一種秸稈酚酸類化合物的檢測方法
2023-04-29 12:58:41 4
一種秸稈酚酸類化合物的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及農業領域，特別是涉及秸稈的利用領域，更為具體的說是涉及一種秸稈酚酸類化合物的檢測方法。針對不同來源的秸稈中主要的酚酸類物質沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸，公開了一種一次性可以較全面分離檢測的反向高效液相色譜檢測法，所公開的檢測方法12種酚酸保留時間和峰面積的RSD分別在0.02~0.1%和0.25~2.26%之間，重現性良好，最低檢出限在0.005~0.01μg·ml-1之間，方法可靠、有效。
【專利說明】一種秸稈酚酸類化合物的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業領域，特別是涉及秸杆的利用領域，更為具體的說是涉及一種秸 杆酚酸類化合物的檢測方法。
[0002]
【背景技術】
[0003] 秸杆是成熟農作物莖葉(穗）部分的總稱。通常指小麥、水稻、玉米、薯類、油料、棉 花、甘蔗和其它農作物(通常為粗糧）在收穫籽實後的剩餘部分。農作物光合作用的產物有 一半以上存在於秸杆中，秸杆富含氮、磷、鉀、鈣、鎂和有機質等，是一種具有多用途的可再 生的生物資源。
[0004] 秸杆還田作為一項有效的秸杆處置措施被廣泛採用，報導中大多肯定其良好的環 境與生態效應，但其所產生的負面效應，如對作物發芽、出苗及根產生的抑制作用在農林生 態系統中普遍存在，且大多數均有化感效應。
[0005] 關於秸杆的化感效應目前已經受到業界的關注，譬如在全國植物化學控制與化感 作用交流研討會中周婷婷、朱麗君等關於秸杆還田的化感效應概述中所做的闡述。其在結 語中指出秸杆還田化感效應對下荏作物的影響，對於避免秸杆的化感負效應，充分合理地 利用秸杆資源，提高農作物產量有重要的實際意義。
[0006] 酚酸類是秸杆化感作用中的主要物質，準確確定不同還田條件下土壤和秸杆中的 酚酸物質含量有助於正確評估酚酸物質在秸杆化感效應中的作用。
[0007] 但是不同植物殘體化感作用中的酚酸種類各不相同，如大豆根系分泌物和植株水 浸液中有香草酸、香草醛和對羥基苯甲酸等，柑橘園主要為高香草酸，向日葵秸杆中主要為 綠原酸，稻草、鋸木屑、豬糞腐解釋放對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸、阿魏酸，小麥秸杆中有 阿魏酸、對羥基苯甲酸和苯甲酸。
[0008] 因此，找到一種適用於不同來源秸杆的酚酸類化合物，一次性較全面覆蓋的檢測 方法對於指導秸杆還田技術和指導秸杆還田工作來說，具有重要的意義。
[0009]
【發明內容】
[0010] 本申請的發明人分別針對不同來源的秸杆分別單獨進行酚酸類化合物的研究，發 現目前常見來源的秸杆中主要的酚酸類物質包括12種，分別為沒食子酸、原兒茶酸、龍膽 酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸。
[0011] 在上述研究的基礎上，我們公開一種秸杆酚酸類化合物的檢測方法，包括以下步 驟： 一、將秸杆粉碎後，在室溫條件下用:Tio倍體積的水浸提，將水浸提液通過預先活化 處理的WatersHLB固相萃取小柱，然後用甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發儀濃縮至無 溶劑後，加入甲醇溶解並定容至2ml，有機濾膜過濾後，作為待檢測樣品液備用； 其中優選的方式是，採用少量多次的方式用甲醇溶液洗脫； 其中有機濾膜過濾的優選方式是採用0. 45ym針頭式過濾器過濾； 二、 將步驟一中得到的待檢測樣品液注入反相高效液相色譜儀，以含0. 5%乙酸的乙腈 和含0. 5%乙酸的：水溶液為流動相進行梯度洗脫，所述的梯度洗脫過程為(T25min乙腈 5%?20%，25?26min乙腈 20%?5%，26?28min乙腈 5%?5%， 所述高效液相色譜儀的色譜條件為： 色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的C18色譜柱，規格為4.6謹\250謹父5111]1，柱溫為30°(1|，流速為11]11*1]1；[]^ 1，樣品進樣量為5111，監測儀為二極 管陣列檢測器，檢測波長260nm、270nm、310nm和325nm; 三、 通過外標法完成待測樣品中酚酸類化合物的定性、定量檢測。
