一種去除總RNA樣品中核糖體核酸rRNA的方法和組合物與流程

2023-04-29 18:27:42 2

本發明涉及用於一種去除總RNA樣品中核糖體核酸rRNA的方法、組合物和試劑盒。

背景技術：

由於rRNA豐度含量非常高，佔總RNA量的80％～95％，它的存在會使得樣本中其他相關RNA分子的各類分析複雜化。由rRNA所引起的諸多問題是對片段化的相關RNA分子進行分析的難題。例如轉錄組晶片分析和轉錄組測序，都會產生很大一部分冗餘數據，造成很大的浪費。如果能高效去除rRNA能極大提高數據的有效利用率。特別是在非3』Poly A尾RNA和非編碼RNA的分析上，必須去除rRNA，否則這些基因的數據可利用率十分差。

目前，在樣品總RNA中去除rRNA技術原理基本都是基於帶有鏈親黴素基團的磁珠結合rRNA-DNA探針(生物素基團標記)複合物，用於從相關的非rRNA的RNA分子去除rRNA(如Ingolia等人的方法，Science324：218-23，2009)的效果。現有的商品試劑盒，如Ribo-Zero gold(Epicentre)，Ribo-MinusTM(Thermo Fisher Scientific)，它們雖然都能去除大部分rRNA，但是基於磁珠的去除方法成本比較高，而且去除效果也不理想，特別對於小rRNA，如5S和5.8S rRNA，去除效率都不高於80％，這些殘留的rRNA往往在分析中也會佔據大量數據容量，造成極大浪費。其次上述方法對於樣品總RNA質量要求高，若樣品總RNA有輕微降解，rRNA去除效果會受極大影響。因此，需要對現有去除rRNA技術進行改進，以實現高效且費用低的去除rRNA。

技術實現要素：

可以理解，本文所用術語的目的僅僅在於描述具體的實施方式，而非進行限制。進一步的，除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員所普遍理解的相同的含義。將根據下文闡述的定義，使用如下術語和語法變體以描述和要求保護本發明。

本發明涉及一種去除總RNA樣品中核糖體核酸rRNA的方法，所述方法包含:

a)提供包含衍生自至少一種真核生物體或者物種的RNA分子的初始樣本，其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNA的RNA分子；

b)針對真核生物體或者物種的rRNA的全長序列每50bp設計一個與rRNA序列反向互補配對的DNA探針；

c)在一定條件下使所述初始樣本接觸所述包含所述DNA探針的組合物，以便至少部分所述DNA探針和rRNA分子雜交形成DNA:RNA雜交雙鏈，從而生成處理後的樣本；

d)在一定條件下使所述處理後的樣本接觸RNase H酶，特異性消化所述DNA：RNA雜交雙鏈，從而生成rRNA除盡的樣本，其中所述rRNA除盡的樣本包含存在於所述初始樣本中的所述非rRNA的RNA分子的至少部分並大體上除盡或者不含rRNA分子；

e)在一定條件下使所述rRNA除盡的樣本接觸DNase混合酶去除樣品中痕量DNA和/或降解剩餘DNA探針混合物，終止反應；

f)純化，獲得樣品RNA。

在本發明的一個實施例中，至少一種真核生物體或者物種選自人類、動物、植物以及真菌生物體或者物種。

優選的，所述rRNA除盡了樣本中的99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％的rRNA分子。

在本發明的一個實施例中，所述rRNA分子包括5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA，25SrRNA分子，26SrRNA，23S rRNA，12S rRNA 和16S rRNA組成的組中的一種或多種。

在本發明的一個實施例中，初始樣本中的所述RNA分子包含提取、分離或者純化自選自如下的來源的RNA：組織樣本、細胞樣本、石蠟包埋的樣本、石蠟包埋福馬林固定的樣本和由土壤、水、生長培養基或者生物流體或者標本組成的環境樣本。

優選的，步驟b)中DNA探針長度範圍為：30bp至100bp，優選長度為48bp、49bp或50bp。

更優選的，步驟c)所述DNA探針和rRNA分子雜交形成DNA:RNA雜交雙鏈的方法為，將初始樣本與DNA探針混合，加入Tris-Hcl和KCl組成的pH7.5的反應試劑和無RNA酶滅菌水，將上述混合溶液在PCR儀器上進行雜交反應；優選的，初始樣本中總RNA與DNA探針的用量比例為1:1至1:10。

在本發明的一個實施例中，步驟e)中DNase混合酶為DNaseI和Exonuclease I以等比例混合而成。

同時，本發明還涉及一種DNA探針組合物：針對真核生物體或者物種的5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA，25SrRNA分子，26SrRNA，23S rRNA，12S rRNA和16S rRNA組成的組中的一種或多種的全長序列每50bp設計一個與rRNA序列反向互補配對的DNA探針，DNA探針長度範圍為30bp至100bp，優選長度為48bp、49bp或50bp。

