通過mRNA誘導體細胞為多能幹細胞的方法

2023-04-29 13:03:51 3

專利名稱：通過mRNA誘導體細胞為多能幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及再生細胞的方法以及這些被再生細胞的人類臨床和獸醫的應用，更具體地說，涉及通過mRNA誘導體細胞為多潛能(pluripotent)或多能的(multipotent)胚胎幹細胞或幹樣(stem-like)細胞(也稱多能幹細胞(iPS))的方法。所述的再生方法還適用於哺乳動物的器官和身體。
背景技術：
老化是生命不可避免的過程。老化是一種有害的、進行性、普遍性且因而不可逆的變化綜合症。細胞的老化特徵在於減少細胞的功能、降低對應激響應的能力、增加了體內穩態的失衡以及增加了患疾病的風險。因此，老化本身可被視作「疾病過程」，並且是對大分子、細胞、組織和器官損傷的積聚。細胞的老化由運行於個體壽命始終的生物鐘調節，依賴於影響負責維護、修復和防禦響應的系統的基因表達的變化。老化與在DNA複製過程中細胞分裂期間的端粒變短相關。老化是由累積突變和損傷而加速的，從大分子(DNA，RNA，蛋白質，碳水化合物和脂質) 到組織，通過自由基、糖化、輻射、交聯劑等而引起的。目前已確定了在老化過程中的多種基因途徑。這些途徑的其中一種涉及基因 Sir2, 一種NAD+-依賴性組蛋白脫乙醯基酶。額外拷貝的Sir2能夠延長蠕蟲和蠅類的壽命。 人類似物SIRTl蛋白已被證實為脫乙醯p53、Ku70、特異性組蛋白殘基和叉頭家族的轉錄因子。超氧化物歧化酶，一種防止線粒體自由基作用的蛋白質，當它被過量表達時可以延長穩定期酵母的壽命。但是，尚未清楚這些機理是否也存在於人類中，因為在人類和模型有機體之間在生物學和病理生理學方面存在明顯的區別。通常，生命的質量隨老化而下降。因為老化，腱和韌帶中的膠原蛋白和彈性蛋白變得彈性更小和更片斷化，特別是由於糖化(由糖交聯蛋白質)。關節軟骨變得已磨損，而且接頭間關節液變得「更稀薄」。在循化功能方面的衰退有助於這個過程。膠原蛋白和彈性蛋白還在皮膚中交聯，導致彈性的損失。手指甲中角質蛋白還是皮膚外層(表皮)的成分，其提供了 「防水性」。表皮隨年齡而變薄，導致皺褶。汗腺分泌的減少增加了熱休克易發性。 當與毛囊相關的黑色素細胞(產生皮膚和毛髮著色物質黑色素的細胞)失去功能時，毛髮變白。黑色素細胞功能的部分減少導致毛髮變灰。然而，90%白種人表現為黑色素增加，在他們手背上呈現棕色斑點的形式(「肝斑」)。肺部膠原蛋白和彈性蛋白的韌性損失導致彈性反衝更小。排氣變得更加困難，這減少了空氣交換和呼吸，並因此降低了工作能力。動物細胞可分為生殖細胞(精子或卵)、幹細胞以及體細胞(已分化的功能性體細胞)。在組織培養中的胚胎纖維原細胞在他們達到50次分裂的Hayflick限度之前中止分裂 (Hayflick L,Moorhead PS Exp Cell Res 1961,25:585-621)。生殖細胞、幹細胞和「永生化」癌細胞包含一種被稱作端粒酶的酶，其代替了損失的端粒，因此使它們不經歷Hayflick 限度。在人的生殖細胞和大約85%的癌細胞中，這種酶-人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)和RNA 模板足以產生新的端粒。維持端粒功能所需蛋白質中的缺陷還可導致染色體的不穩定性和癌症。端粒酶表達還使細胞對氧化性應激所誘導的凋亡產生更大的抗性。已用端粒酶的逆轉錄酶亞基轉染的人體細胞表達端粒酶。這種細胞顯示超出它們 Hayflick限度的20群體倍增，並且繼續顯示為常規的、健康的和年輕的細胞外觀及活性。 這種結果創造了一個現實的期望，採用一種形式的基因治療，在體細胞中誘導自體端粒酶的表達或者在自然形成之前將遺傳物質添加至工程化端粒酶組成的細胞中，在一些組織中保存青春是可能的。關於通過生活方式改變和預防性疾病的預防(例如，減少熱量的攝入同時維持適當的營養、食用低脂肪/高纖維的飲食、避免菸草和酒精、鍛鍊、以及接受抗氧化劑補充劑) 而減緩老化進程以延長平均壽命，已進行了廣泛的研究。但是，沒有極端的生活方式改變， 難於取得減緩老化的非常直接的益處。根據定義，幹細胞是未分化的細胞，它能夠自我更新並分化為各種功能的成熟細胞，從神經元細胞到肌肉細胞。未分化細胞分裂以便於形成分化為特定體細胞和幹細胞的子細胞。胚胎幹細胞(這裡稱作「ESC」)衍生自胚胎並且本身是多潛能的。多潛能細胞可產生大多數但非全部的、胎兒發育所需的組織。多潛能細胞專門化為通常產生具有特定功能的多能細胞(例如，多能血液幹細胞可產生紅細胞、白細胞和血小板)。ESC能夠分化為特殊的細胞、組織或甚至器官類型，取決於所用的分化條件。人ESC在細胞替代療法和移植術中是非常有用的，用於治療疾病如帕金森症、組織移植以及用於藥物和毒素的篩選。ESC 還可應用於開發用於移植的細胞培養和製造生物製品，諸如，胰島素、抗體以及因子VIII。ESC在治癒許多人類疾病方面保持有發展前景。但是，對ESC存在一些關注。首先，關於從胎兒獲取ESC存在倫理和政治問題。其次，由NIH資助的研究項目受限於有限組的22ESC細胞系，它們可能不足以用於基礎研究試驗。第三，我們身體中的免疫系統保護對抗植入的ESC。結果是，這可能引起排斥植入的ESC或臍帶血幹細胞而且導致移植物抗宿主疾病。除了應用核移植外，已嘗試了用細胞重編程將體細胞轉化為多潛能細胞。Hansis 等(Curr Biol 2004，14 1475-1480)描述了一種用非洲爪蟾卵(Xenopus egg)提取物重編程體細胞(包括人淋巴細胞和人四31腎細胞)的方法。他們發現，BRGl是體外重編程所必需的。但是，還不清楚是否細胞獲得了多潛能性質。Tada等(Curr Biol 2001,11 1553-1558)描述了一種用體外細胞雜交將體細胞轉變為多潛能細胞的方案。他們將胚胎幹細胞(ESC)與分化的胸腺細胞末端融合。這些ESC-胸腺細胞雜交細胞具有原ESC的多潛能性。但是，這些雜交細胞是帶有不穩定基因組的四倍體細胞，而且不能直接地用於臨床治療。Do及同事(Stem Cells 2004,22 =941-949)描述了一種用體外細胞雜交將體細胞轉變成多潛能細胞的類似方案。他們將神經球(neurosphere)細胞(NSC)與ESC融合。已融合的細胞具有活化的0ct4，一種ESC中多潛能性必需的基因。他們進一步證明了，ESC的重編程能力源自ESC核。同樣地，這些雜交細胞是四倍體細胞而且不能用於細胞替代療法。Collas 及其同事(Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003，358 1389-1395)發表了一系列為細胞療法而轉分化細胞的論文。但是由於技術難題，他們尚未報導將體細胞成功地轉分化為多潛能細胞。儘管似乎不能將老化停止於年輕階段，但是替換或修復損傷器官、組織、細胞甚至分子可能是上佳的策略。這些策略可再生細胞而且恢復年老有機體的功能。因此，本發明的目的是克服或者至少緩解現有技術的一些問題，並且提供一種有效地體內和體外再生細胞的更有效且更可行的方法，而且，下面的描述提供了一種滿足上述本領域所需的可行系統並且還提供了額外的優點。

發明內容
本發明的目的是提供一種再生細胞、組織和全身的、技術上領先的方法。本發明中所涉及的胚胎、胚胎幹細胞、胎兒、胎兒組織、胎兒細胞、ESC、胚泡細胞及受精卵均是指非人類的胚胎、胚胎幹細胞、胎兒、胎兒組織、胎兒細胞、ESC、胚泡細胞及受精卵。在一種實施方案中，本發明提供了一種經過如下步驟再生年老細胞的方法，a.提供包括年老體細胞的樣品；b.提供包括再生提取物、白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶(RNase)抑制劑以及核苷酸磷酸鹽的再生溶液；c.將該再生溶液與年老細胞混合併培養足以使再生溶液成分透過細胞的時間；和d.加入適宜的細胞培養基溶液，如具有氯化鈣和任選地抗生素的K0-DMEM。在這種方法中，再生提取物可以從發育早期的細胞提取， 所述細胞選自卵、受精卵、胚泡、胚胎、臍帶血幹細胞、幹細胞、原始生殖細胞、胚胎幹細胞或胎兒。胎兒細胞可以是胎兒肝細胞。任選地，再生提取物從細胞或者包含細胞核的細胞部分提取。任選地，再生提取物可以從處於細胞周期的任何階段的細胞或細胞核獲得，或者從處於細胞周期的多個階段的多種細胞或細胞核獲得。在另一種實施方案中，本發明提供了一種經過如下步驟將細胞再生為多潛能胚胎幹樣(ESL)細胞的方法提供包括年老體細胞的樣品；提供包括再生提取物、白蛋白、ATP、 磷酸肌酸、肌酸、核糖核酸酶抑制劑以及核苷酸磷酸鹽的再生溶液；用該再生溶液與年老細胞組合在一起並且培養充足的時間，以便使再生溶液的成分滲透至細胞從而產生再生的細胞；將細胞培養基、氯化鈣和任選地抗生素的溶液加至已再生的細胞以便於擴增細胞群體； 將已擴增的細胞倒置懸滴培養在板或者未塗層培養皿(Petri dish)的蓋上充足的時間，以便於加速細胞的聚集；在稀釋的瓊脂糖凝膠上或者在已塗層的板和皿上、或者在補充生長因子的適宜培養基中的基質膠(matrigel)上，混懸培養細胞聚集物，以形成擬胚體(EB)； 在飼養細胞的頂部培養擬胚體樣細胞；而且，選擇具有與幹細胞相同形態的細胞集落，籍此將體細胞去分化為多潛能細胞，用於細胞療法和化妝品應用。該稀釋的瓊脂糖凝膠可以是約0.2%至2%的瓊脂糖。在另一種實施方案中，本發明提供了一種用胚胎幹細胞(ESC)mRNA轉染將體細胞再生為多潛能ESL細胞的方法，包括如下步驟從多潛能細胞中提取mRNA ；將mRNA包封於至少一種脂質體遞送試劑中；將體細胞暴露於mRNA脂質體；在板或者未塗層培養皿的蓋上倒置懸滴培養已暴露體細胞充足的時間，以便於加速細胞的聚集；在稀釋的瓊脂糖凝膠上或者在未塗層的培養皿中混懸培養聚集細胞，以形成EB ；在飼養細胞、塗層板和皿上或者在補充了生長因子的適宜培養基中的基質膠上培養EB樣細胞；而且，選擇具有與幹細胞相同形態的細胞集落，籍此將體細胞去分化為多潛能細胞，用於細胞療法和化妝品應用。所述的多潛能細胞可以是ESC、原始生殖細胞(PGC)、胎兒細胞、卵、受精卵、臍帶血幹細胞、組織幹細胞、胚泡細胞或者其組合。所述充足的時間是指約兩小時至過夜。除了用脂質體轉染， 所述的細胞可經過電穿孔或病毒介導。在另一種實施方案中，本發明提供了一種通過ESC細胞與哺乳動物體細胞融合而形成用於自體移植的、多潛能、二倍體ESL細胞的方法，包括如下步驟a.提供ESC ；b.廢除 ESC中的DNA複製能力；c.將非複製ESC與多個體細胞混合；d.通過向其中加入聚乙二醇， 將非複製ESC和體細胞融合；e.將已融合細胞倒置懸滴培養，以生產聚集細胞；f.在稀釋的瓊脂糖凝膠上混懸培養聚集細胞，以生產EB，持續1-10代；g.在飼養細胞、塗層板和皿、 或者在補充了生長因子的適宜培養基中的基質膠上培養EB;而且，h.選擇具有與幹細胞相同形態學特徵並且包含哺乳動物特異性二倍體ESL細胞的、患者特異性ESL細胞的細胞集落。所述ESC可用幹細胞替代，而且所述體細胞可以是纖維原細胞。廢除DNA複製能力的步驟可以用物理的或化學的處理來實現。所述物理的處理可以是Y輻射或者曝露於UV光。 