[0012] 其中，外標法中定性的檢測方法為，準確稱取上述12種酚酸(沒食子酸、原兒茶 酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水 楊酸)標準品各25mg，分別置於25mL容量瓶中，加入甲醇溶解，並定容，得到一組濃度均為 1mg?mr1的標準溶液，將標準溶液分別與未添加標準溶液的待測樣品液混合注入反相高 效液相色譜儀，採用步驟二中的色譜條件，分別得到12個光譜圖，將12個光譜圖分別與未 添加標準溶液的待測樣品液色譜圖進行比對，將吸光度明顯增大的峰認定為該酚酸的峰， 並標識出峰時間，逐一確認12種酚酸的相應出峰時間。
[0013]其中，外標法中定量的檢測方法具體為，準確稱取上述12種酚酸(沒食子酸、原兒 茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、 水楊酸）標準品各25mg，全部置於一個25ml容量瓶中，加甲醇溶解，並定容，得到濃度均 為lmg?mr1的12種酚酸的混合標準液；將上述1mg?mr1的混合標準液用甲醇溶液逐 級稀釋，得到一系列濃度已知的混合標準溶液，分別進樣5yL，記錄對應峰面積；以各濃度 X(呢mr1)為橫坐標，峰面積值Y(mAU)為縱坐標繪製標準曲線，得到12種酚酸物質的線 性回歸方程、相關係數及線性範圍。
[0014]本發明人米用的是濃度分別為500Mg? ?ml'lOOMg?ml'SOMg? ml'lOMg* ml'lMg.mr1 的系列混合標準溶液。
[0015]步驟一中，WatersHLB固相萃取小柱的活化處理方式為：先用甲醇衝洗固相小柱 2次，再用純水衝洗固相小柱2次，保證固相小柱在上樣前填料為溼潤狀態。
[0016]本發明中採用了固相萃取小柱，從而可以富集水提液中的酚酸化合物，使得後續 檢測數據更加準確、可靠。同時，無需利用大量化學試劑從水提液中萃取，對環境友好，且大 大節約了樣品處理時間，樣品處理效率高。經過試驗，我們發現本發明所公開的樣品處理方 式對於酚酸類物質提取全面，提取效率高。
[0017]同時，本發明所公開的反向高效液相色譜法分離度高、峰形好。且本發明所公開的 檢測方法12種酚酸保留時間和峰面積的RSD分別在0. 02、. 1%和0. 25?2. 26%之間，重現 性良好，最低檢出限在0. 005~0. Olug?mr1之間，方法可靠、有效。
[0018]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為含12種酚酸的標準溶液色譜圖； 圖2為樣品檢測色譜圖。
[0020]
【具體實施方式】
[0021] 實施例1 準確稱取12種酚酸(沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖 啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸）標準品各25mg，全部置於一個25ml容 量瓶中，加甲醇溶解，並定容，得到濃度均為lmg?mr1的12種酚酸的混合標準液。
[0022] 將混合標準液稀釋10倍後(濃度在100Ug?mr1)，注入反相高效液相色譜儀，以 含0. 5%乙酸的乙腈和含0. 5%乙酸的水溶液為流動相進行梯度洗脫，所述的梯度洗脫過 程為0?25min乙腈5%?20%，25?26min乙腈20%?5%，26?28min乙腈5%?5%，高效液相色譜儀 為AgilentHPLC1200,真空在線脫氣機G1322A，四元泵G1311A，柱溫箱為G1329A，色譜 柱為安捷倫EclipseXDB-C18 (4.6mmX250mm，粒徑5Mm)，保護柱為安捷倫XDBC18小柱 (4. 6mmX12. 5mm，粒徑5Mm)，安捷倫標準自動進樣器G1329A，安捷倫DAD檢測器G1315D，化 學工作站為ChemStationB04. 02。
[0023]所述高效液相色譜儀的色譜條件為： 色譜柱：柱溫為30°C，流速為1ml 樣品進樣量為5iU，監測儀為二極體陣列檢 測器，得到的色譜圖如圖1所示。
[0024] 實施例2 準確稱取上述12種酚酸(沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草 酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸）標準品各25mg，分別置於25mL容 量瓶中，加入甲醇溶解，並定容，得到一組濃度均為1mg?mr1的標準溶液，將標準溶液分 別與未添加標準溶液的待測樣品液混合注入反相高效液相色譜儀，採用實施例1中的色譜 條件，分別得到12個光譜圖，將12個光譜圖分別與未添加標準溶液的待測樣品液色譜圖進 行比對，將吸光度明顯增大的峰認定為該酚酸的峰，並標識出峰時間，逐一確認12種酚酸 的相應出峰時間。結果如表1 : 表1 :
