一種白介素6定量測定試劑盒及其製備方法

2023-04-28 22:24:06 1

一種白介素6定量測定試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種白介素6定量測定試劑盒，屬於醫療器械生物類免疫體外診斷領域。該試劑盒包括校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發光底物。本發明還公開了該試劑盒的製備方法與使用該試劑盒檢測白介素6的方法。本發明以異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體和鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體製備抗試劑，以抗異硫氰酸螢光素抗體偶聯羧基磁珠製得磁微粒試劑，使免疫反應更容易混勻和分離，而且大大提高了反應速度，以新型化學發光底物ALPS為底物，提高了試劑盒的靈敏度和特異性性能。本發明的檢測試劑盒性能可靠、靈敏度高、線性範圍寬，可配合半自動、全自動儀器使用。
【專利說明】一種白介素6定量測定試劑盒及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫療器械生物類免疫體外診斷領域，具體涉及一種基於磁微粒分離化 學發光法定量檢測血液中白介素6的試劑盒及其製備方法，以及應用該試劑盒定量檢測血 液中白介素6的方法。

【背景技術】
[0002] 白介素6 (IL-6)是一種細胞因子，屬於白細胞介素的一種，能夠刺激參與免疫反 應的細胞增殖、分化並提高其功能。激活的淋巴細胞、單核巨噬細胞、骨髓細胞和部分腫瘤 細胞可以合成和分泌IL-6,其作為一種機體在免疫應答中產生的重要介質，具有多種生物 學活性。
[0003] IL-6及其受體與炎症性疾病的有關，它是多功能炎性細胞因子，是炎性介質網絡 的關鍵成份，在炎症反應中起重要作用。IL-6水平上升可作為炎症反應的早期指標，並可用 於評估系統性炎症反應症候群的嚴重程度（SIRS)。IL-6與多種腫瘤發生、發展關係密切， 它通過幹預細胞的黏附性和活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增殖， 從而影響腫瘤的進展。IL-6的臍帶血是早產兒預測早發性敗血症最顯著變量，而IL-6在母 體血液是表示宮內環境，故同樣可用於識別懷孕。童年期較高的血IL-6水平與日後罹患抑 鬱及精神病的風險升高相關。體內IL-6的水平上升，可以導致多種疾病如：甲狀腺疾病、免 疫異常性疾病、膿毒血症、腎小球腎炎的腎小球增殖，克羅恩病（CD)和Castleman氏病等。
[0004] 在國內，白介素6(IL-6)檢測臨床上主要以國外進口試劑和免疫組化試劑應用為 主，國外進口試劑價格非常昂貴，給患者帶來很大的經濟負擔，不利於在基層普及。具有自 主智慧財產權的國產白介素6 (IL-6)免疫化學發光檢測試劑盒目前還較少，也僅停留在96孔 微孔板式技術水平上。該技術靈敏度較低、線性窄、特異性較差，也不利於高通量的全自動 檢測。
[0005] 因此，有待開發對白介素6(IL_6)檢測靈敏度高與可靠性並能降低檢測成本的檢 測技術。


【發明內容】

[0006] 針對現有技術的不足，本發明的目的旨在提供一種白介素6定量測定試劑盒，該 試劑盒能夠有效提高檢測靈敏度及可靠性，並降低成本，延長有效期。
[0007] 實現本發明的目的可以通過採取如下技術方案達到：
[0008] 一種白介素6定量測定試劑盒，其包括校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發 光底物；該試劑盒包括校準品、質控品、抗試劑、磁微粒試劑和發光底物；所述磁微粒試劑 是將抗異硫氰酸螢光素抗體與羧基磁珠偶聯製成，所述發光底物是將ALPS溶解於發光底 物緩衝液中製成。
[0009] 另一方面，本發明還提供了這種白介素6定量測定試劑盒的製備方法，包括以下 步驟：
[0010] 分別配製白介素6校準品、白介素6質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物；將白 介素6校準品、白介素6質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物獨立地置於包裝容器內，得 到白介素6的定量測定試劑盒。