本發明還涉及一種包括DNA探針組合物的試劑盒。

當術語「例如」、「如」、「包括」、「包含」或者其變體用於本文時，這些術語將不被視為限制性術語，而將被詮釋為「但不僅限於」或者「無限制性」。

在某些實施方式中，所述DNA探針與顯示rRNA分子的序列的至少95％，96％，97％，98％，99.0％，99.3％，99.5％，99.9％或者100％進行特異性雜交。

如本文所用，短語「rRNA除盡的樣本」通過去除某些量的rRNA分子同時保留至少90％的所述非rRNA的RNA分子進行樣本純化。在某些實施方式中，至少91％，93％，96％，97％，98％，98.5％，99.0％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％99.9％或者100％的所述量的非rRNA的RNA分子存在於所述rRNA除盡的樣本中。

如本文所用，術語「rRNA除盡」指純化的樣本，其中存在於所述初始樣本中的顯示了來自所述至少一種rRNA分子的核酸序列的所有分子的5％或者更少仍然存在於所述rRNA除盡的樣本中。在某些實施方式中，存在於所述初始樣本中的顯示了來自特定的rRNA分子的核酸序列的所有分子的5％，4％，3％，2％，1.5％，1.0％，0.5％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％或者0.01％或者更少。

具有本領域知識的人員會知道或者容易地發現用於檢定存在於所述初始樣本和所述rRNA除盡的樣本中的所述量的顯示所述至少一種rRNA分子的序列的RNA分子的方法。例如，在一個實施方式中，顯示所述至少一種rRNA分子的序列的RNA分子的百分比基於所述初始樣本和所述rRNA除盡的樣本中的所述量的顯示所述至少一種rRNA分子的序列的RNA分子，如利用逆轉錄實時PCR(RT-qPCR)予以測定。

如本文所用，術語「rRNA除盡的樣本」或者「大體上不含rRNA分子的樣本」在本文中有時指「rRNA削減的樣本」或者「削減的樣本」以及所述「用於生成rRNA除盡的樣本的方法」或者所述「用於從樣本分離rRNA的方法」在本文中有時指「用於rRNA削減的方法」或者，更簡單地，指「rRNA削減」。本文的術語「rRNA削減」將意指「用於生成rRNA除盡的樣本的方法或者用於從樣本中分離rRNA的方法」。類似地，當動詞形式「削減」用於本文時，它將意指「一種執行用於生成rRNA除盡樣本或者用於從樣本分離rRNA的方法的方法或工藝」以及本文中的術語「削減的」將意指「經過執行所述方法或工藝所述樣本的rRNA除盡的狀態」。

如本文所用，術語「雜交」用以指互補核酸的配對。雜交以及雜交強度(即核酸之間的關聯強度)受許多因素影響，例如核酸之間的互補程度、所涉及條件的嚴謹度、所形成的雜交體的解鏈溫度(Tm)以及核酸內的G∶C比率。其結構內包含互補核酸配對的單分子被稱為「自交」的分子。核雜交的豐富指導資料可見於Tijssen，Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，″Elsevier(1993)，其以引用方式併入本文。

可以使用柱式純化技術進行純化，可使用RNA Clean&Concentrator TM-5柱(Zymo Research；CatalogNumbersRl015，Rl016)，以純化所述rRNA除盡RNA樣本。如果使用所述RNA Clean&Concentrator TM-5柱，請遵循製造商的步驟」。

同時可以選擇純化方法，乙醇沉澱純化方法， XP(Beckman Coulter)對RNA進行抽提純化。

洗脫的RNA可選擇立即使用或者於-70℃至-80℃下儲存。

術語「測序技術」據本發明生成的純化的RNA樣本可以利用任何類型的適當的測序技術進行測序。所採用的類型的測序方法不對本發明形成限制。下文對示例性的測序方法進行描述。

核酸測序技術的描述性的非限制性的例子包括但不僅限於鏈終止子(Sanger)測序以及染料終止子測序。在焦磷酸測序(Voelkerding等人，ClinicalChem.，55：641-658，2009；MacLean等人，NatureRev.Microbiol.，7：287-296；美國專利號6210891；美國專利號6258568；每個以引用方式整體併入本文)中，通過用泳道有與接頭互補的寡核苷酸的微球捕獲單個模板分子將模板DNA分成片段、進行末端修復、連接至所述接頭並以克隆方式進行原位擴增。