【權利要求】
1. 一種秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，包括以下步驟： 將待檢測樣品液注入反相高效液相色譜儀，以含0. 5%乙酸的乙腈和含0. 5%乙酸的水 溶液為流動相進行梯度洗脫，所述的梯度洗脫過程為(T25min乙腈5%?20%，25?26min乙腈 20%?5%，26?28min 乙腈 5%?5%。
2. 所述高效液相色譜儀的色譜條件為： 色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑的C18色譜柱，規格為 4.6謹\250謹父5111]1，柱溫為30°(1|，流速為11]11*1]1；[]^1，樣品進樣量為5111，監測儀為二極 管陣列檢測器，檢測波長260nm、270nm、310nm和325nm ; 通過外標法完成待測樣品中酚酸類化合物的定性、定量檢測。
3. 根據權利要求1所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，還包括有樣品處 理步驟： 將秸杆粉碎後，在室溫條件下用:Tio倍體積的水浸提，將水浸提液通過預先活化處理 的Waters HLB固相萃取小柱，然後用甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，然後用旋轉蒸發儀濃縮至 無溶劑後，加入甲醇溶解並定容至2ml，有機濾膜過濾後，作為待檢測樣品液備用； 根據權利要求2所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，採用少量多次的方 式用甲醇溶液洗脫。
4. 根據權利要求1所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，有機濾膜過濾的 方式是採用〇. 45 ii m針頭式過濾器過濾。
5. 根據權利要求1所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，外標法中定性的 檢測方法為，準確稱取沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡 酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸標準品各25 mg，分別置於25ml容量瓶中，力口 入甲醇溶解，並定容，得到一組濃度均為1 mg ?mr1的標準溶液，將標準溶液分別與未添 加標準溶液的待測樣品液混合注入反相高效液相色譜儀，採用權利要求1中所述的色譜條 件，分別得到12個光譜圖，將12個光譜圖分別與未添加標準溶液的待測樣品液色譜圖進行 比對，將吸光度明顯增大的峰認定為該酚酸的峰，並標識出峰時間，逐一確認12種酚酸的 相應出峰時間。
6. 根據權利要求1所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，外標法中定量的 檢測方法具體為，準確稱取沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖 啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸標準品各25 mg，全部置於一個25 ml容量 瓶中，加甲醇溶解，並定容，得到濃度均為lmg ? mr1的12種酚酸的混合標準液；將上述1 mg ? mr1的混合標準液用甲醇溶液逐級稀釋，得到一系列濃度已知的混合標準溶液，分別 進樣5 y L，記錄對應峰面積；以各濃度X (呢? mr1)為橫坐標，峰面積值Y (mAU)為縱坐標 繪製標準曲線，得到12種酚酸物質的線性回歸方程、相關係數及線性範圍。
7. 根據權利要求5所述的秸杆粉酸類化合物的檢測方法，其特徵是，所述一系列濃度 已知的混合標準溶液的濃度梯度為500Mg ? 1111'250呢?ml'lOOMg ?ml'SOMg ? 1111'20呢 ?mF^lOM-g* mF^SM-g ? mF\lM-g ? mF1,,
8. 根據權利要求1所述的秸杆酚酸類化合物的檢測方法，其特徵是，所述Waters HLB 固相萃取小柱的活化處理方式為：先用甲醇衝洗固相小柱2次，再用純水衝洗固相小柱2 次，保證固相小柱在上樣前填料為溼潤狀態。
【文檔編號】G01N30/02GK104458948SQ201410730938
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】於建光, 楊四軍, 常志州, 顧東祥, 石祖梁, 張傳輝, 張斯梅, 顧克軍, 許博, 張恆敢 申請人:江蘇省農業科學院