所述化學的處理可以是結合至染色體DNA的化學品，包括放線菌素D、依託泊苷、DNA螯合且相互作用試劑、以及其他的化療劑。在另外一種實施方案中，本發明提供了一種用年老體細胞與非複製靶細胞融合以誘導其中重編程而形成二倍體治療細胞的方法，包括如下步驟a.提供靶細胞；b.廢除靶細胞中DNA複製能力；c.提供自體體細胞；d.將非複製靶細胞與自體體細胞組合在一起； e.將聚乙二醇加至上述的組合，以便於融合細胞，其中非複製靶細胞重編程體細胞的基因組；f.將已融合的細胞培養於適宜的細胞培養基中，以生成具有靶細胞形態和功能的二倍體細胞；和，g.選擇具有靶細胞形態和功能的自體重編程二倍體細胞，籍此向供體提供重編程的自體二倍體細胞，用於細胞替換療法和化妝品。廢除DNA複製能力的步驟可以用物理的或化學的處理來實現。所述物理的處理可以是Y輻射或者曝露於UV光。所述化學的處理可以是結合至染色體DNA的化學品，包括放線菌素D、依託泊苷、DNA螯合且相互作用試劑、以及其他的化療劑。所述靶細胞可以是外源性ESC、成體幹細胞或者分泌胰島素的細胞。 所述體細胞可以是成熟皮膚細胞、血液細胞和骨髓細胞。在另一種實施方案中，本發明提供了一種可以代替使用ESC或組織幹細胞的實施細胞療法和化妝品應用的方法。首先，提供ESL細胞；然後，實施細胞療法或化妝品應用，但是用患者特異性二倍體ESL細胞代替ESC或組織幹細胞。在另一種實施方案中，本發明提供了一種局部地再生人皮膚的方法，包括如下步驟a.用透化皮膚細胞的物質預處理皮膚；b.施用再生試劑，其選自新生細胞(novacell) 提取物、ESC提取物、幹細胞提取物、卵提取物、重組蛋白質或者其組合；c.保持皮膚與再生試劑接觸；和，d.必要時重複步驟a-c。這種方法可在進行前先消毒皮膚。所述再生試劑可包含細胞或細胞核的提取物，向其中一種添加白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制劑和核苷酸磷酸鹽。在另外一種實施方案中，本發明提供了一種從全細胞製備再生因子的方法，包括如下步驟a.提供新生細胞，ESC，組織幹細胞，卵或者從胚胎、胎兒、胎兒組織獲得的細胞， 重組蛋白質或者其組合；b.分離待提取的細胞；c.對細胞進行至少兩個凍融循環；d.以高速離心細胞；和，e.抽取含有再生因子的上清液。在另外一種實施方案中，本發明提供了一種從細胞核製備再生因子的方法，包括如下步驟a.提供新生細胞，ESC，組織幹細胞，卵或者從胚胎、胎兒、胎兒組織獲得的細胞， 重組蛋白質或者其組合；b.分離待提取的細胞，包含胎兒細胞和/或ESC ;c.在低滲緩衝液中裂解細胞；d.離心以分離除去緩衝液；e.對剩餘的細胞核進行至少兩個凍融循環；f.離心以獲得細胞核的提取物；和，g.任選地用透析濃縮再生物。在另外一種實施方案中，本發明提供了一種局部地再生器官的方法，包括如下步驟a.提供從細胞或細胞核製備的再生試劑；和，b.將再生試劑定期地給藥至器官，直至在徵兆、症狀或檢驗結果方面改善，籍此減慢器官的老化和/或改善它的功能。給藥的方法可以是通過靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、心室內、氣管內、關節內、心包內、肺內、鼻內或動脈內的途徑。當應用鼻內途徑時，可將再生試劑放置鼻腔內，籍此該再生試劑達到中樞神經系統以便於治療神經退行性疾病。在另一種實施方案中，本發明提供了一種經簡化工藝、再生哺乳動物體細胞並將它們分化為所期望細胞的方法，包括如下步驟a.用孔道打開處理來處理體細胞並且用生理緩衝液洗滌；b.將步驟a的體細胞暴露於再生緩衝液、ESC細胞核提取物和期望的細胞提取物，約1小時；c.將步驟b的細胞培養於KO-DMEM溶液，該溶液任選地補充了 20% FBS、 青黴素、鏈黴素、穀氨醯胺、非必需胺基酸、β-巰基乙醇、bFGF、TGF-i3 1和LIF;d.在平板蓋上倒置懸滴培養所培養的細胞，約兩小時至過夜；e.收集和合併倒置的液滴；和，f.在明膠塗層板上，收集的細胞生長於補充了生產細胞所需試劑的DMEM中，直至細胞形成期望的細胞類型。在一個變化形式中，體細胞含有纖維原細胞，期望的細胞類型是肌細胞，而且生產細胞所需試劑包括2%滅活馬血清、從成肌細胞的細胞培養介質過濾的上清液，因此，將所收集的細胞如此暴露，直至形成肌管。在這種方法中，步驟a的處理纖維原細胞可包括胰蛋白酶-EDTA、鏈球菌溶血素0、電穿孔或病毒介導。在另一種實施方案中，本發明提供了一種再生緩衝液組合物，包含來自細胞或細胞核或者它們組合的再生因子；lmg/ML白蛋白；ImM ATP ；5mM磷酸肌酸；25μ g/mL肌酸激酶；0. 4U/mL核糖核酸酶抑制劑；和，各自ImM的4種dNTP。優選地，組合的提取物為約二分之一胎兒細胞提取物和二分之一的ESC細胞核提取物。優選地，細胞或細胞核提取物不含細胞。在一種實施方案中，一種系統性再生哺乳動物身體並且改善總體健康和免疫功能的方法，包括如下步驟提供獲得自新生細胞提取物、幹細胞提取物、卵提取物、新生細胞、 ESC、幹細胞、重組蛋白質或者其組合的再生試劑；而且，根據改善的提示，定期地施用再生試劑。給藥的途徑可以是靜脈內、腹膜內、肌內、鞘內、鼻內的途徑或者其組合。在另一種實施方案中，一種再生在組織培養中已經過多次傳代的細胞的方法，包括如下步驟提供預先培養的細胞；提供再生提取物、白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制劑和核苷酸磷酸鹽；用再生溶液與細胞組合在一起並培養充足的時間，使得再生溶液的成分滲透細胞；加入細胞培養基、氯化鈣和任選地抗生素的溶液；和，培養細胞以擴增細胞群體，因此再生在組織培養中已經過多次傳代的細胞。此外，一種關於方法的變化是用下列的步驟代替了最後的兩步在板或未塗層培養皿的蓋上倒置懸滴培養已再生細胞充足的時間，以便於加速細胞聚集，在0. 2%至2%瓊脂糖上或者在未塗層培養皿中混懸培養細胞聚集物以形成EB，在飼養細胞上、在塗層板或皿上、或者在補充了生長因子的適宜培養基中的基質膠上培養EB樣細胞，和選擇具有與幹細胞相同形態的細胞集落，因此，將預先培養的細胞去分化為多潛能細胞，用於進一步的組織培養。一種治療無論是否由化療方案引起的液體癌、白血病、淋巴瘤和造血障礙的方法， 包括如下步驟首先提供通過提供年老體細胞而製備的再生細胞；提供包含再生提取物、 白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制劑和核苷酸磷酸鹽的再生溶液；用再生溶液與年老體細胞組合在一起並培養充足的時間，使得再生溶液的成分滲透細胞；加入細胞培養基、氯化鈣和任選地抗生素的溶液，以擴增細胞群體；分離已再生的細胞；和，將生理溶液與已再生細胞組合在一起，以便於製備可給藥的製品。接下來，為患有無論是否由化療方案引起的液體癌、白血病、淋巴瘤和造血障礙的哺乳動物施用已再生細胞。在另一種實施方案中，本發明公開了一種治療患有CNS創傷、中風、阿爾茨海默病、帕金森病或者肌萎縮側索硬化症患者的方法。第一步是提供再生細胞，該再生細胞的製備如下i.提供年老體細胞樣品；ii.提供含有再生提取物、白蛋白、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、核糖核酸酶抑制劑和核苷酸磷酸鹽的再生溶液；iii.將再生溶液與年老體細胞組合在一起而且培養充足的時間，使得再生溶液的成分滲透細胞；iv.加入細胞培養基、氯化鈣和任選地抗生素的溶液，以擴增細胞群體；v.分離再生細胞；和，vi.將生理溶液與再生細胞組合在一起，以便於製備可給藥的製品。下一步是對患有CNS創傷、中風、阿爾茨海默氏病、 帕金森病或者肌萎縮側索硬化症的哺乳動物施用再生細胞。在另一種實施方案中，本發明提供了一種用於再生年老細胞的試劑盒，包括 a.用於打開年老細胞孔道的試劑，選自胰蛋白酶或鏈球菌溶血素0;b.再生緩衝液組合物； 和，c.不含細胞的胎兒細胞和ESC細胞核提取物。所述的提取物可以用源自多潛能細胞的 mRNA提取物代替。所述的多潛能細胞可以是ESC、PGC、胎兒細胞、卵、受精卵、臍帶血幹細胞、組織幹細胞、胚泡細胞，或者其組合。


圖1概述了本發明的方法，從個體獲得成熟細胞、培養細胞、將細胞再生成「新生細胞」並且隨後用於細胞替代療法。圖2A-2F表示的是對照纖維原細胞(A、B和C)和用胎兒提取物再生的新生細胞 (D)、用ESC細胞核提取物再生的新生細胞(E)和倒置液體中的再生的纖維原細胞(F)。圖 2G-2I表示的是對照老化骨髓基質細胞(G)和用胎兒提取物再生的新生細胞(H)以及用 ESC細胞核提取物再生的新生細胞(I)。圖3A和;3B是未處理皮膚活檢(A)和具有更多細胞增殖的再生皮膚活檢(B)的顯微照片。圖4A表示的是未再生FNSK2細胞；圖4B-4F表示的是，在不同階段，自FNSK2細胞形成的新生細胞。4B表示的是早期的FN-ESL新生細胞；4C表示的是在擬胚體中的FN-ESL 新生細胞；4D表示的是在基質膠塗層板上進一步的生長；4E表示的是在瓊脂糖凝膠上的進一步生長；和，4F表示的是在飼養細胞層上的FN-ESL新生細胞。圖5是凝膠照片，表明FNSK2纖維原細胞沒有產生三個胚胎幹細胞特性異性生物標誌物(0ct4，Ndp52Ll和DPP A3)，然而，三個階段的再生細胞都產生了所有這些生物標誌物。圖6A-6I表示的是初始成熟纖維原細胞和從各種方案得到的新生細胞。圖6B-6E 表示的是從處理成熟細胞使得它們可透過再生因子的各種方法獲得的新生細胞。6F-6K表示的是從多種再生提取物獲得的新生細胞。圖7A-7D表示的是經放射或放線菌素D損害複製之後、從來自成熟雄性和複製缺陷幹細胞的纖維原細胞而產生的融合新生細胞。圖8是生產用於細胞療法新生細胞的再生和分化過程的概述。圖9A-9G表示的是新生細胞分別分化為神經前體、神經細胞、分泌胰島素的小島、 C-肽陽性小島(positive islands)、搏動心肌細胞、骨骼肌細胞和脂肪細胞。圖10A-10D分別表示的是WTCL未再生腫瘤細胞、在飼養細胞上的新生細胞、ESL新生細胞集落和在飼養細胞上的ESL新生細胞集落。經再生後，腫瘤細胞顯示為更少或者不顯現產生腫瘤的能力，如較少的形成瓊脂凝膠集落和在裸小鼠中無腫瘤所顯示的。這種再生誘導的去分化可提供一種開發腫瘤療法的突破性策略。圖11A-11C表示的是將成熟纖維原細胞轉變成再生肌細胞的一步再生/分化方案的結果。圖12是凝膠印記，說明在經歷了再生過程的細胞中端粒酶的再活化；2號、3號和 7號泳道表示的是未處理對照；而且，4號和5號泳道表示的是再生結果，並且與6號泳道內的ESC陽性對照更好地相比較。圖13概括了應用新生細胞體內產生再生的方法。圖14A和14B表示的是未處理皮膚疤痕和經體內再生的褪色疤痕。圖15A-14D表示的是包括對照老化小鼠的小鼠(A和C)。圖15B和D表示的是更活潑的再生小鼠。圖16是預編程pES載體的示意圖。應用限制酶將轉錄因子克隆入PEGFP-N3載體。圖17A、17B和17C分別表示的是纖維原細胞，經兩步體外表觀遺傳重編程、生長在飼養細胞上的多潛能胚胎幹樣(ESL)細胞，以及生長在基質膠塗層板上的ESL細胞。