[0011] 本試劑盒的異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體為能與人體內白介素6抗原 特異結合的單克隆抗體，所述鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體為能與白介素6抗原特 異結合的單克隆抗體。包被抗體和標記抗體除能與白介素6抗原特異性結合外，配對使用 時可與抗原形成"三明治"夾心結構。
[0012] 具體地，所述白介素6定量測定試劑盒按照如下方法製備而成：
[0013]A、白介素6校準品、白介素6質控品的配製方法如下：
[0014] 用標準品緩衝液溶解白介素6,配置白介素6校準品、白介素6質控品；其中，所述 校準品緩衝液是通過在1L新生牛血清中加入0.Olg?0. 05g的四環素和0.lg?0. 5g的 硫酸新黴素，完全溶解後經過〇. 22ym濾膜處理製備而成；
[0015]B、抗試劑的製備方法如下：
[0016] 1)抗試劑緩衝液的製備：
[0017] 將12. 12mg?60. 57mg的Tris、0.Olg?0? 05g的四環素、lg?5g的綿羊血清、 3g?10g的新生牛血清、lg?5g的馬血清加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，製得抗 試劑緩衝液；
[0018] 2)異硫氰酸螢光素與白介素6偶聯，獲得異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗 體：
[0019] 首先用抗試劑緩衝液將異硫氰酸突光素配製成濃度為1. 0?5.Omg/mL的異硫氰 酸螢光素溶液，使用分光光度計在495nm處讀取吸光值，來調整濃度，然後按照白介素6抗 體與異硫氰酸螢光素的質量之比為1:1. 1，將二者同時轉移到棕色玻璃瓶中，室溫下攪拌 1?2小時，充分反應後使用pH為8?9的碳酸氫鹽緩衝液進行平衡，然後使用凝膠層析分 離純化得到異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體；紫外監測，記錄儀記錄純化圖譜，同 時注意確認含有連接物的試管，注意、避光防護；
[0020] 3)鹼性磷酸酶與白介素6抗體偶聯，獲得鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體：
[0021] 首先用抗試劑緩衝液將鹼性磷酸酶配製成濃度為1. 0?5.Omg/mL的鹼性磷酸酶 溶液，可以根據分光光度計在280nm處讀取吸光值，將鹼性磷酸酶的吸光值應該在一定的 範圍內。然後按照鹼性磷酸酶與白介素6的摩爾比為1:2?1:10的量將二者轉移至棕色 瓶中，室溫下攪拌4?5小時，充分反應後使用pH為8?9的碳酸氫鹽緩衝液平衡,然後使 用凝膠層析分離純化得到的鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體；注意含有連接物的試管 的避光防護。
[0022] 4)將步驟2)中獲得的異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體和和步驟3)中獲 得的鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體，加入含有表面活性劑的Tris鹽緩衝液，充分攪 拌後獲得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一種或 多種，表面活性劑的添加量為〇. 01 %?〇. 5%。
[0023]C、磁微粒試劑的製備：
[0024] 將抗異硫氰酸螢光素抗體與羧基磁珠偶聯製得磁微粒試劑。
[0025] 1)取一定體積的充分混勻後的羧基磁珠濃縮液至反應瓶中，將該反應瓶在磁場中 放置15min，待羧基磁珠全部沉降後吸去上清，向反應瓶中加入相當於反應瓶中羧基磁珠體 積2?5倍的磁微粒緩衝液，混勻20-30min;再將反應瓶置於磁場中15min後吸去上清；重 復清洗羧基磁珠3遍。最後將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻待用；所述磁微粒緩 衝液的配置方法是將12. 12mg的Tris，5. 82mg的氯化鈉，50g的甲基纖維醚加入到1L純化 水中，充分攪拌至完全溶解即得；該磁珠緩衝液含多種去垢劑，能夠有效地清除非特異性吸 附，提高檢測特異性；
[0026] 2)連接反應：按照質量比羧基磁珠溶液：抗異硫氰酸螢光素抗體=100:1的比例 在步驟1)所製得的羧基磁珠溶液中加入抗異硫氰酸螢光素抗體，在2?8°C內保持混勻狀 態反應18小時；
