表達cbh1基因的酵母工程菌株及其構建方法

2023-04-29 09:31:26

專利名稱：表達cbh1基因的酵母工程菌株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達cbh1基因的畢赤酵母工程菌株(Pichia pastoris GS-D)及構建方法。
(二)技術背景纖維素是一種廉價的可再生資源，是高等植物細胞壁的主要成分，其含量達植物乾重的35％～55％，廣泛存在於自然界。將纖維素水解成葡萄糖，再通過發酵可生產乙醇、丙酮、丁醇等有機化工原料和燃料，也可以生產飼料、食物和藥物等。纖維素材料是解決人類面臨的糧食問題，能源問題和環境問題的最有前景的資源。研究、開發纖維素資源有著深遠的意義。纖維素酶可以將纖維素的分子鏈切斷，使其轉化為葡萄糖，除了可供發酵進一步轉化為蛋白、脂肪供人們使用並作畜禽飼料外，還可作為生產酒精、丁醇、檸檬酸、穀氨酸、甘油等的碳源，這對於提高糧食利用率，節省大量糧食，具有十分重要的意義。纖維素酶的應用，目前已經進入了食品、飼料、紡織、化工、造紙、醫藥、石油開採等工業領域。
目前，制約纖維素酶在農業工業上應用的主要因素有(1)生產周期長，產品成本高，(2)熱穩定性差，貨架壽命短。(3)高溫發酵需要專門的設備，這些將增加生產的成本和能耗。因此熱穩定性纖維素酶的研究和開發具有重要的商業價值。當前應致力於嗜熱微生物產生的熱穩定酶的研究。利用嗜熱菌產生的嗜熱酶作為生物催化劑有許多優勢(1)酶製劑的成本降低，穩定性提高，可在室溫下分離提純和包裝運輸，並能長久地保持活性；(2)加快了動力學反應；(3)對反應的冷卻系統要求降低，因而降低了能耗，既可降低成本，又可減少冷卻過程對環境造成的汙染；(4)在嗜熱酶催化反應的條件下(超過60℃)，很少有雜菌汙染，從而減少了細菌代謝產物對產品的汙染，可提高產物的純度，簡化其提純過程；(5)生化過程在高溫下進行能增加難溶物質如澱粉類、纖維素類、多芳香類和脂類等的溶解性和可利用性，降低有機化合物的黏度而利於物質的擴散和混合。
嗜熱毛殼菌CT2(Chaetomium thermophilum CT2)是一種廣泛分布於土壤中的嗜熱真菌，是真核生物中生長上限溫度很高的一種真菌，有可能成為真核生物中產生熱穩定酶的最佳菌株。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50℃條件下可以產生纖維二糖水解酶(CBH)。但要使之用於大規模的工業生產，還存在一些尚未解決的問題。如嗜熱菌培養條件比較苛刻，嗜熱酶的大規模發酵生產需要特殊設備，而且產酶效率低，從而造成產品成本增加，因此限制了它的應用。解決這一問題的有效途徑是應用分子生物學手段，將熱穩定纖維素酶基因導入中溫型微生物酵母中高效表達，利用酵母生長快、易於培養等特點，使纖維素酶基因在常溫和短時間內快速、超量表達，期望達到降低能耗和提高經濟效益的目的。

發明內容
本發明的目的在於提供一種表達纖維二糖水解酶I基因的酵母工程菌株及其構建方法。該菌成本低，大規模發酵生產方便，易於實現產業化。本發明的另一個目的是提供製備畢赤酵母菌株的方法，該方法操作簡便，重複性好。
本發明所涉及的cbh1基因來自嗜熱毛殼菌菌株CT2，其編碼的纖維二糖水解酶I熱穩定性高。嗜熱毛殼菌CT2由本實驗室從土壤中應用常規分離方法分離得到，cbh1基因由本實驗室克隆得到，Genbank登錄號為AY861347。在本發明的一個實施例中提供了一種嗜熱毛殼菌CT2纖維二糖水解酶I基因的核苷酸序列及其製備方法，該方法是以嗜熱毛殼菌總RNA為模板，用特異性寡核苷酸引物，經反轉錄PCR方法得到纖維二糖水解酶I基因cDNA。基因測序結果表明纖維二糖水解酶I成熟蛋白由1536個核苷酸組成，編碼512個胺基酸。
本發明的一個實施例中提供了一種嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilumCT2纖維二糖水解酶I基因的製備及克隆到大腸桿菌的方法，該方法包括擴增引物合成，嗜熱毛殼菌總RNA的提取，mRNA的反轉錄，目的基因的PCR擴增，目的基因片斷的回收，目的基因片斷克隆入載體，嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I基因序列的測定。
本發明的技術要點之一是表達纖維二糖水解酶I基因的畢赤酵母工程菌株的構建及誘導表達。畢赤酵母表達系統是近年來發展起來的一種高效的真核表達系統，它具有以下優點表達量高，穩定性好，活性高，便於工業化生產。
在本發明的一個實施例中提供了一種基因工程菌株的構建，菌株為畢赤酵母Pichiapastoris GS-H。在畢赤酵母菌中表達纖維二糖水解酶I基因的方法，該方法是用pPIC9K載體在畢赤酵母中表達纖維二糖水解酶I基因，包括(1)纖維二糖水解酶I基因的PCR擴增；(2)PCR產物克隆至T載體；(3)穿梭表達質粒的構建；(4)表達纖維二糖水解酶I基因的酵母工程菌株的構建。