具體實施例方式本發明描述了將年老細胞再生為比原始細胞更年輕和更具潛能的「新生細胞」的方法。新生細胞變成全能的、多潛能的或多能的。所述再生的細胞已恢復了老化過程中喪失的功能，因而在人疾病的細胞替代療法中非常有用。當體內應用該方法時，細胞再生將減慢或停止組織、器官和全身的老化進程。本發明的主要優點是，它再生從將要接受再生細胞的患者獲得的細胞或組織。應用這種自體細胞和組織，不存在發生移植物抗宿主排斥的風險。可從各種來源，包括皮膚、 血液或者骨髓，收集待再生的細胞。圖1示意性概述將年老細胞體外再生為潛能新生細胞的方法。首先，收集來自上年紀人(例如，從皮膚、血液、骨髓或活檢組織)的細胞，而且在適宜的培養基中培養從而擴增細胞群體。任選地，將細胞暴露於細胞膜透化試劑(例如，胰蛋白酶/EDTA)以打開細胞的間隙連接。經離心和分離透化試劑後，在再生緩衝液中用再生因子再生細胞。經37C培養一小段時間(約30分鐘至3小時)後，將細胞培養於含有胎牛血清(FBS)和抗生素的培養基中。再生的細胞已增強了生理功能並且以快於初始年老細胞的速度而生長。這些再生新生細胞可用於細胞療法，包括對皮膚的美容應用。骨髓基質細胞，支持造血作用的間質來源非造血細胞，在培養中是多能性和自我複製的。類似於ESC，這些祖代可被分化為多種其他的細胞類型，如成骨細胞、成軟骨細胞、 脂肪細胞、心肌細胞、神經元樣(neuron-like)細胞和星形細胞。基質細胞的可塑性是潛在用於細胞替代療法的基礎。但是，老化還是細胞培養物中骨髓基質細胞生長的重要決定因素。從年老小鼠中分離的基質細胞比從年輕小鼠中分離的那些生長得更緩慢。因此，希望體外再生那些骨髓基質細胞，然後將它們用於細胞替代療法。同樣地，希望在治療白血病或其他造血疾病的移植之前，再生骨髓細胞以增強骨髓的生長和恢復。幹細胞定義為多潛能細胞，具有自我更新和分化為特定組織的成熟細胞的能力 (Morrison 等，Ann Rev Cell Dev Biol 1995,11 :35-71)。ESC 的特性之一是它們在分化培養基中分化為其他細胞的能力。ESC還可生長為未分化的EB。一般地，將年老細胞再生為潛能新生細胞的方法包括這些步驟，用含有源自發育早期階段細胞(例如胚胎、胎兒、胚泡、ESC、幹細胞、臍帶血幹細胞和卵)的組織和細胞組份的再生試劑，將細胞體外再生為潛能新生細胞。再生提取物的來源通常比待再生細胞更年輕。得到的新生細胞比原始細胞在形態學、生理學和功能性方面更年輕地起作用 (younger-acting)和更增殖性的。這些新生細胞相對於初始細胞已增強了體外和體內的功能。這些年輕作用的實例包括但不限於製造更多的膠原蛋白和彈性蛋白以及更增殖性的紅細胞前體和骨髓細胞。優選地，新生細胞在形態學、生理學、功能性和多潛能性方面具有ESC 的特性。這些新生細胞可用在研究和商業應用方面，例如，治療特殊疾病、創造新的可相容器官和組織以及篩選新的治療藥物，用於代替ESC。在這裡所教導的方法中，可使用多種體細胞，包括但不限於纖維原細胞，淋巴細胞，表皮細胞，內皮細胞，骨骼、心臟和平滑肌細胞，肝細胞，胰島細胞，骨髓細胞，星形細胞和非胚胎幹細胞(即組織幹細胞)。所述的方法還可用於再生在組織培養中經歷了多次傳代的細胞。新生細胞可用於代替ESC，分化為在細胞療法中所需的組織或組織特異性前體細胞。已再生的新生細胞還可用於植入人或者動物的特定器官或組織，以便於治療疾病。術語再生試劑是指能夠重編程細胞並且將它們再生為發育早期階段細胞(例如新生兒的、胎兒的、胚胎的和ESC)的因子。本發明所用的再生試劑包括但不限於含有能將體細胞再生為多潛能新生細胞的再生因子的組織提取物、細胞核提取物或細胞提取物。所述再生試劑包含胚胎、新生兒、新生兒組織、胎兒、胎盤以及胎兒肝臟和其他組織的組織提取物。所述的細胞核提取物可獲得自ESC、幹細胞、臍帶血幹細胞、生殖細胞和原始生殖細胞(PGC)、卵、受精卵、胚胎、新生兒組織、胎兒肝臟、其他胎兒組織以及其他未成熟組織。再生因子還可以是重組蛋白質和重組eDNA和DNA，單獨的或者在載體(例如質粒或病毒)中。 在本發明的另一方面，再生試劑包含源自ESC、幹細胞、臍帶血幹細胞、PGC、卵、受精卵、胚胎、新生兒組織、胎兒肝臟以及其他組織的mRNA或者總RNA。將這些mRNA或者總RNA導入體細胞使得mRNA在細胞內合成因子，其中它們表觀遺傳地重編程基因組而且將細胞再生為全能或多潛能細胞。或者，再生試劑包含新生兒血清和從ESC、PGC、卵、受精卵、胚胎、新生兒組織、新生兒血清、胎盤、胎兒肝臟以及其他胎兒組織克隆的重組蛋白質。新生細胞定義為比尚未被再生的細胞更年輕地起作用並且是更增殖性的再生細胞。此外，新生細胞顯示已改善的功能性並且具有延長的壽命。新生細胞增強了端粒酶的活性因此必然延長了端粒。這些細胞可無限傳代而沒有早期的老化。新生細胞合成更多的生物化合物，包括但不限於蛋白質、酶、激素和生長因子。因此，新生細胞在恢復特異性細胞、組織和器官的功能方面是有用的。例如，年老的皮膚纖維原細胞不能產生或實際上製造很少的膠原蛋白和彈性蛋白，引起皮膚皺紋。當在年長者中植入或注射入皮膚內以治療皺紋時，再生的纖維原細胞的功能類似於胎兒和新生兒皮膚細胞的那些功能，而且產生更多的膠原蛋白和彈性蛋白。再生的血液細胞，諸如骨髓和造血細胞，是更增殖性的並且存活更久，因此有益於再生障礙性貧血、先天性貧血、化療引起的貧血以及其他血液疾病。根據治療目標，可以應用多種給藥方法。遞送的方法可以變化，包括但不只限於靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、脊柱內、腦室內、氣管內以及關節內(進入關節)。再生因子還可施用於皮膚或者置入皮膚貼片，尤其是增加皮膚滲透性的那種。這裡所用的術語「有效量」用於描述有效產生預期結果的組份(例如分化劑)、前體或祖細胞、專門細胞(例如神經細胞)和/或其他物質的濃度或數量，想要的結果包括將幹和/或祖細胞分化為專門的細胞，諸如神經細胞或其他細胞類型。根據本發明的組合物可用於實現組合物內新生細胞的移植，以便於在大腦或脊髓或者在待治療疾病或病況中產生有利的變化，無論這種變化是穩定化還是改善(例如，停止或者逆轉各種退化疾病或病況，包括神經缺陷)。術語「給藥(administration) 」或「給藥(administating) 」用於整個說明書，以描述這樣的過程，籍此將本發明主題的細胞(如新生細胞或由此獲得的分化細胞)為了治療目的而遞送至患者。本發明主題的細胞是通過多種途徑給藥的，包括但不限於胃腸外的、鞘內的、心室內的、腦實質內的(包括進入脊髓、腦幹或運動皮層)、腦池內的、顱內的、紋狀體內的、口服的、局部的以及黑質內的途徑，等等。基本上，可使用任何方法，使得本發明主題的細胞到達最終的靶點。可以新生細胞或分化細胞的形式施用本發明主題的細胞。根據本發明的組合物可與未處理的分化試劑(「未處理的」即沒有為了促使新生細胞樣品內的細胞分化而進一步處理)或者經過處理(「已處理的」)的分化試劑或者其他試劑一起使用， 所述的其他試劑引起新生細胞樣品內的某些幹和/或祖細胞分化為顯現分化表型(諸如神經元表型)的細胞。所述的細胞在給藥至患者前可經歷活體外分化。通常，給藥取決於所治療的疾病或病況，而且優選地通過胃腸外的途徑，例如通過靜脈，通過給藥至腦脊液(cerebrospinal fluid)，通過鼻吸入，通過直接植入被作用的組織，或者通過其他的系統性或局部的方式。例如，對於阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病，優選的給藥途徑為直接地植入CNS(例如，對於帕金森病而言，是紋狀體、黑質體或者兩者)。對於肌萎縮側索硬化症(Lou Gehrig病)以及多發硬化症，期望優選的給藥途徑為注射至腦脊液。術語「移植(grafting)，，和「移植(transplanting)，，和「移植物(graft)，，和「移植(transplantation) 」在本發明整個說明書中以相同意義使用，以描述籍此將本發明主題的細胞遞送至特定部位的過程，細胞在所述部位中預期顯示有利作用，諸如修復患者中樞神經系統的損傷(這能減小所述損傷引起的認知或行為缺陷)、治療急性或亞急性神經退行性疾病、由腦血管意外事件(中風)或身體傷害(創傷)而引起的神經損傷。還可以用本領域技術人員已知的任何給藥方式將本發明主題的細胞遞送至身體的遠端區域，依賴於細胞遷移至適當區域從而實現移植。分子生物學技術現有技術中已知的而未專門地描述的標準分子生物學技術一般遵循於諸如 Sambrook 等，《分子克隆實驗手冊》(MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL), Cold Springs Harbor Laboratory，紐約州(1989年，1992年)，和Ausubel等，《分子生物學的當今方案》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), John Wiley and Sons，巴爾的摩市，馬裡蘭州(1989年)。聚合酶鏈式反應(PCR)方法學通常是採用如Jam等規定於《PCR 方案方法和應用指南》(PCR PROTOCOLS :A GUIDE TO METHODS AND APPLICA' HONS), 學院出版社，聖地牙哥市，加州(1999年)。涉及其他核酸技術的反應和操作，除非另有說明，通常是按照Sambrook等，《分子克隆實驗手冊》(MOLECULAR CLONING =A LABORATORY MANUAL), Cold Springs Harbor Laboratory，以及下列美國專利的方法而實施的美國專利號 4，666，828 ；4，683，202 ；4，801，531 ；5，192，659、和 5，272，057，而且通過引用結合入本文。應用與流式細胞術結合的原位PCR檢測包含特異性DNA和mRNA序列的細胞(例如， Testoni 等，1996 年，「Blood」，87 :3822)。現有技術中已知的而這裡沒有專門描述的免疫學標準方法通常遵循下列的文獻=Stites等(主編)，《基礎臨床免疫學》(BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY)，第8版， Appleton & Lange，諾沃克市，康涅狄克州(1994年)；以及Mishell和Shigi (主編)，《細胞免疫學中的選擇方法》(SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY) ,W. H. Freeman and Co.，紐約市(1980年)。免疫檢驗通常，免疫檢驗是用於評價樣品的細胞表面標誌物等。免疫細胞化學檢驗本領域技術人員熟知的。在檢驗中可應用多克隆和單克隆兩種抗體。至於適宜的其他免疫檢驗，諸如酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)和放射免疫檢驗(RIA)，是本領域技術人員熟知的，而且也可使用。可利用的免疫檢驗被更廣泛地描述於專利和科學文獻中。