[0027] 3)反應瓶在磁場中放置15min，待羧基磁珠沉降後用磷酸緩衝液清洗3遍，然後定 容至10mg/mL，2?8°C保存，製得所需磁微粒試劑。
[0028] D、發光底物的製備：將ALPS溶解於發光底物緩衝液中製備發光底物；
[0029] 用相當於ALPS體積4?10倍的發光底物緩衝液充分溶解ALPS，所述發光底物緩 衝液的配置方法是將12. 12g?121. 14g的Tris、5. 82g的氯化鈉、0. 03g的光澤精加入到 1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，用鹽酸調節pH至9. 5即得。
[0030] 進一步的，本發明的白介素6定量測定試劑盒，該試劑盒還包括清洗液，該清洗液 主要用於在檢測過程中清洗與磁微粒試劑反應後的樣品，清洗液的具體組分可以參照所屬 領域的常規操作進行。通常是磷酸二氫鈉、氯化納、Tween20和ProcLin300的混合溶液，在 試劑盒製品中可以濃縮清洗液的形式存在，檢測時適當稀釋後使用。優選的清洗液的配置 方法是將12. 12g的Tris、5. 82g的氯化鈉、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100,加入1L 純化水中，充分攪拌至完全溶解。
[0031] 再一方面，本發明還提供了利用這種白介素6定量測定試劑盒檢測白介素6的方 法，該方法包括步驟：
[0032] 1)取三支試管分別加15iiL白介素6的校準品、15iiL白介素6的質控品、15iiL 待測樣本；
[0033] 2)每支試管中加入60yL抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37°C下水浴5min;
[0034] 3)每支試管中加入30iiL磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s， 置37°C下水浴5min;
[0035] 4)將三支試管在磁分離器上沉澱2min，緩慢地倒轉試管和磁分離器，倒出上清 液，把倒轉的試管連同磁分離器一起放在濾紙上，用力拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁 上的所有液滴；
[0036] 5)每支試管中加入300yL清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混勻 後緩慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同磁分離器一起放在濾紙上， 用力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；
[0037] 6)重複步驟5)-次；
[0038] 7)每支試管中加入200UL發光底物溶液，振蕩混勻3s，用化學發光儀檢測發光強 度。
[0039] 本發明的試劑盒中未詳細提及的試劑組分（例如清洗液、一些必要的緩衝液等）、 試劑盒的外包裝以及各試劑組分的獨立包裝容器等均可以按照所屬領域的常規操作進行， 符合相關行業規定即可。本發明的方法中未詳細提及的操作步驟也可參照所屬領域的常規 操作進行，例如在檢測前可將各試劑放至室溫（18?25°C)，加樣前充分混勻；所用檢測儀 器設備例如化學發光類測定儀的使用按照說明書操作進行；本發明中，未特別註明單位的 比例與含量，固體組分為質量比例與含量，液體組分為體積比例與含量。
[0040] 本發明的有益效果在於：
[0041] 1、本發明以鹼性磷酸酶為標記酶，通過化學反應標記抗體，並使用凝膠層析分離 純化，提_了反應的靈敏度；
[0042] 2、本發明以抗異硫氰酸螢光素抗體與羧基磁珠偶聯製得磁微粒試劑，使免疫反應 更容易混勻和分離，而且大大提高了反應速度；
[0043] 3、本發明以ALPS(N-乙基-N- (3-丙磺基）苯胺鈉鹽）為底物，該底物是輝光性底 物，靈敏度高，可以快速達到平臺期，平臺穩定期長且信號較強，有利於信號的檢測，提高了 最終試劑盒的靈敏度和特異性性能；並進一步優化了化學發光增強體系，保證了終產品的 信號靈敏度高和穩定性好、變異小；
[0044] 4、本試劑盒穩定性良好，有效期可至一年以上；
[0045] 5、本試劑盒在臨床研究中與國外進口試劑的符合相關性高達95%以上，且費用僅 為其1/5,使用成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1是白介素6的標準曲線；
[0047] 圖2是白介素6定量測定試劑盒與進口檢測試劑的檢測效果相關性曲線。

