基於n1l和b8r基因缺失的痘苗病毒載體的愛滋病疫苗的製作方法
2023-04-29 14:21:56 1
專利名稱：基於n1l和b8r基因缺失的痘苗病毒載體的愛滋病疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗病毒免疫學領域。更具體地，本發明涉及一種複製型痘 苗病毒載體、基於所述載體的重組愛滋病疫苗、及所述疫苗的製備方法和 用途。
背景技術：
獲得性免疫缺陷症候群(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS) 簡稱愛滋病，是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)
感染引起的一種傳染性疾病。自1981年發現第一例病例以來，愛滋病一直 以驚人的速度在全球蔓延，成為世界上危害人類生命和健康最嚴重的病毒 性疾病之一。
HIV的全球流行導致了極高的致病率和病死率，為防治HIV的感染， 傳統的化學藥物治療、免疫治療以及新的方法得以不斷研究、發展。對多 數HIV感染者進行高活性抗病毒治療(HAART)，雖可有效抑制病毒血症， 延緩病程，但不能清除潛伏的病毒。保護性的疫苗接種是解決防治HIV感 染全球性問題的最佳途徑。為此，科學家們幵展了減毒活疫苗、滅活疫苗、 重組亞單位疫苗、DNA疫苗以及各種活載體疫苗(例如以腺病毒、金絲雀 痘病毒、流感病毒、痘苗病毒、狂犬病毒、皰疹性口腔炎病毒、傷寒桿菌、 鏈球菌等為載體的疫苗)的研究。雖然減毒活疫苗在猴免疫缺陷病毒(SIV) 感染模型中被證實有效，但在初次免疫成年獼猴中存在一定致死率。被HIV 感染的猩猩仍可被第二種不相關的HIV感染。由於減毒活疫苗的風險性以 及有證據表明其無廣泛保護性，減毒活疫苗的應用尚待進一步研究。研究 表明，在猩猩模型中，滅活疫苗不能保護HIV攻擊，不能誘導細胞毒性T 淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte, CTL)反應。病毒活載體疫苗和DNA疫 苗都既可以誘導細胞免疫反應，又可以誘導體液免疫反應，表達HIV抗原 的活載體疫苗和HIV DNA疫苗的聯合免疫成為防治HIV感染的新的疫苗 研究策略。
3在活載體疫苗的研究中，以痘苗病毒(例如，痘苗病毒天壇株(vaccinia virus TianTan strain，VTT))為載體的活載體疫苗研究進行得最為深入和廣 泛。重組痘苗病毒疫苗具有效果好、對熱穩定性好、接種方便、不需佐劑 等優點，然而重組痘苗病毒疫苗接種人體後產生較重的局部反應，特別是 在一定比例的免疫缺陷患者中可引起嚴重的併發症。表達某些免疫原的重 組痘苗病毒疫苗未能達到理想的免疫效果，如何能在增強重組痘苗病毒疫 苗的免疫原性同時進一步提高痘苗病毒載體的安全性，學者們作出了很多 深入的研究。隨著新的病毒性疾病不斷出現，以及對宿主抗病毒免疫機理 的深入了解，構建表達同一病原多種抗原、不同病原多種抗原的多價重組 痘苗病毒載體，以及在重組痘苗病毒載體中尋找更多穩定有效的外源基因 插入區意義重大。
發明內容
本發明提供了針對HIV感染的新的疫苗，其中該疫苗採用複製型痘苗 病毒為載體構建。本發明還提供了應用本發明的疫苗的免疫接種方案。
本發明提供了一種表達HIV抗原的減毒愛滋病疫苗，其包含複製型痘 苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的TK區插入了至少一種編碼 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因組的NIL基因和B8R基因同時 缺失。
本發明的愛滋病疫苗中，所述複製型痘苗病毒例如是痘苗病毒天壇株。 優選地，在本發明的愛滋病疫苗中，所述至少一種編碼HIV抗原的多 核苷酸來源於中國HIV主要流行毒株B7C型CN54株。可用於構建本發 明的愛滋病疫苗的HIV抗原選自gag、 pol和env中的一或多種。在一個優 選的實施方式中，可以將gag、 pol和env同時插入本發明的愛滋病疫苗。 本發明的愛滋病疫苗還可包含藥用可接受的佐劑、載體和/或賦形劑。 本發明還提供了一種愛滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個成份和 指示免疫程序的說明書，其中 一個成份為本發明的上述愛滋病疫苗。
本發明還提供了愛滋病疫苗病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ，其於2008 年4月2日，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北 京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏號CGMCC2431。
本發明還提供了轉移質粒pSKNlLLacZ，包含其的大腸桿菌(&c^^/w'a co//)於2008年4月2日，保藏於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號CGMCC2432。