參見，例如，美國專利 3，791，932 ；3，839，153 ；3，850，752 ；3，850，578 ；3，853，987 ；3，867，517 ；3，879，262 ； 3，901，654 ；3，935，074 ；3，984，533 ；3，996，345 ；4，034，074 ；4，098，876 ；4，879，219 ； 5，011，771 ；和 5，281, 521，以及 Sambrook 等，《分子克隆實驗手冊》(MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL), Cold Springs Harbor Laboratory，1989 年。對於本領域的技術人員而言，大量的其他出版物、科學參考文獻是易於獲得的。基因療法這裡所用的基因療法是指將感興趣的遺傳物質(例如，DNA或RNA)轉移至宿主內， 以治療、預防或者改變各種疾病或病況。所述感興趣遺傳物質編碼了一種體內期望產生的產物(例如，蛋白質，多肽，肽，功能RNA，和/或反義分子)。例如感興趣遺傳物質編碼有治療價值的激素、受體、酶多肽或肽。或者，感興趣遺傳物質編碼自殺基因。對於詳細的綜述參考《藥理學進展》(ADVANCES IN PHARMACOLOGY)中的「基因療法」，學院出版社，聖地牙哥市，1997 年。移植用細胞的給藥本發明的新生細胞可根據醫療質量管理規範(good medical practice)進行給藥和用藥，同時考慮個體患者的臨床狀況，給藥的部位和方法，給藥的方案，患者的年齡、性別、體重以及醫學執業者認為重要的其他因素。用於這裡目的的藥學上「有效量」或者劑量方案是由這些考慮而確定的，如在實驗臨床研究、藥理和臨床醫學領域中技術人員已知的。 所述的數量必須是有效的，以便於取得症狀以及其他指標的穩定化、改善(包括但不限於年輕的外觀和功能)或者消除，所述的指標是由本領域技術人員選擇作為疾病進展、衰退或改善的適當量度。在本發明的方法中，可以用適於在CNS或其他組織或器官中植入新生細胞的各種途徑施用新生細胞。途徑包括，但不限於，胃腸外給藥包括靜脈內或動脈內給藥，鞘內給藥， 心室內給藥，腦實質內、顱內的、腦池內、紋狀體內的、黑質內給藥，以及口服和局部給藥。本發明還考慮到了包含有效量新生細胞的藥物組合物。這些組合物包含有效數目的細胞，任選地，與藥學上可接受的載體、添加物或賦形劑組合在一起，並且混懸於一種或多種適當介質中。在本發明的一方面，對於需要移植的患者，以無菌鹽水而施用細胞。在本發明的另一方面，以漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)、Isolyte S pH 7. 4或者其他的這類液體而施用細胞，所述液體選自5%葡萄糖溶液、0. 9%氯化鈉溶液、或者5%葡萄糖與0. 9% 氯化鈉混合物。稀釋劑的其他實例可選自乳酸林格氏溶液，乳酸林格氏+5%葡萄糖溶液， Normosol-M和5%葡萄糖，以及醯化林格氏溶液。當然還可應用其他的方法，包括應用不含血清的細胞媒介物。在某些適應症中，對患者細胞系統性給藥是優選的；然而，在其他適應症中，在位於或者臨近已發病和/或損傷組織的地方直接給藥可以是優選的，如藥物介紹所確定的以及諸如本領域技術人員所確定的。同樣地，本發明考慮了通過各種其他介質施用患者細胞，包括可注射的或可植入的小球等。根據本發明的藥物組合物優選地包含有效數目的新生細胞，範圍為約1. OX 104 個細胞至約1.0X1014個細胞，更優選地約1X105至約1 X 1013個細胞，特別優選地約 2 X 105至約8 X 1012個細胞。所述的細胞通常是以混懸液形式給藥，任選地，與為實現藥學上可接受結果所要求的藥學上可接受的載體、添加劑、輔助劑或者賦形劑組合在一起。貫穿本申請，引用了各種專利和專利出版物。在那些出版物內所引述的所有這些專利和專利出版物公開的內容全部地通過引用結合入本文，目的是為了更全面地描述本發明所述領域的發展狀態。下面的實施例不是為了限制本發明權利要求的範圍，只是為了示例某些實施方案。在示例性方法中本領域技術人員所想到的任何變更將落入本發明的範圍。實施例將年老細胞體外再生成潛能新生細胞的示意性概括方法表示在圖1中。首先，從成人，例如，從皮膚、血液、骨髓或活檢組織，收集細胞。並且培養於適當的培養基中，以擴增細胞群體。其次，將細胞暴露於細胞膜透化試劑，例如胰蛋白酶/EDTA，以便於打開細胞的間隙連接。經離心後，用再生緩衝劑中的再生因子再生細胞。儘管不期望被任何理論所束縛，再生因子還是被認為進入了細胞核並改型了染色質。表觀遺傳重編程(例如，DNA甲基化和組蛋白修飾)活化涉及細胞生長和老化的基因。經過用這些因子培養後，將細胞培養於存在胎牛血清(FBQ和抗生素的培養基。再生的細胞增強了生理學功能性(諸如端粒酶或端粒長度、生長因子表達、膠原蛋白合成和細胞複製能力)並且以快於原始年老細胞的速度而生長。這些已再生新生細胞在細胞療法包括化妝品應用方面是有用的。細胞療法隨著體外分化的新生細胞而改變。用途實例包括但不限於肝衰竭、胃潰瘍、灼燒、白血病以及化療相關的貧血。實施例1-培養皮膚纖維原細胞經消毒後，從年齡49歲男性志願者的前臂內側切皮膚活檢Qmm2)。用已消毒剃刀將皮膚活檢切成數個小片並且直接放置於6孔板中，其中，用補充了 10%胎牛血清(FBS) 和100U/mL的青黴素和100 μ g/mL鏈黴素的、一薄層DMEM培養基Qnvitrogen, Carlsbad， 加州)將其覆蓋，然後37°C在補充5% C02的室內空氣中培養。每日用新鮮的DMEM更換培養基。大約培養2周後，纖維原細胞已開始在皮膚邊緣周圍生長。用IX胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)分離纖維原細胞。以1200rpm離心3分鐘，分離所得到的胰蛋白酶/ 纖維原細胞溶液。重新懸浮纖維原細胞沉澱並計數細胞。根據計數，將細胞接種於一個新的6-或孔、DMEM培養基的板中。收集纖維原細胞並轉移至75mm板或燒瓶，用於進一步擴增。這些年老纖維原細胞比已再生細胞生長得更緩慢而且產生更少的膠原蛋白和彈性蛋白(參見下文)。將細胞再次胰蛋白酶化，離心分離，並重新懸浮於10% FBS和8% DMSO 中。將這種細胞溶液存儲於液氮中。實施例2-培養血液或骨髓細胞骨髓移植的成功率隨著年齡增長而下降，因此，人們可推論，優選更年輕(新生兒的)的細胞用於造血重建。同樣，老化還是骨髓基質細胞在細胞培養中生長的重要決定因素。從老化小鼠中分離的基質細胞比從年輕小鼠分離的那些生長得更緩慢。因此，希望在用於細胞替代療法之前，體外再生老化的骨髓細胞。白細胞提供了可用於體外再生的末端分化細胞的、快捷且常規的來源。應用肝素鈉作為抗凝劑而收集IOmL血樣並加至15mL試管，並且用四倍體積的、含有EDTA(3mM)的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)稀釋。將稀釋溶液裝載於50mL圓錐試管中的Ficoll-Hypaque介質 (Sigma，聖路易斯市，密蘇裡州)上，然後在20°C、以400rpm在吊桶式旋轉器中不間斷地離心30分鐘。除去上層(血漿)，然後小心地將中間的細胞層(包含淋巴細胞和單核細胞) 移至另一個50mL試管中。加入含有2mM EDTA的PBS至總體積30mL，然後以300rpm離心另外10-20分鐘。重複這種洗滌步驟，然後將細胞沉澱重新懸浮於300 μ L脫氣緩衝液(PBS， ρΗ 7. 2，補充了 0. 5%牛血清白蛋白[BSA]和2mM EDTA)。在75_100mm板上，將細胞混懸於DMEM(Invitrogen)中。活單核細胞(包括幹細胞)在約30分鐘內附著在板上。剩餘的紅細胞和其他的白血病仍混懸於介質中，並且通過簡單更換介質將其洗掉。將附著於板上的細胞胰蛋白酶化，並用於再生。任選地，應用MiniMacs分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Auburn，加州)，進一步地分離⑶34-陽性祖細胞。收集白細胞沉澱並培養於Myelocult培養基中(H1500，幹細胞技術公司，溫哥華市，BC省，加拿大)，該培養基補充了 10% FBS和人細胞因子，所述細胞因子包括幹細胞因子(SCF，lOng/mL)、Flt3配體(FL，lOng/mL)、白介素-3 (IL-3，20ng/mL)、IL-6 (10ng/mL)、IL-11 (10ng/mL)，促血小板生成素(ΤΡ0, 50ng/mL) 以及促紅細胞生成素(EP0，4單位/mL)。細胞因子可購自EMD Biosciences (聖地牙哥市，加州)和BD Biosciences (聖何塞市，加州)。培養物於37°C、在補充了 5% C02空氣中培養。實施例3-製備用作再生因子的胎兒提取物在發育早期收集的組織(例如，胎兒和胚胎)是用於再生細胞的極好再生因子來源。下述小鼠胎兒肝臟的實例說明了這種方法。從懷孕小鼠收集胎兒，而且將胎兒肝臟解剖分離至含有冰冷PBS的培養皿中。用無菌剪刀或剃刀將肝組織切碎成小片，用PBS將其轉移至玻璃均質器中。隨著研棒溫和上下運動約20次，將肝組織均質化。使細胞通過尼龍層，以便於除去纖維狀結締組織，並且於4°C、以600rpm離心10分鐘。用冰冷的提取緩衝液(50mM HEPES，pH 7. 4,50mM KCl,5mM MgCl2, 2mM β -巰基乙醇，和5mMEGTA)洗滌細胞兩次。用額外含有下列蛋白酶抑制劑的相同緩衝液洗滌細胞松胞菌素B，亮肽素、抑肽酶和胃蛋白酶抑制劑A(各10 μ g/mL)。在冰上培養5分鐘後，以IOOOrpm離心細胞，1分鐘。小心地除去上清液，留下大約一半的溶液體積。將細胞經過3個凍融循環(_80°C至室溫)，並於4°C、以12，OOOrpm離心30分鐘。 收集上清液提取物，然後加入2%甘油。在液氮中冷凍在0.6mL試管內的等份試樣(0. ImL) 並且存儲於_80°C。諸如這樣的胎兒和胚胎提取物富含用於再生年老細胞、組織、器官和哺乳動物全身的因子。這種方法還可以用於提取其他的胎兒組織、全胎兒、胚胎和胎盤。實施例4-製備用作再生因子的胚胎幹細胞(ESC)將ESC胰蛋白酶化(參見實施例1)，然後在1.5mL試管中收集大約2 χ 107個細胞。如實施例3中所述，首先用冰冷提取緩衝液洗滌細胞兩次，然後經歷3個凍融循環 (_80°C至室溫)，並於4°C、以12，OOOrpm離心30分鐘。收集上清液提取物，然後加入2%甘油。在液氮中冷凍在0.6mL試管內的上清液等份試樣(0. ImL)並且存儲於_80°C。這種方法還可用於從其他組織幹細胞、臍帶血幹細胞以及已再生新生細胞中分離細胞提取物，用於細胞再生。這種方法還可用於從組織如胎兒、胚胎和胎兒的組織提取組織提取物。實施例5-從ESC細胞核提取物中製備再生因子應用如早期所述的方法(Tian等，DNA Repair (Amst), 2002,1 1039-49)，純化 ESC 細胞核提取物。概括地，經室溫、2200rpm離心5分鐘，得到ESC，然後用5倍細胞體積的冷 PBS洗滌一次。將ESC懸浮於切細胞體積的緩衝液A中，緩衝液A是IOmM HEPES緩衝劑、 1. 5mM MgC12、10mM KC1、0. 5mM DTT的低滲緩衝液。