本發明的技術要點之二是基因工程蛋白的誘導表達與活性測定。在畢赤酵母中有兩個編碼乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作為唯一碳源快速生長，畢赤酵母工程菌中，外源基因被克隆至AOX1啟動子控制下，以甲醇作為誘導劑來實現外源蛋白的高效表達。
在本發明的實施例中提供了一種畢赤酵母工程菌株誘導表達的方法，可用於畢赤酵母工程菌株誘導表達的培養基包括但不僅限於下列培養基MM MD BMGYBMMY，各種培養基的配製方法為本技術領域人員非常熟悉的方法，可以通過參考相關文獻獲得詳情。
在本發明的一個實施例中提供一種纖維二糖水解酶I的生物學活性，通過活性測定，本發明的基因工程菌株發酵的活性單位超過21U/mL，表達量達到1.4g/L，實現了外源基因在畢赤酵母中的高效表達。


圖1纖維二糖水解酶I基因成熟蛋白編碼基因的PCR擴增結果(1536bp)圖2重組質粒的酶切鑑定結果(EcoR I和Not I雙酶切)圖3重組表達載體的酶切鑑定結果泳道1為核酸高分子量電泳markerλ-Hind III digest DNA marker(23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp，2027bp，564bp，125bp)泳道2為重組質粒pPIC9K/cbh1泳道3為pPIC9K/cbh1EcoR I and Not I酶切結果(9.3Kb+1538bp)泳道4為pPIC9K/cbh1EcoR I and Xbal I酶切結果(8.5Kb+2348bp)泳道5為pPIC9K/cbh1Xbal I酶切結果(10.8Kb)泳道6為pPIC9K/cbh1特異引物C1，C2擴增結果(1538bp)泳道7為DL2000 DNA marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)泳道8為DL15000Marker(15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp)圖4G418篩選多拷貝轉化子(左圖G418含量為2.0mg/mL，右圖G418含量為3.0mg/mL)圖5重組蛋白SDS-PAGE檢測泳道1為蛋白低分子量Marker(94kDa，67kDa，43kDa，31kDa，20kDa)泳道2為重組基因表達蛋白泳道3為空載體轉化畢赤酵母工程菌發酵產物(五)
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，所有實施例中的培養基及分子生物學操作方法為本領域技術人員所熟悉，可以參考Sambrook等「分子克隆」(實驗室手冊，1989)等獲得詳情。
實施例1.嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I基因的PCR擴增及克隆(1)擴增引物的合成根據實驗室克隆的嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I cDNA序列設計寡核苷酸引物擴增。上遊引物長26個核苷酸，下遊引物長27個核苷酸，引物由上海生工生物有限公司合成，經PAGE純化。序列如下(在上下遊引物中分別引入了EcoRI和Not I酶切位點，加下劃線處為酶切位點)正向5』---CCGAATTCCAGCAGGCTTGCTCCCTC-----3』反向5』----GGGCGGCCGCTTACAGGCACTGGGCTG--3』(2)總RNA的提取從中國分離鑑定一株嗜熱真菌Chaetomium thermophilum CT2，按照TRIZOL法提取總RNA收集誘導產生的菌絲，無菌水衝洗，乾燥，液氮速凍，研磨。每0.2g加入1mL TRIZOL，靜置5分鐘，加入0.2mL三氯甲烷，劇烈振蕩15s，12000g，4℃，離心15min。取上清，加入沉澱劑離心得沉澱，75％的乙醇洗沉澱兩次，乾燥。將沉澱溶解在50ul DEPC處理的雙蒸水中。-80℃保存，待用。
(3)反轉錄合成cDNA第一條鏈按照Promega公司的Reverse TranscriptionReaction試劑盒說明書進行，以Oligo(dT)20引物合成cDNA第一鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入一個經DEPC浸泡並滅菌處理的PCR反應管中25mM MgCl212ul；緩衝液6ul；10m M d NTP 6ul；Recombinant Rnasin RibonucleaseInhibitor 2ul；AMV反轉錄酶4ul；Oligo(dT)20 6ul；嗜熱毛殼總RNA 15ul；滅菌雙蒸水9ul。反應條件為42℃1小時；95℃5分鐘；3℃5分鐘。