【具體實施方式】
[0048] 下面結合附圖與實施例對本發明做具體說明。
[0049]實施例1 :各種緩衝液的配置，具體如下：
[0050]l、Tris鹽緩衝液
[0051] 將12. 12g的Tris、5. 82g的氯化鈉，加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，用鹽 酸調整最終pH為7. 5。
[0052] 2、校準品緩衝液的製備
[0053] 在1L新生牛血清中加入0. Olg四環素和0. lg硫酸新黴素，充分溶解後經過 0. 22iim濾膜處理製備而成。
[0054] 3、抗試劑緩衝液
[0055] 將30. 5mg的Tris、0. 03g的四環素、3g的綿羊血清、8g的新生牛血清、3g的馬血清 加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解即得；
[0056] 4、磁微粒緩衝液
[0057] 將12. 12mg的Tris、5. 82mg的氯化鈉、50g的甲基纖維醚加入1L純化水中，充分攪 拌至完全溶解即得。
[0058] 5、發光底物緩衝液
[0059] 將50. 21g的Tris、5. 82g的氯化鈉、0? 03g的光澤精加入1L純化水中，充分攪拌至 完全溶解，用鹽酸調節緩衝液的pH至9. 5即得；
[0060] 6、清洗液濃縮液的配置
[0061]將 12. 12g的Tris、5. 82g的氯化鈉、50mL的Tween-20、50mL的曲拉通-100 加入 1L純化水中，充分攪拌至完全溶解即得。
[0062] 實施例2:白介素6定量測定試劑盒的製備
[0063] 1、校準品和質控品的製備
[0064] 首先用標準品緩衝液溶解白介素6,配置成如表1所示的目標濃度的校準品和質 控品；本實施例所用的白介素6採購自生產廠家fitzgerald公司。
[0065] 表1校準品和質控品的製備

【權利要求】
1. 一種白介素6定量測定試劑盒，其特徵在於：該試劑盒包括校準品、質控品、抗試劑、 磁微粒試劑和發光底物；所述磁微粒試劑是將抗異硫氰酸螢光素抗體與羧基磁珠偶聯制 成，所述發光底物是將ALPS溶解於發光底物緩衝液中製成。
2. 根據權利要求1所述的白介素6定量測定試劑盒，其特徵在於：該試劑盒還包括清 洗液，所述清洗液的配置方法將12. 12g的Tris、5. 82g的氯化鈉、50mL的Tween-20、50mL的 曲拉通-100,加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解。
3. 如權利要求1所述的一種白介素6定量測定試劑盒的製備方法，其特徵在於：分別 配製白介素6校準品、白介素6質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物；將白介素6校準品、 白介素6質控品、抗試劑、磁微粒試劑、發光底物獨立地置於包裝容器內，得到白介素6的定 量測定試劑盒。
4. 根據權利要求3所述的白介素6定量測定試劑盒的製備方法，其特徵在於：所述校 準品、質控品、抗試劑按照如下方法製備而成： A、 校準品、質控品的配製： 用校準品緩衝液溶解白介素6,配置白介素6校準品和白介素6質控品；其中，所述校 準品緩衝液是通過在1L新生牛血清中加入0. Olg?0. 05g的四環素和0. lg?0. 5g的硫 酸新黴素，完全溶解後經過〇. 22 y m濾膜處理製備而成； B、 抗試劑的配製： 1) 抗試劑緩衝液的製備： 將12. 12mg?60. 57mg的Tris、0. Olg?0? 05g的四環素、lg?5g的綿羊血清、3g? l〇g的新生牛血清、lg?5g的馬血清加入1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，製得抗試劑 緩衝液； 2) 將異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體和鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體 加入到所述抗試劑緩衝液中充分攪拌至完全溶解。