保溫於4°C，用玻璃均質器(Wheaton A Dounce均質器，-10個衝程)溶解ESC，然後通過以2200rpm離心15分鐘，收集細胞核。 將細胞核置於1/2細胞核體積的緩衝液C(10mM HEPES緩衝液，25%甘油，1.5mM MgCl2, 420mM NaCl，0. 5PMSF，0. 5mM 二硫蘇糖醇[DTT])中，從而提取細胞核蛋白質，於4°C攪拌30 分鐘(必要時在Dounce中再均質一次)，然後經過3個凍融循環(_80°C至室溫)。4C、高速(12，000rpm，SS-34)離心混懸液30分鐘。然後，在冷室內，將上清液經50體積的緩衝液 D(20mM HEPES, ρΗ 7. 9，20%甘油，0. 2mM EDTA, IOOmM KC1，0. 5mM 苯甲基磺醯氟[PMSF]和 0. 5DTT)透析。更換緩衝液，然後經50體積的緩衝液D透析 2. 5小時。將上清液轉移至 30mL Corex試管中，然後在HB-4旋轉器中、4C、10，OOOrpm旋轉20-30分鐘。測量蛋白質的濃度，然後調節至25-30mg/mL蛋白質，以0. ImL等份試樣在液氮中冷凍並儲存於-80C，用於以後的細胞再生。這種方法還可用於從其他的組織幹細胞、臍帶血幹細胞和已再生的細胞分離細胞核提取物。實施例6-再生年老細胞的方法可以使用從較年輕哺乳動物個體的多種組織或細胞收集的細胞或者細胞核提取物再生年老的細胞。經再生後，得到的細胞為更多潛能的。經再生後，細胞在老化過程中喪失的功能性被恢復。用皮膚纖維原細胞來示例這種方法。根據實施例1中所述而製備纖維原細胞。概括地，將纖維原細胞胰蛋白酶化然後在1. 5mL試管中收集大約3x105個細胞的等份試樣。用冰冷的漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細胞，然後用300-1000ng/mL鏈球菌溶血素0(SL0，Sigma)於37C預處理1小時，以便於打開細胞間隙連接。在用200 μ L冰冷的HBSS洗滌之後，以1200rpm於4C離心3分鐘，然後用緩衝液TQOmM HEPES，pH 7. 3，IlOmM KAc, 5mM NaAc,2mM MgAc, ImM EGTA，2mM DTT, 1 μ g/ mL的每種抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑A和亮肽素)洗滌細胞。經離心後，將細胞沉澱混懸於 20 μ L的再生緩衝液中，該再生緩衝液含有lmg/mL BSA, ImM ATP, 5mM磷酸肌酸，25 μ g/ml 肌酸激酶(Sigma)，0. 4U/mL核糖核酸酶抑制劑(Invitrogen)，和各自ImM的四種dNTP (三磷酸核苷酸)，以及在緩衝液T中製備的ESC細胞核提取物(Martys JL等，1995年J. Biol. Chem 270 :25976-84 ；Hansis C 等，2004 年 Curr Biol 14:1475-80)。細胞在水浴中 37C 培養約1小時，偶爾振搖。在這種再生步驟之後，通過在6孔板中加入含有2mM CaC12和抗生素的K0-DMEM，將細胞再密封，以便於密封被SLO打開的膜孔。每日都更換KO-DMEM培養基， 直至再生纖維原細胞匯合。將細胞胰蛋白酶化並分散至IOOmm板中，圖2表示的是對照纖維原細胞(圖2A和2B)與用胎兒提取物處理的新生細胞(圖2D)以及用ES細胞胞核提取物處理的新生細胞(圖2E)的對比。對照纖維原細胞以非常慢的速度生長而且沒有達到匯合；將細胞廣泛地分開而且稀疏地分布在板上。相反地，新生細胞快速地生長而且達到匯合；新生細胞非常擁擠而且排列在一起。在液氮中儲存這些再生細胞，待用。本發明人考慮到了一些變更。同樣地，在細胞再生前，應用蛋白酶(例如，胰蛋白酶和膠原蛋白酶)、洗滌劑(洋地黃皂苷)和電穿孔來預處理細胞膜。在另外的實驗(數據未列出)中，發現應用二分之一體積的胎兒組織提取物和二分之一體積的ESC細胞核提取物是優化的。胎兒組織提取物可能作用為再生年老細胞的引發劑而發揮作用，而ESC細胞核提取物作用為加速再生過程的促進劑。用這種方法再生的細胞保持了與初始未處理的細胞相同的形態。但是，再生細胞具有比對照細胞更高的細胞增殖率和更佳的細胞功能。例如，再生纖維原細胞比未處理的纖維原細胞合成更多的膠原蛋白和彈性蛋白，表現出在化妝品療法中的價值(參見下面的數據)。再生骨髓細胞或造血幹細胞可用於治療化療方案引起的液態癌、白血病和造血功能障礙。同樣地，我們預計再生細胞具有更長的端粒和更高的端粒酶活性。實施例7-皮膚組織的再生這是一種簡化的再生年老皮膚組織的方法。按照實施例1獲得皮膚活檢，然後培養於補充了 10% FBS和100U/mL青黴素以及100 μ g/mL鏈黴素的DMEM培養基中。經過夜培養後，皮膚組織已附著在板上。除去培養基，然後向皮膚組織中加入50 μ L再生緩衝液和 50 μ L再生因子(ESC細胞核提取物)。將皮膚組織於37°C再生4小時，然後加入一體積含FBSWhDMEM。培養皮膚組織2星期，每2天更換一次培養基。圖3表示的是左側的未處理皮膚，具有很少的纖維原細胞長出。右側再生的細胞具有從皮膚出現的、許多新生長的細胞而且附著於皮膚邊緣。這些數據說明，可以再生皮膚組織，而不僅是單獨的細胞。再生後， 皮膚獲得了年輕皮膚的功能而且生長了更多的新生細胞。因此，這種再生方法可用於修復組織或器官而且恢復了老化組織和器官的功能。用上述的方法恢復從年老小鼠中分離的骨髓基質細胞。從年老小鼠中分離的對照骨髓基質(stroman)細胞生長得非常緩慢(圖2A)。用胎兒幹細胞提取物再生之後，基質細胞顯得非常健康而且以更快的速度倍增(圖2H)。有趣的是，用ESC細胞核提取物再生的基質細胞在培養中生長得甚至更好(圖21)。實施例8-小鼠皮膚纖維原細胞再生為胚胎幹樣(ESL)新生細胞用小鼠ESC的細胞核提取物(實施例5)體外再生小鼠纖維原細胞的細胞系(FNSK1 ;Hu 等，Mol Endocrinol 1995，9 :628-36 ;Hu 等，J Biol Chem 1996,271 18253-62)。採用三個篩選步驟以便於將纖維原細胞去分化為ESL新生細胞。經過這種特殊的篩選操作後，只有那些完全重編程的細胞生長於篩選培養基中。1)首先將再生細胞培養於倒置的液滴中，然後在0. 35%瓊脂糖凝膠上，在補充了 20% FBS、lx抗生素(100U/mL 青黴素和10(^8/1^鏈黴素)、1福穀氨醯胺、1(%非必需胺基酸、0. ImM β-巰基乙醇、4ng/ mL bFGF、0. 12ng/mL TGF-β 1 和 10ng/mLLIF 的 Knock-Out DMEM (KO-DMEM) (Invitrogen)中混懸培養。2~)篩選ESL集落，然後生長於胚胎纖維原細胞飼養細胞上。經培養後，有些細胞變成聚集的而且形成較小的、形態與ESC相同的新生細胞集落。在培養生長2天或更多天後，新生細胞集落長得更大(圖4D)。3)小心地挑選細胞集落，然後接種在新鮮的飼養細胞上(圖4F)。這些衍生細胞被稱作FN-ESL，然後擴增並儲存於液氮中，除了小份經保存並針對ESC標誌物進行分析。本實驗表明，依據去分化方案的體外再生方法能夠誘導纖維原細胞去分化為ESL細胞。基於它們的形態以及端粒酶的表現(相同於ESC)(參見實施例9和 20)，預計這些FN-ESL細胞在細胞療法中發揮如ESC —樣的作用。為了檢驗這種推測，從已培養的FN-ESL細胞生長EB。在含有20% FBSU000U/mL LIF的KO-DMEM培養基中培養FN-ESL細胞。用胰蛋白酶分離法收集指數生長期的FN-ESL， 然後在倒置培養皿的蓋子上將細胞混懸液製成懸滴(20 μ L)。在培養皿的底添加PBS或水。 3天後，EB已形成，並被收集至新鮮的、預塗0. 1 %明膠的培養皿上。通過FN-ESL形成EB表明，FN-ESL功能類似於ESC。實施例9-在FN-ESL細胞中表達ESC標誌物應用胰蛋白酶-EDTA，從板上收集FN-ESL細胞。用"Tri-Reagent方法(Sigma，聖路易市，密蘇裡州)，從細胞中提取總RNA。為了消除在cDNA合成中的DNA汙染，首先用DNA 酶I處理RNA樣品；然後用RNA逆轉錄酶合成cDNA(Vu和Hoffman，J Biol Chem 1996， 271 :9014-9023;Hu 等，Mol Endocrinol 1995，9 :628-36;Hu 等，JBiol Chem 1996,271 18253-62)。在cDNA樣品中，用PCR檢查基因表達，如前面所描述的，Vu，1996年，同上；Yao等， J Clin Invest 2003，111 :265-73)。在存在 50 μ M dNTP、InM 引物、0. 125U KTl DNA 聚合酶下，在3. O μ L反應混合物中擴增cDNA樣品(Hu等，J Biol Chem, 1997，272-20715-20 ； Yao, 2003,同上)。將cDNA和引物加熱至95°C，1. 5分鐘，然後經35個循環進行擴增，所述循環為95°C、15秒，65°C、40秒和72°C、30秒。在5 %聚丙醯胺-尿素凝膠上，對PCR產物進行電泳，而且用phospholmage掃描儀(Molecular Dynamics, Sunnyvale,力口州)進行掃描。下列PCR引物用於mRNA定量0ct4 5'-引物(#3284)-AGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGA(SEQ ID NO :1)3'-引物(#;^^)-CTTCTGCAGGGCTTTCATGTCCTG(SEQ ID NO :2)Ndp52Ll 5'-引物(#3288)-TAGAAGAGATGGAACAGCTCAGTGA(SEQ ID NO 3)3'-引物(#;^89)-ATTGACCCTCTGTGTTGCTTCCAGT(SEQ ID NO :4)Dppa3 5'-引物(#3290)-CTATAGCAAAGATGAGAAGACTTGT(SEQ ID NO 5)3'-引物(#;^91)-TGCAGAGACATCTGAATGGCTCACT(SEQ ID NO :6)β-肌動蛋白5'-引物(#1483)-TGAGCTGCGTGTGGCTCCCGA (SEQ ID NO 7)3'-引物(#1484)-GATAGCACAGCCTGGATAGCA(SEQ ID NO :8)圖5表示，泳道1和14為IOObp DNA標誌物。泳道2、6、10和15包括了未再生纖維原細胞對照細胞產生的結果。泳道3、7、11和15包括了早期ESL新生細胞產生的結果。 泳道5、9、13和18表示了生長於飼養細胞上的新生細胞所產生的結果。對照纖維原細胞被最後分化，然而沒有表達三種ESC標誌物(0ct-4，Ndp52Ll和DppU)。但是，所有三個階段的再生的新生細胞都表達了高水平的三種ESC標誌物。內對照β-肌動蛋白相等地表達於所有的細胞類型中，包括對照細胞。這些數據證實了，體外再生方法能夠將體細胞去分化為多潛能的ESL新生細胞，而且能夠分化為其他細胞和組織，用於細胞療法中的ESC替代。