 良MS基本培養基和附加成分混配的原球莖誘導培養基，誘導培養基的成分和含量為 KN03 1200~1500mg/L、 NH4N03 1000 1350mg/L、 KH2P04 110~140 mg/L、 MgS04 ，7H20 230~300 mg/L、 CaCl2 200~280 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 '41120 22.3 mg/L、 ZnS04 7H20 8.6 mg/L、 Na2Mo04 2H20 0.25 mg/L、 CuS04 5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 '61120 0.025 mg/L、 Na2 'EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 '71120 27.8 mg/L、 C6H1206 '2H20 100 mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 C12H17C1N40S HCl 0.1 mg/L、 C8Hu03N HCl 0.5mg/L、 NC5H4COOH0.5mg/L，附加成分為Sugar 20 30 mg/L、 6-BA0.01 0.5mg/L、 AC 0.01 ~0.1 %、 Agar 4~5g/L， pH值5.0~5.4 。置於光照培養箱暗培2~3周，再置於1 OOOLux 光培養，23°C±TC，短則2 3個月，長則5 6個月，可誘導出初始原球莖或類原球莖。
原球莖增殖培養和繼代培養階段-
將初始(類)原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，每隔四周，將增值後的初 始(類)原球莖切割後進行繼代培養，使(類)原球莖快速增殖，繼代培養所用培養基 與所述增值培養基相同；所述增殖培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的 液固二相培養基，其中上層為液相培養基，下層為固相培養基；所述液相培養基的具體 成分和含量為KNO3600~1200mg/L、 NH4N03 500-1100mg/L、 KH2P04 50~120 mg/L、 MgS04 7H20 120~250 mg/L、 CaCl2 100 250 mg/L、 KI 0.83 mg/L、 H3B03 6.2mg/L、 MnS04 4H20 22.3 mg/L、 ZnS04 7H20 8.6 mg/L、 Na2Mo04 2H20 0.25 mg/L、 CuS04 '5H20 0.025 mg/L、 CoCl2 '6H20 0.025 mg/L、 Na2 'EDTA 37.3 mg/L、 FeS04 *7H20 27.8 mg/L、 C6H1206 2H20 100 mg/L、 NH2 CH2 COOH 2 mg/L、 C12H17C1N40S HCl 0.1 mg/L、 C8Hu03N HCl 0.5 mg/L、 NC5H4COOH 0.5 mg/L，其無機鹽含量較傳統MS 培養基相比約減少30%~50%。附加成分為Sugar 30 mg/L、6-BA 0.1~lmg/L、NAA 0.01 0.5 mg/L、 AC0.1~0.5%、香蕉泥0~100g/L，下層固體培養基添加Agar 6~7g/L (上層液體培 養基不添加)，pH值5.0 5.4。培養條件在溫控搖床內搖動培養，搖床溫度24'C土rC， 搖床轉速60rpm。轉接1 2次，可使原球莖或類原球莖快速增殖，增殖速度比單一液體 培養基或固體培養基快3 4倍，且生長健壯。
本發明蘭花組織培養快速繁殖方法，通過改良MS基本培養基混配適當的其他物質 獲得的誘導培養基誘導蘭科植物幼芽或種子初始原球莖(或類原球莖)，再通過以改良 MS基本培養基混配適當的其他物質獲得的液固二相培養基結合控溫搖床溫和搖動途徑 來獲得原球莖(或類原球莖)高效增殖和繼代，其具通用性，既適用於春蘭、建蘭、墨 蘭、寒蘭、蕙蘭等國蘭用幼芽或種子誘導的原球莖或類原球莖高效增殖和繼代培養，也 適用於卡特蘭、大花蕙蘭、石斛蘭、兜蘭、文心蘭、萬代蘭等洋蘭用幼芽或種子誘導的原球莖(或類原球莖)高效增殖和繼代培養。
本發明也適用於通過原球莖(或類原球莖)途徑的轉基因培養。
權利要求
1、一種蘭花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於包括以下步驟a、誘導培養；將蘭科植物的種子或幼芽接種在誘導培養基上，誘導出芝麻粒大小的初始(類)原球莖；所述誘導培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的半固體培養基，具體成分和含量為KNO31200～1500mg/L、NH4NO31000～350mg/L、KH2PO4110～140mg/L、MgSO4·7H2O230～300mg/L、CaCl2200～280mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O22.3 mg/L、ZnSO4·7H2O8.6 mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、C6H12O6·2H2O100mg/L、NH2·CH2·COOH2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl0.1mg/L、C8H11O3N·HCl0.5mg/L、NC5H4COOH0.5mg/L、蔗糖20～30mg/L、6-BA0.01～0.5mg/L、活性炭0.01～0.1％、瓊脂糖4～5g/L，pH值5.0～5.4；b、增殖及繼代培養；將初始(類)原球莖轉接到增殖培養基上進行增殖培養，每隔四周，將增值後的初始(類)原球莖切割後進行繼代培養，使(類)原球莖快速增殖，繼代培養所用培養基與所述增值培養基相同；所述增殖培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的液固二相培養基，其中上層為液相培養基，下層為固相培養基；所述液相培養基的具體成分和含量為KNO3 600～200mg/L、NH4NO3500～1100mg/L、KH2PO450～120mg/L、MgSO4·7H2O120～250mg/L、CaCl2100～250mg/L、KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、Na2·EDTA37.3mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、C6H12O6·2H2O100mg/L、NH2·CH2·COOH2mg/L、C12H17ClN4OS·HCl0.1mg/L、C8H11O3N·HCl0.5mg/L、NC5H4COOH0.5mg/L、蔗糖30mg/L、6-BA0.1～1mg/L、NAA0.01～0.5 mg/L、活性炭0.1～0.5％、香蕉泥0～100g/L，pH值5.2～5.4；所述固相培養基與所述液相培養基相比，僅在於其還添加有瓊脂糖6～7g/L。
2、 根據權利要求1所述的蘭花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述誘導培養 所採用的培養條件為先於20'C 25'C條件下暗培15~20天，然後在2(TC~25°C、 1000 1500Lux條件下誘導培養2~3個月。
3、 根據權利要求1所述的蘭花組織培養快速繁殖方法，其特徵在於所述增殖及繼 代培養所採用的培養條件相同，培養條件為在溫控搖床內搖動培養，搖床溫度23°C 25 °C，搖床轉速10~150rpm。
全文摘要
本發明公開了一種蘭花組織培養快速繁殖方法，其包括誘導培養、增殖及繼代培養，誘導培養所用誘導培養基是以改良MS為基本培養基並附加其他成分的半固體培養基；而增殖及繼代培養所用培養基則為以改良MS為基本培養基並附加其他成分的液固二相培養基，並結合了控溫搖床溫和搖動培養，從而實現了高效誘導和增殖、減輕褐化和有效繼代的目的，特別適合於蘭花的組織培養。
文檔編號A01H4/00GK101180951SQ20071016453
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月14日 優先權日2007年12月14日
發明者孫志棟, 陳惠雲 申請人:寧波市農業科學研究院