5. 根據權利要求3所述的白介素6定量測定試劑盒的製備方法，其特徵在於所述抗試 劑是按照以下步驟製備： 1) 異硫氰酸螢光素與白介素6抗體偶聯,獲得異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗 體： 首先用抗試劑緩衝液將異硫氰酸突光素配製成濃度為1. 〇?5. Omg/mL的異硫氰酸突 光素溶液，然後按照質量比為白介素6 :異硫氰酸螢光素溶液=1:1. 1的二者轉移到棕色玻 璃瓶裡，室溫下攪拌1?2小時；充分反應後使用pH為8?9的碳酸氫鹽緩衝液平衡，然後 使用凝膠層析分離純化得到異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體； 2) 鹼性磷酸酶與白介素6抗體偶聯，獲得鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體： 首先用抗試劑緩衝液將鹼性磷酸酶配製成濃度為1. 〇?5. Omg/mL的鹼性磷酸酶溶液， 按照摩爾比為鹼性磷酸酶：白介素6 = 1:2?1:10的二者轉移至棕色玻璃瓶中，室溫下攪 拌4?5小時，充分反應後使用pH為8?9的碳酸氫鹽緩衝液平衡，然後使用凝膠層析分 離純化得到鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體； 3) 將步驟1)中獲得的異硫氰酸螢光素標記的白介素6包被抗體和和步驟2)中獲得的 鹼性磷酸酶標記的白介素6標記抗體加入含有表面活性劑的Tris鹽緩衝液中，充分攪拌後 獲得所述抗試劑；所述表面活性劑為Tween 20、Triton X-100、Bronidox中的一種或多種， 表面活性劑的添加量為0. 01%?0. 5%。
6. 根據權利要求3所述的白介素6定量測定試劑盒的製備方法，其特徵在於所述磁微 粒試劑是按照以下步驟製備的： 1) 將充分混勻後的羧基磁珠濃縮液放入反應瓶中，將該反應瓶在磁場內放置15min， 待羧基磁珠全部沉降後吸去上清，向反應瓶中加入相當於反應瓶中羧基磁珠體積2?5倍 的磁微粒緩衝液，震蕩清洗20-30min ;再將反應瓶置於磁場中15min後吸去上清；重複清洗 羧基磁珠3遍；最後將羧基磁珠溶液定容到10-50mg/mL，混勻待用；所述磁微粒緩衝液的配 置方法是將12. 12mg的Tris、5. 82mg的氯化鈉、50g的甲基纖維醚加入到1L純化水中，充分 攪拌至完全溶解即得； 2) 連接反應：按照質量比羧基磁珠溶液：抗異硫氰酸螢光素抗體=100:1的比例在步 驟1)所製得的羧基磁珠溶液中加入抗異硫氰酸螢光素抗體，在2?8°C內保持混勻狀態反 應18小時； 3) 反應瓶在磁場中放置15min，待羧基磁珠沉降後用磁微粒緩衝液洗3遍，隨後定容至 10mg/mL，2?8°C保存，製得所需待用磁微粒試劑。
7. 根據權利要求3所述的白介素6定量測定試劑盒的製備方法，其特徵在於：所述發 光底物是用相當於ALPS體積4?10倍的發光底物緩衝液充分溶解ALPS製備而成的；所述 發光底物緩衝液的配置方法是將12. 12g?121. 14g的Tris、5. 82g的氯化鈉、0. 03g的光澤 精加入到1L純化水中，充分攪拌至完全溶解，用鹽酸調節pH至9. 5即得。
8. 利用權利要求1或2所述的白介素6定量測定試劑盒檢測白介素6的方法，其特徵 在於該方法包括以下步驟： 1) 取三支試管分別加15 y L白介素6的校準品、15 y L白介素6的質控品、15 y L待測 樣本； 2) 每支試管中加入60 y L抗試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置於37°C 下水浴5min ; 3) 每支試管中加入30 y L磁微粒試劑，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，置 37°C下水浴5min ; 4) 將試管在磁分離器上沉澱2min，緩慢地倒轉試管和磁分離器，倒出上清液；把倒 轉的試管連同磁分離器一起，放在濾紙上，拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液 滴； 5) 每支試管中加入300 y L清洗液，用塑料薄膜覆蓋試管，輕輕振蕩試管30s，混勻後緩 慢的倒轉試管和磁分離器，倒出上清液，把倒轉的試管連同磁分離器一起，放在濾紙上，用 力拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴； 6) 重複步驟5) -次； 7) 每支試管中加入200 y L發光底物，振蕩混勻3s，用化學發光儀檢測發光強度。
【文檔編號】G01N33/53GK104330551SQ201410652746
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】郭志剛, 龔愛華 申請人:南方醫科大學南方醫院, 廣州華亙朗博藥業有限公司