實施例10-用體外表觀遺傳的重編程而形成多潛能細胞如前面的實施例，將纖維原細胞胰蛋白酶化，然後分成大約106個細胞的小份於1.5mL試管中。離心這些試管，並且傾去上清液。然後，加入50yL的胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)，而且將得到的混合物於37°C培養5分鐘，以便於使細胞膜透化。以 1200rpm旋轉細胞3分鐘，以沉澱細胞。用緩衝液T(20mM HEPES, pH 7. 3, IlOmM KAc5,5mM NaAc, 2mM MgAc, ImM EGTA, 2mM DTT,各自1 μ g/mL的抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑A和亮肽素) 洗滌所得的細胞。然後，將細胞再懸浮於20 μ L再生緩衝液(ang/mL BSA, 2mM ATP，10mM磷酸肌酸，40U/mL肌酸激酶，0. 5 μ L核糖核酸酶抑制劑，5 μ L緩衝液Τ，10 μ L ES或胚胎提取物)中，而且於37°C再生1小時。在再生期結束時，向再生溶液加入280 μ L補充了 10% FBS5、lx抗生素(100U/mL的青黴素和100 μ g/mL的鏈黴素)、ImM穀氨醯胺、1 %非必需胺基酸、0. ImM β-巰基乙醇、4ng/mL鹼性纖維原細胞生長因子(bFGF)、0. 12ng/ml TGF-I和 10ng/ml白血病抑制性因子(LIF)的K0-DMEM。如實施例6，還可在細胞再生前應用洗滌劑(例如，洋地黃皂苷)鏈球菌溶血素 O(STO)或電穿孔來預處理細胞膜。再生後，細胞被直接鋪板時不能自動地去分化為多潛能ESL。但是，再生的細胞具有短的倍增時間和其他改善的生理功能。應用下列的三步篩選工藝，完全地分離重編程的細胞。將已再生細胞培養於20 μ L液滴中。將細胞液滴置於IOOmrn平板的蓋子上，然後小心地倒置。將PBS置於平板的底。培養細胞過夜。在此階段，再生細胞是高度地可移動的；大多數向上移動從而附著於未塗層的板蓋上。為了從蓋子上分離這些細胞，將細胞胰蛋白酶化。將所有的細胞液滴合併，其中加入lmLKO-DMEM。然後，得到的細胞生長在飼養細胞(未再生細胞或未重新變成的細胞)上。維持再生細胞，每天都更換培養基。篩選聚集的ESL細胞集落，然後作為被混懸於補充了 4ng/mL bFGF、0. 12ng/mL TGF-β 1和10ng/mL LIF的KO-DMEM中的細胞在0. 5%瓊脂糖凝膠上生長。未重編程的和部分重編程的細胞不能存活於混懸液培養基中。經過數代天)後，將聚集的ESL細胞轉移至飼養細胞層上生長。篩選具有與ESC相似形態和健康細胞類型的細胞，用於進一步的ES標誌物分析。經過數代後，將這些細胞保存於液氮中或者用於細胞分型和分化檢驗。經過這三步特殊處理(倒置液滴、在瓊脂糖上的混懸細胞以及ESC篩選)後，這些培養的新生細胞具有不同於初始年老細胞的細胞形態。這些新生細胞是多潛能性的而且在細胞療法中可替代正常的異種ESC。因為這些細胞來自於接受者，自體新生細胞不會引起用臍帶血幹細胞和其他細胞移植可能發生的、移植物抗宿主反應。實施例11-通過體外表觀遺傳的重編程將人皮膚纖維原細胞轉化為多潛能新生細胞培養來自49歲男性的纖維原細胞，而且用不同的預處理和不同的細胞提取物體外再生。經再生後，篩選新生細胞在瓊脂糖凝膠的上層生長，並且在顯微鏡下拍攝新生細胞集落的照片。數據清楚地表明，用胰蛋白酶_EDTA(圖6B)、鏈球菌溶血素0(圖6C)、洋地黃皂苷(圖6D)和電穿孔(圖6E)預處理的纖維原細胞產生了類似的再生細胞，相比於未處理的對照纖維原細胞(圖6A)。此外，用ESC細胞核(圖6F)、GC細胞(圖6G)、胚泡(圖6H) 以及非洲爪蟾卵(圖61)的提取物可類似地再生纖維原細胞。實施例12-通過複製缺陷的ESC融合而形成多潛能新生細胞幾個研究組已報導，通過用ESC體外雜交或融合而從體細胞(例如，纖維原細胞) 形成 ES (例如，Tada 等，Current Biology 2001，11 :1553-58 ；和 Cowan 等，Science 2005， 309:1369-73)。但是，所形成的ESC是四倍體細胞，同時含有靶細胞和ESC的基因組。對於臨床應用而言，四倍體細胞不是理想的，因為它們被認為是遺傳上不穩定的。為了解決這種問題，我們開發了一種新的方法，用一種「ESC複製缺陷」(ESR)方法從體細胞構建二倍體的而非四倍體的、多潛能ESC。在這種方法中，我們首先廢除了重編程 ESC的DNA複製體系(machinery)的功能，這樣ESC基因組不能複製或有助於新結合細胞的融合。儘管ESC複製被短期阻止，但是，存在的基因組還是能產生mRNA以及隨後的重編程因子蛋白，所述重編程因子蛋白在將靶細胞轉分化(trans-differentiating)為ESC中是必需的。得到的多潛能ESC是二倍體的。更重要地，這些是個體化ESC，因此可用於在疾病治療中代替ESC。廢除DNA複製功能所用的方法包括，但不限於，將ESC曝露於輻射、化學的物質、化療劑、病毒和物理處理。這些方法已用於阻止飼養細胞的DNA複製。在ESC中檢驗了兩種廢除DNA複製功能的方法。在一種方法中，將ESC曝露於輻射(銫，3000rds)。經曝露後，ESC DNA被損傷而且不能複製產生子細胞。但是，這種已處理的ESC在培養至約一周時還存活，而且許多基因， 包括細胞重編程所需的那些基因，仍然是活躍的和表達蛋白質的。結果是，被輻射的ESC可被用作一種可靠的來源，提供將體細胞轉化為多潛能ESC的重編程因子。由於複製缺陷的特徵，ESC基因組不能複製而且在細胞融合後不能貢獻於子細胞基因組。在另一種方法中，通過將ESC暴露於0. 5 μ g/mL放線菌素D過夜而使DNA複製無效。經處理後，放線菌素D阻止了 ESC中的DNA複製，但是保持蛋白質合成體系完整。經細胞融合後，已處理的ESC將重編程因子貢獻於融合細胞，但是未貢獻於子細胞的基因組。經數代的篩選後，僅有那些二倍體ESC生長而且可用於治療應用。對於細胞融合，將等量的複製缺陷ESC與靶體細胞(例如，纖維原細胞)混合併且用CMF緩衝液(不含鈣和鎂的HBSQ洗滌兩次。將得到的細胞沉澱離心分離從而完全地除去殘留的緩衝液。然後，拍動試管以便於鬆動和混合細胞沉澱，此後，加入1.5-2mL PEG(聚乙二醇1500，編號783641，羅氏，德國)，1分鐘以上。為了混合細胞和PEG，再次輕拍並轉動試管。隨後，滴加 20mL 預熱的(37°C)PMF 緩衝液(0. 2M PIPES,pH 6. 95,2mM MgS04 和 4mM EGTA)，3-5以上，沒有散開細胞團塊。緩慢地加入額外的20mL PMF緩衝液，而且小心地將試管倒置以便於混合細胞。然後，以1200rpm離心分離所得的細胞5分鐘，並且重懸浮於補充了 ^g/mL bFGF和0. 12ng/mL TGF-β 1的KO-DMEM培養基中。如上所述，將融合的細胞在瓊脂糖凝膠上層或在明膠塗層板上混懸培養。或者，可以應用電穿孔和病毒介導的細胞融合，從而由複製缺陷ESC和靶細胞構建融合細胞。對於電穿孔，將等量的複製缺陷ESC和靶體細胞混合併用PBS洗滌3次。以 106個細胞/mL的濃度將細胞混懸於0. 3M甘露醇緩衝液中。用電融合(E = 2. 5-3. OKF/ cm)產生雜種細胞，應用帶有Imm電極間隔的載玻片的BTX電細胞作業系統(Electro Cell Manipulator) 2000 (BTX, Holliston，緬因州)。經融合後，培養細胞而且在補充了 4ng/mL bFGF和0. 12ng/mL TGF-β 1的K0-DMEM培養基中進行篩選。經融合後，用複製缺陷ESC所提供的因子在融合的細胞中對體細胞的細胞核進行表觀遺傳地重編程。經過數代後，初始複製缺陷ESC的基因組已完全地消失而留下重編程的體基因組在融合細胞內。在篩選後，培養的新生細胞具有多潛能性而且是二倍體細胞，因此可用於細胞替代療法。數據表明，輻射(圖7Α和7Β)和放線菌素D(圖7C和7D)引起缺陷DNA複製。經細胞融合後，篩選和擴增二倍體ESL-新生細胞。這些二倍體ESL-新生細胞是來自患者的 ESC，而且不存在重編程供體細胞(E12ESC)基因組汙染的風險。這些融合的細胞具有與ESC 相同的形態和生長速度。同樣地，融合的細胞表達ESC生物標誌物0ct4、NanOg*Mellar。 因此，融合的細胞在細胞替代療法方面是有用的。實施例13-多潛能新生細胞的分化圖8是示意性概括本發明的方法，將年老細胞再生為多潛能新生細胞、然後為已分化細胞。如圖1，首先收集年老細胞並培養於適當的培養基中以擴增細胞群體。在細胞暴露於細胞膜透化試劑(例如，胰蛋白酶/EDTA)以打開細胞的間隙連接之後，在再生緩衝液中用再生因子再生細胞。經再生後，將細胞培養於補充了特定生長因子的適當培養基中。 然後，在飼養細胞或塗層的基質(例如，基質膠或瓊脂糖)上篩選多潛能新生細胞的集落。 所選的新生細胞具有胚胎幹細胞(ESC)或其他組織特異性幹細胞的基本特徵，而且可用於在細胞療法中替代ESC和幹細胞。這些新生細胞的一個優點是，它們可源自相同的患者，因而顯著性地減少或消除在返回患者時的免疫排斥的機會。另一個優點是，當新生細胞用於細胞療法時，由於避免了使用人的胚胎，因此不存在倫理或政治的顧慮。這些方法隨著所探索細胞的類型而改變。通常，用於分化胚胎幹細胞的已公布方法適於分化ESL-新生細胞。下面是如何將新生細胞分化為脂肪細胞和骨細胞的實例。
37°C在1000U/mL的LIF存在下，在含20% FBS的KO-DMEM中培養ESL新生細胞。 將細胞混懸液製備成培養皿上的懸滴(30 μ L)。在培養皿底添加PBS。2天後，擬胚體(EB) 形成，然後被收集到用0. 1 %明膠預塗的新培養皿上。對於脂肪細胞的分化，將附著的EB用 10-6M的全反式視黃酸(ATRA)處理3天，然後用10-7M的胰島素和2X10-9M的三碘甲狀腺原氨酸(T3)。對於成骨細胞分化，在開始的第5天，在含有3X10-4M的抗壞血酸磷酸酯和 10-2M的Y-甘油磷酸酯的培養基中用10-8M的1，25 (OH) 2維生素D3處理EB。在10天、20 天和30天，終止培養，然後用於免疫組織化學染色。經分化後，用免疫組織化學染色法確定脂肪細胞和骨細胞的形成。對於在已分化脂肪細胞中染色脂質，用PBS洗滌細胞並於10%中性福馬林中室溫固定2分鐘。經過用自來水漂洗後，用油紅0染色細胞10-12分鐘，直至油滴在顯微鏡下可見是染色的。然後，用50%異丙醇和自來水漂洗載片。用蘇木精復染細胞10分鐘。在光學顯微鏡下，觀察已分化脂肪細胞(圖9G)。在未處理的對照纖維原細胞中不存在脂質染色 (未示出)。相反地，經分化後，FN-ESL新生細胞合成積聚於細胞質中的脂質。這些數據表明，FN-ESL新生細胞具有此潛能而且確實分化為脂肪細胞。實施例14-FN-ESL新生細胞分化為骨骼肌細胞如上所述，形成EB。將所得到的FN-ESL細胞(大約切105)轉移至倒置的、細菌培養皿中，在Iscove改進的Eagle培養基(Invitrogen)中，補充了 20 % FBS、2mM L-穀氨醯胺、Ix非必需胺基酸、450μΜ單硫代甘油(Sigma)和抗生素。