在Solexa/Illumina平臺(Voelkerding等人，ClinicalChem.，55：641-658，2009；MacLean等人，NatureRev.Microbiol.，7：287-296；美國專利號6833246；美國專利號7115400；美國專利號6969488；每個以引用方式整體併入本文)中，測序數據以長度較短的讀段的形式產生。

利用SOLiD技術對核酸分子的測序(Voelkerding等人，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.，7：287-296；美國專利號5912148；美國專利號6130073；每個以引用方式整體併入本文)還涉及模板的片段化、連接至寡核苷酸接頭、附至微球以及通過乳化PCR的克隆擴增。

Helicos Bio Sciences的HeliScope(Voelkerding等人，Clinical Chem.，55：641-658，2009；MacLean等人，Nature Rev.Microbiol.，7：287-296；美國專利號7169560；美國專利號7282337；美國專利號7482120；美國專利號7501245；美國專利號6818395；美國專利號6911345；美國專利號7501245；每個以引用方式整體併入本文)是第一個商業化的單分子測序平臺。

除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學和生物化學的常規技術，這落入本領域技術範圍內。這樣的技術在文獻中有充分的說明，例如：《分子克隆實驗指南》，第2版，Sambrook等人，1989；Oligonucleotide Synthesis，MJ Gait編輯，1984；Animal Cell Culture，R.I.Freshney編輯，1987；Methods in Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell編輯，Blackwell Science Inc.，1987；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells，J.M.Miller&M.P.Calos編輯，1987；Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人編輯，1987；以及PCR：The Polymerase Chain Reaction，Mullis等人編輯，1994。

附圖說明

以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中：

圖1 一種基於雜交降解法的在樣品總RNA中高效去除核糖體rRNA的方法原理。

圖2 總RNA與本發明的雜交降解法處理後的RNA檢測結果；圖中，Total RNA為輸入的人A549細胞系總RNA；N為不加入DNA探針，加入RNase H和DNase混合酶正常進行反應。

圖3：人A549總RNA與本發明的雜交降解法處理後的RNA中rRNA的RT-PCR檢測結果；N為去除前，R為去除後。

圖4：人A549總RNA與本發明的雜交降解法處理後的RNA中高豐度mRNA的RT-PCR檢測結果；N為未去除rRNA。(A)為檢測5.8S rRNA的結果，可見本發明方法已完全去除rRNA，而相比之下RiboZero還有相當一部分rRNA未能去除乾淨；(B)為檢測GAPDH基因的mRNA的量的結果，與未進行rRNA去除的樣本相比，本發明方法不影響mRNA的量，而RiboZero的兩次重複實驗不同程度地損失了mRNA。

圖5：人A549細胞總RNA與本發明的雜交降解法處理後的RNA中低豐度mRNA的RT-PCR檢測結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。

在下述每一實施例中，設備和材料是從以下所指出的幾家公司購得：

RNase H酶(#EN0202，Thermo Scientific，美國)；

RNase H反應試劑(#EN0202，Thermo Scientific，美國)；

DNase混合酶(DNAse I:Thermo Scientific，#EN0521；Exonuclease I:Thermo Scientific，#EN0581，美國)；

DNase I反應試劑(Thermo Scientific，#EN0521，美國)；

Reagent(美國)；

XP(Beckman Coulter，德國)；

Glycogen(Thermo ScientificTM，#R0551，美國)；

Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit(H/M/R)(Illumina#MRZG12324，美國)。

實施例1：基於雜交降解法的在樣品總RNA中高效去除核糖體rRNA的方法原理

本發明提供去除核糖體rRNA的具體方法，包括以下步驟，如圖1所示。

1.針對樣品不同物種，對該物種的所有rRNA的全長序列設計探針，將探針混合。

2.在樣品總RNA中加入探針混合物，緩慢退火，探針與目標rRNA特異性雜交結合，形成DNA:RNA雜交雙鏈；

3.加入RNase H酶特異性降解探針與rRNA結合的雜交雙鏈；

4.DNase混合酶去除樣品中痕量DNA和降解剩餘DNA探針混合物，並終止反應；

5.純化去除rRNA後的樣品RNA。

該方法可以廣泛用於多種物種樣品中總RNA的rRNA高效去除。

實施例2：DNA探針的設計

針對樣品不同的物種，本發明方法對不同物種的所有rRNA的全長序列。

本實施例中設計去除人類rRNA(包含28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、12S rRNA、16S rRNA)的DNA探針。具體方法如下：

從NCBI上獲取人類rRNA全長序列，5S rRNA(登錄號：NR_023379)、5.8S rRNA(登錄號：NR_003285)、12S rRNA(登錄號：NC_012920.1(648-1601))、16S rRNA(登錄號：NC_012920.1(1671-3229))、18S rRNA(登錄號：NR_003286)、28S rRNA(登錄號：NR_003287)。