此外，本發明還提供了轉移質粒pSKNlL，其構建圖譜如圖17中所示。
圖1A-圖1D:顯示VTTDNA、 N1LL片段、N1LR片段、N1LLR片段、 pE/L+p7.5+下遊LacZ片段PCR擴增結果。泳道1、 8、 ll為DNA分子量 標記DL15000 (Takara公司)；泳道2、 5為DNA分子量標記DL2000 (Takara 公司)；泳道3、 4為VTTDNA;泳道6為N1LL片段；泳道7為N1LR片 段；泳道9為N1LLR片段；泳道10為pE/L+p7.5+LacZ片段。
圖2A和圖2B:顯示質粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ酶切分析結果。泳 道1 、4為DNA分子量標記DL15000 (Takara公司)；泳道2為pSKNlL/Bg/II; 泳道3為pSKNlL/尺; "I ; 泳道5為pSKNlLLacZ ; 泳道6為 pSKNlLLacZ/K;wI;泳道7為pSKNlLLacZASa/1。
圖3A-圖3C:顯示PCR擴增檢測N1L、 B8R基因同時缺失的重組病 毒VTKgpeAB8RANlLLacZ的結果。泳道1、 6為DNA分子量標記DL2000 (Takara公司)；泳道4為DNA分子量標記DL15000 (Takara公司)；泳道2 為VTKgpe擴增產物(引物SEQ ID NO.: 7和8);泳道3為 VTKgpeAB8RANlLLacZ擴增產物(引物SEQ ID NO.: 7禾卩8);泳道5為 VTKgpe八B8RANlLLacZ擴增產物(引物SEQ ID NO.: 1禾n 4);泳道7為 VTKgpe擴增產物(引物SEQ ID NO.: 1和4)。
圖4:顯示PCR擴增檢測重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的fflV-1 外源基因的結果。泳道1為DNA分子量標記DL15000 (Takara公司)；泳道 5為DNA分子量標記DL2000 (Takara公司)；泳道2為 VTKgpeAB8RANlLLacZ擴增產物(引物SEQ ID NO.: 9和10);泳道4 為VTT擴增產物(引物SEQ ID NO.: 9和10)。
圖5:顯示Western blot檢測重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ中的外 源基因穩定表達結果。泳道1為CEF細胞；泳道2為預染蛋白質分子量標 記(BENCHMARK Prestained protein Ladder);泳道3為VTT感染的CEF 細胞；泳道4為VTKgpe感染的CEF細胞；泳道5為VTKgpeAB8RANlLLacZ 感染的CEF細胞。圖6A-圖6D:顯示重組病毒VTKgpeAB8RANlLLacZ分別在CEF、 TIC143、 Vero、 BHK細胞中生長曲線測定結果。
圖7:顯示重組病毒在小鼠足墊局部增殖檢測結果。 圖8:顯示重組病毒的家兔皮內毒力實驗結果。 圖9:顯示重組病毒的乳鼠腦內毒力實驗結果。
圖10:顯示免疫小鼠脾細胞胞內IFN-Y染色流式細胞儀分析結果。 圖11:顯示免疫小鼠脾細胞胞內IL-2染色流式細胞儀分析結果。
圖12:顯示Elispot檢測小鼠抗-mVenvT細胞產生IFN-Y的結果。 圖13:顯示Elispot檢測小鼠抗-HIV gag T細胞產生IFN々的結果。
圖14:顯示Elispot檢測小鼠抗-HIVpolT細胞產生IFN-Y的結果。 圖15:顯示各免疫組gag特異性IgG抗體滴度結果。 圖16:顯示各免疫組gpl20特異性IgG抗體滴度結果。 圖17:顯示轉移質粒pSKNlL、 pSKNlLLacZ構建示意圖。
具體實施例方式
本發明提供了一種表達HIV抗原的減毒愛滋病疫苗，其包含複製型痘 苗病毒作為載體，其中所述痘苗病毒基因組的TK區插入了至少一種編碼 HIV抗原的多核苷酸，且所述痘苗病毒基因組的NIL基因和B8R基因同時 缺失。
在一個優選的實施方式中，在本發明的愛滋病疫苗中作為載體的是痘 苗病毒天壇株。
在一個優選的實施方式中，用於構建本發明的愛滋病疫苗的編碼HIV 抗原的多核苷酸來源於中國HIV主要流行毒株B7C型CN54株。
在另一個優選的實施方式中，可用於構建本發明的愛滋病疫苗的HIV 抗原選自gag、 pol和env中的一或多種。在一個更優選的實施方式中，可 以將gag、 pol和eiw同時插入本發明的愛滋病疫苗。
在一個優選的實施方式中，本發明的愛滋病疫苗還可包含藥用可接受 的佐劑、載體和/或賦形劑。合適的佐劑、載體和賦形劑是本領域中所己知 的。
本發明還提供了一種愛滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個成份和 指示免疫程序的說明書，其中一個成份為本發明的愛滋病疫苗。在一個優選的實施方式中，在母本毒株VTKgpeAB8R (中國專利申請
發明者穎 劉, 劉明傑, 邵一鳴, 薇 黃 申請人:中國疾病預防控制中心性病愛滋病預防控制中心