在5_7天後，將EB平鋪至0. 1 %明膠塗層的6-孔組織培養皿中，密度為7-10個EB/孔，並且培養4天。用 Dulbeccos-PBS(D-PBS)洗滌細胞，然後用補充了 2%滅活馬血清和ImL的C1C12培養介質上清液(用0. 2 μ m過濾器過濾)的、2mL/孔的DMEM培養。每天都更換培養基，共2_4天。 隨後用顯微鏡觀察，在分化過程中肌管形成。用免疫組織化學法確定骨骼肌的分化。用D-PBS洗滌已分化的細胞3次，然後用 100%乙醇固定5分鐘。室溫下，在含有0.05-0. 皂苷的D-PBS中，用常規山羊血清阻擋背景。將一抗稀釋於含有細g/mL的BSA和0. 05-0. 皂苷的D-PBS中。加入小鼠抗MHC—抗(Sigma，1 500)而且培養室溫1_3小時或者4°C過夜。然後，用D-PBS洗滌細胞5次O次快速漂洗，1次15分鐘，2次5分鐘)。加入二抗溶液(山羊抗小鼠1 1000) 而且室溫培養0. 5-1小時。在用含有0. 05%皂苷的D-PBS洗滌5次(同樣的方案)之後， 用kiss Axiovert 200倒置螢光顯微鏡觀看細胞。在對照細胞中不存在骨骼肌蛋白質的免疫染色(未示出)。經分化後，FN-ESL新生細胞被聚集而且融合為肌管和合成骨骼肌特異性蛋白質(圖9F)。這些數據表明，FN-ESL 新生細胞具有此潛能而且確實分化為骨骼肌。實施例15-FN-ESL新生細胞分化為心肌細胞在BMM2/NG飼養細胞上、在補充了 20%FBS、1000U/mL LIF、L_穀氨醯胺、非必要胺基酸以及β -巰基乙醇的Knockout Dulbecco' s改進的Eagle培養基(K0-DMEM)中培養 FN-ESL新生細胞。以30戈瑞(Gray)的Y-照射預處理BMM2/NG飼養細胞，以停止它們的複製。在不含LIF的KO-DMEM中密度為大約2. 0x106個細胞，將FN-ESL新生細胞接種於細菌培養皿中，從而形成EB。3天後，收集EB並鋪板至基質膠塗層的培養皿、在10% FBS/ KO-DMEM中。兩個小時後，將lOOng/mL肌動蛋白A加入培養基而且培養細胞M小時。再次用10% FBS/K0-DMEM替換培養基，共6小時。然後，將10-6M ATRA加至培養基而且細胞再培養M小時。用含有10ng/mL bFGF的10% FBS/KO-DMEM處理細胞，共3天，然後切換至 N2培養基，其含有補充了 B27、1 μ g/mL層粘連蛋白、IOmM煙醯胺和lOng/mL bFGF的DMEM/ F12(l 1)。這種N2培養基每天都更換直至分析。在N2培養基中的第4天，在培養中存在搏動的細胞簇。將一些搏動的心肌細胞轉移至載片並且用4%多聚甲醛的PBS固定，於4°C過夜，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌兩次。室溫下，用馬血清封閉非特異性結合位點1小時。應用下列的一抗和稀釋比胰島素AB-6小鼠單克隆抗體(Lab Vision，弗利蒙特市，加州)1 200，肌鈣蛋白T小鼠單克隆抗體(Lab Vision，弗利蒙特市，加州)1 100和抗C-肽抗體(LINCO Research, Inc.，聖路易斯市， 密蘇裡州)1 100。根據製造商說明書，應用第二即用型通用抗體。DAB(3，3' -二氨基聯苯胺)用作反應底物。用kiss Axiovert 200倒置顯微鏡拍攝圖像(圖9C-E)。這些數據表明，FN-ESL新生細胞能夠分化為功能性搏動的心肌細胞。實施例16-FN-ESL新生細胞分化為分泌胰島素的胰腺β細胞如上所述，形成ΕΒ。應用經小改變的所述用於小鼠ESC的三步方法(Shi等Mem Cells, 2005, 23 :656-62)，分化分泌胰島素的細胞。我們完成標準免疫組織化學方案，使用了艮口用型 Vectastain 通用快速試劑盒(Vector Laboratories, Inc. ，Burlingamejn^H ) ° 概括地，用4%多聚甲醛的PBS於4°C固定過夜，然後用磷酸鹽緩衝液洗滌兩次。用馬血清封閉非特異性結合位點，此後應用胰島素Ab-6小鼠單克隆抗體(1 200 ；Lab Vision)和抗D-肽抗體(1 100 ；Linco Research，Inc.)培養細胞。根據製造商說明書，應用第二即用型通用抗體。DAB用作反應底物。用Zeiss倒置顯微鏡拍攝圖像。在對照細胞中，不存在胰島素的免疫染色。經分化後，觀察到有些FN-ESL新生細胞已聚集為細胞島。島中的細胞合成了在它們的細胞質中可看到的胰島素(在圖9C和9D中的棕色)。更長時間的誘導導致在大質量的細胞中胰島素信號積聚。這些數據表明，FN-ESL新生細胞具有此潛能而且確實分化為產生胰島素的細胞。實施例17-FN-ESL新生細胞分化為分泌胰島素的神經細胞用Zhang等以前所描述的方法Q001，Nat Biotechnol 19 :11四_33)實現從 FN-ESL新生細胞生成神經外胚層細胞。概括地，在聚集為EB後，分化的ESCl在FGF-2存在下形成大量的神經管樣(tube-like)結構。根據它們不同的粘附性分離並純化神經前體。 在用腦源神經營養因子(BDNF)置換FGF-2之後，細胞分化為神經元、星形細胞和少突細胞。 如前所述(aiang等，同上)，進行神經細胞的免疫組織化學染色。本實驗中所用的一抗包括抗巢蛋白(Chemicon，iTemecula,加州，1 750)和 β III-微管蛋白(Covance Research Products，伯克利市，加州，1 2000)多克隆抗體。應用適宜的螢光二抗，可看得到抗原(圖 9A和9B)。這些數據表明，ESL新生細胞能夠並且確實分化為神經細胞。實施例18-將人維爾姆斯氏腫瘤細胞系轉化為ESL新生細胞的方法為了說明人細胞轉化為新生細胞，應用上述的方法，用小鼠ESC的細胞核提取物體外再生人維爾姆斯氏腫瘤細胞系(WTCL)。培養已再生的細胞而且在胚胎纖維原細胞飼養細胞上進行篩選。在培養後，有些細胞開始聚集而且形成具有ESC形態的、小的新生細胞集落。小心地挑選細胞集落並接種於飼養細胞上。圖10A表示的是未變化的WTCL腫瘤細胞。 圖10B表示的是WT-ESL新生細胞集落。圖10C表示的是在飼養細胞上的WT-ESL芽；和圖IOD表示的是在飼養細胞上的WT-ESL新生細胞集落。這些結果表明，體外再生的方法能夠誘導人細胞細胞去分化為胚胎幹樣細胞。然後，應用上述的方法，能夠將這些WT-ESL新生細胞分化為各種細胞類型。在再生後，腫瘤細胞顯示很差的或者沒有產生腫瘤的能力，如所示的，在裸鼠中極少形成瓊脂膠集落和沒有腫瘤。這種再生誘導的去分化可提供一種開發腫瘤療法的突破性策略。實施例19- 一步再生和分化(OSRD)方案如上所述，首先將年老體細胞再生為多潛能新生細胞，隨後分化為其他細胞，如脂肪細胞、骨細胞、心肌細胞(cardiocytes)、骨骼肌和分泌胰島素的細胞。這些操作可耗時數月。為加速這個過程，我們將這兩個操作合併為簡單的一步方案(這裡稱作OSRD操作)， 將ESC細胞核提取物用作再生因子，而特異性細胞提取物用作分化誘導物。下面是一個以纖維原細胞開始而以骨骼肌結束的實例。用ESC的細胞核提取物和肌肉提取物同時地處理纖維原細胞。纖維原細胞小份(大約106個細胞)放入1. 5試管中。在50 μ L胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)處理而且用緩衝液T洗滌之後，將細胞重混懸於50 μ L含有ESC細胞核提取物和骨骼肌提取物的再生緩衝液(lng/mL BSA, ImM ATP, 5mM磷酸肌酸，25 μ g/mL肌酸激酶(Sigma)，2U核糖核酸酶抑制劑(RNasin) [Promega,麥迪遜市，威斯康星州]，100 μ M GTPdP ImM dNTP(核苷酸三磷酸鹽))。將細胞於37°C再生1小時。然後，將得到的細胞培養於倒置的液滴中，在補充了 20% FBS、lx抗生素(100U/mL青黴素和100 μ g/mL鏈黴素)、 ImM穀氨醯胺、非必需胺基酸、0. ImM β -巰基乙醇、4ng/mL bFGF、0. 12ng/mL TGF-βΙ和 10ng/mLLIF的KO-DMEM中。在第2天的上午，收集倒置的液滴且合併，然後將收集的細胞培養在明膠塗層的板上，在補充了 2%滅活馬血清和ImL鼠成肌細胞(C1C12)培養基的上清液(經0. 2 μ m過濾器過濾)的DMEM中。每天都改變培養基，共2_4天。用免疫螢光染色法檢驗分化過程中所形成的肌管。用顯微鏡照片成像法(photophotographs)和免疫組織化學染色法檢查骨骼肌的形成。經再生後，纖維原細胞在瓊脂糖凝膠長成小EB(圖11A)。在分化中，細胞聚集並融合為肌管(IlB)，而且合成骨骼肌特異性蛋白質(IlC)。這些數據表明，應用一步再生分化，可將纖維原細胞直接地再生並分化為骨骼肌。實施例20-端粒酶的再活化真生殖細胞和幹細胞含有一種取代端粒、被稱作端粒酶的酶，因而防止它們經受 Hayflick限度。在人的生殖細胞和大約85%癌細胞中，這種酶人端粒酶逆轉錄酶(h TERT) 和一種RNA模板足以產生新的端粒。為了確定上述的再生細胞是否與生殖和幹細胞一樣含有端粒酶，我們用TRAP檢驗法(Kim NW等，Science 1994266 :2011-15)檢測了端粒酶的活性。圖12表示的是未再生和已再生纖維原細胞的端粒酶產物。在泳道2和3中所顯示的，分別包括人皮膚JHl纖維原細胞和小鼠皮膚FNSK6纖維原細胞，未再生細胞不具有可檢測到的端粒酶產物。類似於泳道6中所示ESC的結果，兩種類型的已再生細胞產生端粒酶的產物(泳道4和幻，證明了細胞中的端粒酶活性。實施例21-體內再生組織或器官的方法上面所述的再生因子，包括細胞核提取物、胚胎幹細胞提取物、幹細胞、臍帶血幹細胞和新生細胞，同樣地可直接用於體內再生方法，以便於再生組織、器官和身體。這可以通過局部地應用再生因子系統性地或通過將再生因子注射至期望起效的部位而實現。這被概括於圖13中。作為一個體內再生的實例，我們在一名男性願者中試驗了除去皮膚色素沉著，該男子在其右手上有嚴重的、損傷引起的色素沉著區域。以細胞核提取物或ES細胞的細胞提取物局部地施用於皮膚，可再生皮膚(例如，減少色素沉著和皺紋)。首先用70%異丙醇消毒待再生的皮膚。然後，將一層胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)施用於該區域並保持10分鐘，無需乾燥。然後用0.9%鹽水溶液衝洗。將兩層全紗布海綿(ALL-Gauze-sponge)浸泡於用Ix再生緩衝液製備的人ESC提取物中，並且輕輕地施用於透性區域。為了防止蒸發， 用薄塑料覆蓋ES提取物浸泡的海綿，而且用適當的膠帶將塑料的邊緣密封到皮膚上。經過夜的再生後，用0. 9%鹽水溶液洗滌，而且對再生區域施以一薄層皮膚用乳液。重複這種操作每周一次或兩次，共2周，還可根據需要而重複。圖14A表示的是處理前色素沉著的皮膚區域(箭頭)。圖14B表示的是經2周治療後非常小的色素沉著區域。經再生後，皮膚變得光滑、有光澤且清新。經再生處理後，同樣色素沉著完全消失。患者未經歷不適。這些數據表明，體內再生組織是非常可行的。