(4)目的基因的PCR擴增取8ul反轉錄反應引物，按照Reverse Transcription Reaction試劑盒中給出的PCR反應體系參數進行PCR反應。反應組分為10X緩衝液 2.5ul25mM MgCl21.5ul10m M d NTP2ul上遊引物 1ul下遊引物 1ul反轉錄產物 5ulRT-PCR酶混合物 2ul滅菌雙蒸水 10ul其反應參數為預變性94℃，4min變性94℃，1min復性55℃，1min延伸72℃，1min30s循環30個終止延伸72℃ 10minPCR產物通過1％瓊脂糖電泳檢測，電泳結果如附圖1所示。
(5)目的片段的回收按照上海華舜生物工程公司PCR產物回收試劑盒說明書回收目的基因片斷，其過程如下取30ul PCR反應產物加入1.4mL PB液(試劑盒提供)，混合物移入吸附柱中離心15秒，棄廢液；在吸附柱中加入400ul PB液，靜置1分鐘後，離心15秒，棄廢液；再加入500ul W1液(試劑盒提供)，離心15秒，棄廢液，重複一次；在吸附柱中加入300ul T1液(試劑盒提供)，靜置1分鐘後，離心30秒，收集離心液，貯存於-20℃。
(6)目的基因片段克隆入載體目的基因片段克隆入pMD18-T載體，該載體購自大連寶生物工程公司。反應組分如下PCR產物5ul；pMD18-T載體1ul；Ligation solution 4ul；總體積為10ul，16℃連接過夜。
感受態細胞的製備挑取單個DH5α菌落，接種於3mL不含氨苄青黴素的LB培養基中，37℃培養過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種於50ml LB培養液中，37℃振蕩3小時，待菌液OD值為0.6時，4℃5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉澱用0.1MCaCL2懸浮，再5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉澱以適量0.1M CaCL2重懸，分裝後置冰浴內6小時備用。
連接產物的轉化取上述連接產物5ul加入100ul感受態細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入無氨苄青黴素的LB培養基0.9ml，37℃培養1小時，取200ul菌液加入40ul 20mg/mL5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4ul 0.1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混勻後塗含氨苄青黴素LB平皿，37℃培養16小時，挑取白色菌落快速提取質粒進行酶切鑑定，酶切產物經1％瓊脂糖電泳檢測結果如圖2所示，其陽性克隆命名為pMDT/cbh1。
(7)嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I成熟蛋白編碼基因的序列測定提取質粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，序列測定由上海生物工程有限公司完成，序列引物為M13啟動子引物。嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶I基因核苷酸序列測定結果嗜熱毛殼菌成熟蛋白編碼基因序列長1539個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-318、C-539、G-395、T-287。編碼512個胺基酸。該蛋白質成熟蛋白終止密碼子位於基因第1537位，終止密碼子為TAA。
5』端至3』端序列為1 CAGCAGGCTT GCTCCCTCAC CACTGAGACC CACCCCAGAC TCACTTGGAA GCGCTGCACC61TCTGGCGGCA ACTGCTCGAC CGTGAACGGC GCCGTCACCA TCGATGCCAA CTGGCGCTGG121 ACTCACACTG TTTCCGGCTC GACCAACTGC TACACCGGCA ACGAGTGGGA TACCTCCATC181 TGCTCTGATG GCAAGAGCTG CGCCCAGACC TGCTGCGTCG ACGGCGCTGA CTACTCTTCG241 ACCTATGGTA TCACCACCAG CGGTGACTCC CTGAACCTCA AGTTCGTCAC CAAGCACCAG301 CACGGCACCA ATGTCGGCTC TCGTGTCTAC CTGATGGAGA ACGACACCAA GTACCAGATG361 TTCGAGCTCC TCGGCAACGA GTTCACCTTC GATGTCGATG TCTCTAACCT GGGCTGCGGT421 CTCAACGGCG CCCTCTACTT CGTCTCCATG GACGCTGATG GTGGTATGAG