人源RNA中5S rRNA(121bp)、5.8S rRNA(159bp)、12S rRNA(954bp)、16S rRNA(1559bp)、18S rRNA(1969bp)、28S rRNA(5025bp)，這些rRNA全長序列總共長9787bp，針對這些rRNA的全長序列，每隔5bp設計一個50bp與rRNA序列反向互補配對的單鏈DNA探針，一共設計185個探針。

實施例3：獲得DNA探針序列

設計並製備單鏈DNA探針，具體序列如下：

所有探針分子等比例混合，組成探針混合物，且探針混合物中每個探針的濃度為5μg。

實施例4：DNA探針添加比例的優化實驗

在5μg總RNA中，分別為加入額定量0.1x，0.5x，1x的探針DNA，並依次加入RNase H和DNase混合酶按操作步驟進行rRNA去除。使用2.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過SybrGreen II染色，由圖2可以看出，加入1x額定量探針時，可將rRNA完全降解成極小的片段，達成rRNA去除的目的。

實施例5：DNA:RNA雜交雙鏈的製備

樣品5μg總RNA，加入5ug探針混合物，加入5μl pH 7.5的反應試劑(200mM Tris-Hcl和50mM KCl)與無RNA酶滅菌水至終體積20μl。樣品用移液槍吹打均勻後，在PCR儀器上進行雜交反應。

採用下面20μl的反應體系進行探針與rRNA雜交反應體系如下:

上述反應體系使用移液槍吹吸混勻後，使用PCR儀器，95℃加熱2min，然後從95℃每隔1s減低0.1℃，直到溫度達到22℃，22℃保持5min。

獲得探針與rRNA序列雜交形成DNA:RNA雜交雙鏈。

實施例6：去除雜交結合的rRNA

加入雜交反應體系、RNase H酶、RNase H反應試劑與無RNA酶滅菌水至終體積40μl，具體體系如下：

反應體系使用移液槍吹吸混勻後，使用PCR儀器，設定溫度37℃反應45min，反應去除雜交結合的rRNA。

實施例7：去除剩餘的痕量DNA和降解剩餘DNA探針混合物

去除雜交反應體系加入DNase混合酶、DNase I反應試劑與無RNA酶滅菌水至終體積，反應體系如下：

反應體系使用移液槍吹吸混勻後，使用PCR儀器，設定溫度37℃反應45min。

實施例8：純化去除rRNA後的RNA樣品

純化樣品去除rRNA後的總RNA，可選擇純化方法，乙醇沉澱純化方法， XP(Beckman Coulter)純化RNA。具體操作方法如下：

加入Ambion TRIZOL 1mL，搖勻，室溫放置5min，加入200μl氯仿，搖勻，在離心機4℃低溫12000g離心15min，分離上清到新管，加入2μl Glycogen(5mg/ml)然後加入200μl異丙醇。樣品-20℃放置過夜或-20℃放置4小時以上。樣品在離心機4℃低溫12000g離心15min，小心移除上清，加入75％冷乙醇清洗兩次後，4℃低溫離心8min，移除乙醇後，晾乾，加入無RNase滅菌水。

獲得的去除rRNA的總RNA樣品。

使用2.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過SybrGreen II染色，由圖3可以看出，本發明方法可一次性去除核編碼的28S，18S，5.8S rRNA以及線粒體編碼的12S，16S mt-rRNA。去除rRNA後，所有rRNA已無法用RT-PCR檢出。

通過上述方法，去除樣品總RNA中99.9％的rRNA。

實施例9：純化結果驗證

使用本發明方法去除人A549細胞5μg總RNA中的rRNA，通過RT-PCR比較去除前後rRNA的量以及mRNA的量。

在相同條件下，設置對照組，對照組使用Illumina Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit(Human/Mouse/Rat)試劑盒進行rRNA去除。

實驗組和對照組分別使用2.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過SybrGreen II染色，由圖4可以看出，可見本發明方法已完全去除rRNA，而相比之下Ribo-Zero還有相當一部分rRNA未能去除乾淨。檢測實驗組和對照組的GAPDH基因的mRNA的量。與未進行rRNA去除的樣本相比，本發明方法不影響mRNA的量，而Ribo-Zero的兩次重複實驗不同程度地損失了mRNA。

實施例10：純化結果驗證

實驗組和對照組分別使用2.7％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過SybrGreen II染色，檢測低豐度的EIF3J mRNA的量，由圖5可以看出，與未進行rRNA去除的樣本相比，本發明方法不影響mRNA的量，而RiboZero在第2次重複實驗中損失了大部分的EIF3J mRNA。

所述方法獲得的總RNA樣品，可以進行後續的實驗分析，例如RT-qPCR，轉錄組建庫測序等。

以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。