再生皮膚的另一種方法是在皮膚下皮下地注射細胞核提取物或ESC和幹細胞的細胞提取物，每周兩次。細胞核提取物中的因子再生皮膚細胞而且出去色素沉著和皺紋。再生皮膚的另外一種方法是在皮膚下皮下地注射ESC、幹細胞或臍帶血幹細胞。被注射的細胞在皮膚下繁殖並且分泌生長因子，該因子再生皮膚細胞和除去色素沉著及皺紋。 實施例22-再生全身的方法可將上述的再生因子系統性地遞送，以再生全身。再生因子包括，但不限於，細胞核提取物和源自ESC、幹細胞、臍帶血幹細胞以及新生細胞的細胞提取物。被培養的細胞，包括幹細胞、臍帶血幹細胞和新生細胞，同樣地可用於這個目的。為了再生身體，可將細胞核提取物和ESC、幹細胞、臍帶血幹細胞以及新生細胞的細胞提取物直接施用至人的身體，應用已知和規範的臨床方法，包括靜脈注射、皮下注射、肌內注射、鞘內注射、鼻噴霧、植入緩釋微球、局部應用等。將細胞核提取物或細胞提取物中的再生因子暴露於身體的每個組織和器官。同樣地，應用常規的方法，可施用細胞，包括ESC、幹細胞。臍帶血幹細胞和新生細胞。這些細胞在它們達到組織和器官後能夠存活和繁殖。局部地，它們將被分化並取代老化的細胞。在一項研究中，將再生試劑系統性地應用於再生動物。將老的無胸腺小鼠(nu+/ nu+, 2年齡)分為三組。第1組O只小鼠)經尾靜脈接受ESC提取物，ImL提取物/只小鼠，每周兩次共3周。第2組(2隻小鼠)經靜脈接受PBS對照溶液。第3組O只小鼠)經尾靜脈接受GN-ESL (在ImL中約107個)，每周兩次共3周。每兩天記錄食物消耗和體重。 用攝像機記錄動物的活動。圖15A和15C表示的是PBS-對照年老小鼠。圖15B表示的是應ESC提取物再生的小鼠。圖15D表示的是用新生細胞再生的小鼠。經過處理3周後，在所有檢測的變量包括體重、食物消耗、外觀和活動中，對照組沒有經歷顯著性變化。但是，用ESC提取物或用 FN-ESL新生細胞處理的小鼠消耗更多的食物，儘管在體重方面沒有顯著性差異。同時，被再生的小鼠比對照小鼠在體質方面更活躍和精力更充沛。最有趣的是，被再生小鼠的更細紋的皮膚顯得比對照小鼠更平滑、更厚和更健康。這些數據儘管是初步的，但是揭示了，由 ESC提取物或FN-ESL新生細胞的再生改善了年老動物的生活。這些體內再生方法可用於增強免疫功能，改善全身的健康，提高運動的能力，有助疾病和癱瘓的康復，延長人的壽命，改正CNS系統的先天性缺陷，修復被創傷或年老的器官 (例如，心臟，腎臟，肝臟和大腦)，將老化的白髮轉變為年輕的黑髮，減少皮膚的皺紋和色素沉著，和治療神經退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化症(Lou Gehrig病)以及中風。實施例23-用兩步體外細胞重編程將體細胞再生為多潛能胚胎幹樣(ESL)細胞1.構建預編程載體。如在我們的小鼠體細胞重編程研究中，我們將三種人ES細胞轉錄因子(0ct4，Sox2 JPNanog)克隆至哺乳動物表達載體(pEGFP_N3，Clontech，Palo Alto，加州)中。應用從人ES細胞系H7(NIH編號WA07)製備的cDNA，PCR擴增轉錄因子。 用限制性酶(Nhel，Bgl2和EcoRl)酶切全長cDNA產物並且克隆至pEGFP N3載體中(圖 16)。在兩個啟動子(分別是pCMV和pTK)控制下表達這些轉錄因子，而且用內部核糖體進入位點(IREQ和轉錄終止多聚A信號(BGH-pA和SV40-pA)將其分開。最後的編程載體 (pES)具有三種轉錄因子和串聯次序為 pCMV-0ct4-IRES-Sox2-BGH P A-pTK-Nanog-IRES-E GFP-SV40pA(圖16)。用CMV啟動子(pCMV)轉錄0ct4和Sox2，而用TK啟動子(pTK)驅動 Nanog和EFGP。用EGFP示蹤表達載體蛋白的細胞。2.用ES細胞轉錄因子預編程人纖維原細胞.將四種細胞系(HFB1，JHFl，HSFljP HBS1)保持於補充了 10%胎牛血清和100U/ml青黴素和100 μ g/ml鏈黴素的DMEM培養基 anvitrogen，Carlskid，加州)中，而且生長於37°C、5% C02條件下。根據製造商的手冊， 用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)包封的預編程pES載體DNAG μ g)瞬時轉染指數生長期的細胞 0x105)。在轉染後七十二小時，用 FACS (FACSVantage SE,Becton Dickinson) 分選表達載體蛋白的細胞，並接種於新的6孔板中。匯合後，收集細胞，並用於下述第二步重編程。3.用ES細胞核提取物表觀遺傳地重編程預編程的細胞。經過用三種ES轉錄因子預編程後，用ES細胞提取物處理細胞以全部恢復纖維原細胞基因組的表觀基因型。應用如上所述的方法(Tian等，DNA Repair (Amst), 2002,1 1039-49)，從人H7ES細胞系中提取胚胎幹細胞的細胞核提取物。細胞用500ng/ml鏈球菌溶血素(Sigma，聖路易斯市，密蘇裡州)進行膜透化(Taranger CK, Noer A, Sorensen AL, Hakelien AM, Boquest AC, Collas P.Induction of dedifferentiation, genomewide transcriptional programming, and epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma and embryonic stem cells (「用癌和胚胎幹細胞的提取物誘導去分化，基因組轉錄編程，以及表觀遺傳重編程」).Mol Biol Cell 2005 ； 16 :5719-5735 ;Hansis 等，Curr Biol 2004，14 1475-1480)，然後混懸於 10 μ 1 轉運緩衝液(20mM HEPES，pH 7. 3, IlOmMKAc, 5mM NaAc, 2mM MgAc2, ImM EGTA, 2mM DTT，各自 1 μ g/ml的抑肽酶、胃蛋白酶抑制劑A和亮肽素)。然後，通過加入在重編程緩衝液Omg/ml BSA, 2mM ATP，IOmM磷酸肌酸，40U/ml 肌酸激酶，和 20U/ml RNASE OUT(Invitrogen))中製備的ΙΟμΙ H7ES細胞提取物，於37°C將膜-透化的細胞重編程1小時。在細胞重編程後，用 2mM CaC12密封細胞膜，通過加入補充了 10% FBS、lx抗生素(100U/ml的青黴素和100 μ g/ ml的鏈黴素)、lmM穀氨醯胺、1 %非必需胺基酸、0. ImM β -巰基乙醇、4ng/ml鹼性纖維原細胞生長因子(bFGF)以及 0. 12ng/ml TGF-β 1 的 500 μ 1 K0-DMEM 培養基(Invitrogen)而
停止反應。4.完全重編程細胞的篩選.通過將以上處理的細胞懸於培養皿蓋上的液滴 (20 μ 1)中，篩選完全重編程的細胞。在懸滴中，完全重編程的細胞以簇的形式而聚集， 而且附著於培養皿的蓋子，未重編程的細胞則以單獨的細胞而留於培養基中。從培養皿的蓋子上收集成簇的重編程細胞，然後培養在飼養細胞上、在補充了生長因子的KO-DMEM 中。那些完全重編程的細胞的細胞形態進一步變得接近ES細胞，而且在飼養細胞上形成典型ESL細胞克隆。收集ESL細胞克隆並在不含飼養細胞的mTeSRl培養基中擴增，如 Ludwig 等所描述(Ludwig TE, Bergendahl V, Levenstein ME, Yu J, Probasco MD, Thomson JA. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods2006 ；3 637-646.)。5.完全重編程的ESL細胞是多潛能性的。早期，我們在試驗中說明了在源自飼養的雄性阿爾及利亞小鼠(M. Spretus)和雌性C57B/c的小鼠纖維原細胞細胞系FSK6中檢驗這種重編程的方法(Hu等，1996，J Biol Chem 271:18253-62)。在條件培養基中篩選後， 我們成功地將FSK6纖維原細胞轉化為顯示相同於ES細胞形態的ESL細胞。重編程細胞表達ES特異性生物標誌物(0ct4，Ndp52Ll，和DppU)而且具有已活化端粒酶的活性(圖5)。 在這種情況下，這些ESL細胞(示於圖17B和17C)也是多潛能性的，如分化為多種其他細胞類型中所示的。這些數據已證明了這樣的觀點用我們的體外重編程方案能有效地重編程體細胞。本發明以示例說明的方式得到了描述，應當理解為，所用的術語是描述而非限制的性質。顯然，根據上述的教導，本發明的修飾和變更是可能的，而且，本領域的普通技術人員可以根據這種教導提出不脫離或者超出本發明權利要求範圍的另外的實施方案和改進。 因此，應當理解為，在所附權利要求範圍內，本發明可以以不同於特別描述的方式實施。相應地，應當理解為，這裡的附圖和說明書是以實施例的方式而提供的，目的是有助於理解本發明，而不應當解釋為限制本發明的範圍。
權利要求
1.一種通過mRNA誘導體細胞為多能幹細胞的方法，該方法包括a.從多潛能細胞中提取mRNA；b.將所述mRNA包封於至少一種脂質體遞送劑中；c.將體細胞暴露於所述mRNA脂質體；d.在板或者未塗層培養皿的蓋上倒置懸滴培養經暴露的體細胞，持續足以加速細胞聚集的時間；e.在稀釋的瓊脂糖凝膠上或者在未塗層的培養皿中混懸培養已聚集的細胞以形成EB ；f.在飼養細胞頂部上或者在塗層板和皿上或者在補充了生長因子的適宜培養基的基質膠上培養EB樣細胞；以及g.選擇具有幹細胞形態的細胞集落，籍此將所述體細胞去分化為多潛能細胞，用於細胞療法和化妝品應用。
2.如權利要求1所述的方法，其中，步驟a的多潛能細胞是胚胎幹細胞(ESC)、原始生殖細胞(PGC)、胎兒細胞、卵、受精卵、臍帶血幹細胞、組織幹細胞、小鼠胚泡細胞或者其組口 O
3.如權利要求1所述的方法，其中，步驟d中充足的時間約為兩小時至過夜。
4.如權利要求1所述的方法，其中，步驟b和c用電穿孔所述體細胞以轉染來自多潛能細胞的mRNA所替代。
5.如權利要求4所述的方法，其中，電穿孔所述體細胞的步驟用通過病毒來病毒介導所述mRNA進入所述體細胞所替代。
全文摘要
本發明公開了一種通過mRNA誘導體細胞為多能幹細胞的方法，該方法包括從小鼠ESC提取mRNA；將所述mRNA包封於至少一種脂質體遞送劑中；將體細胞暴露於所述mRNA脂質體；在板或者未塗層培養皿的蓋上倒置懸滴培養經暴露的體細胞，持續足以加速細胞聚集的時間；在稀釋的瓊脂糖凝膠上或者在未塗層的培養皿中混懸培養已聚集的細胞以形成EB；在飼養細胞頂部上或者在塗層板和皿上或者在補充了生長因子的適宜培養基的基質膠上培養EB樣細胞；以及選擇具有幹細胞形態的細胞集落，籍此將所述體細胞去分化為多潛能細胞，用於細胞療法和化妝品應用。
文檔編號C12N5/074GK102329779SQ20111024325
公開日2012年1月25日 申請日期2006年10月16日 優先權日2005年10月14日
發明者姜舒, 李陶, 胡祥, 胡繼繁 申請人:深圳市北科生物科技有限公司, 胡繼繁