CAAGTACTCT481 GGCAACAAGG CTGGCGCCAA GTACGGTACC GGCTACTGCG ATGCTCAGTG CCCGCGCGAC541 CTTAAGTTCA TCAACGGCGA GGCCAACATT GAGAACTGGA CCCCTTCGAC CAATGATGCC601 AACGCCGGTT TCGGCCGCTA TGGCAGCTGC TGCTCTGAGA TGGATATCTG GGATGCCAAC661 AACATGGCTA CTGCCTTCAC TCCTCACCCT TGCACCATTA TCGGCCAGAG CCGCTGCGAG721 GGCAACAGCT GCGGTGGCAC CTACAGCTCT GAGCGCTATG CTGGTGTTTG CGATCCTGAT781 GGCTGCGACT TCAACGCCTA CCGCCAGGGC GACAAGACCT TCTACGGCAA GGGCATGACC841 GTCGACACCA CCAAGAAGAT GACCGTCGTC ACCCAGTTCC ACAAGAACTC GGCTGGCGTC901 CTCAGCGAGA TCAAGCGCTT CTACGTTCAG GACGGCAAGA TCATTGCCAA CGCCGAGTCC961 AAGATCCCCG GCAACCCCGG CAACTCCATC ACCCAGGAGT GGTGCGATGC CCAGAAGGTC1021 GCCTTCGGTG ACATCGATGA CTTCAACCGC AAGGGCGGTA TGGCTCAGAT GAGCAAGGCC1081 CTCGAGGGCC CTATGGTCCT GGTCATGTCC GTCTGGGATG ACCACTACGC CAACATGCTC1141 TGGCTCGACT CGACCTACCC CATTGACAAG GCCGGCACCC CCGGCGCCGA GCGCGGTGCT1201 TGCCCGACCA CCTCCGGTGT CCCTGCCGAG ATTGAGGCCC AGGTCCCCAA CAGCAACGTT1261 ATCTTCTCCA ACATCCGCTT CGGCCCCATC GGCTCGACCG TCCCTGGCCT CGACGGCAGC1321 ACCCCCAGCA ACCCGACCGC CACCGTTGCT CCTCCCACTT CTACCACCAC CAGCGTGAGA1381 AGCAGCACTA CTCAGATTTC CACCCCGACT AGCCAGCCCG GCGGCTGCAC CACCCAGAAG1441 TGGGGCCAGT GCGGTGGTAT CGGCTACACC GGCTGCACTA ACTGCGTTGC TGGCACTACC1501 TGCACTGAGC TCAACCCCTG GTACAGCCAG TGCCTGTAA嗜熱毛殼菌纖維二糖I基因成熟肽胺基酸序列1 QQACSLTTET HPRLTWKRCT SGGNCSTVNG AVTIDANWRW THTVSGSTNC YTGNEWDTSI61CSDGKSCAQT CCVDGADYSS TYGITTSGDS LNLKFVTKHQ HGTNVGSRVY LMENDTKYQM121 FELLGNEFTF DVDVSNLGCG LNGALYFVSM DADGGMSKYS GNKAGAKYGT GYCDAQCPRD181 LKFINGEANI ENWTPSTNDA NAGFGRYGSC CSEMDIWDAN NMATAFTpHP CTIIGQSRCE
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(2)表達纖維二糖水解酶I基因的酵母工程菌株的構建a.穿梭表達質粒的線性化提取重組質粒pPIC9K/CBH I，用Bpu1102 I酶切成線性，同樣酶切空質粒pPIC9K作為對照。
b.轉化畢赤酵母Gs115過程如下(a).YPD培養基過夜培養酵母Pichia pastoris Gs115，接種至新鮮的培養基中，培養至OD600值為1.5，(b).1500rpm/min離心收集菌體，先後用500、250mL預冷的無菌水洗菌體，4℃下3000rpm/min離心去上清液，(c).用20mL預冷的1mol/L山梨醇懸浮，取80μL加入5-10ng線性化的重組質粒(Bpu1102 I切)，冰浴5min，電擊儀電擊，電擊參數為1.5kV、25μF。
(d).電擊結束後迅速加入1mL預冷後的1mol/L山梨醇，取200μL於固體MD培養基上塗板，30℃培養直至單個轉化子出現。
(3)篩選陽性轉化子用滅菌牙籤挑取轉化子對應點種到篩選培養基MM和MD平板上，30℃培養2d，在MD上生長正常而在MM上生長緩慢或不生長的轉化子為陽性轉化子。對篩選得到的陽性轉化子用載體引物擴增鑑定。
(4)G418篩選多拷貝轉化子將陽性轉化子分別點種到含0.25mg/mL，0.5mg/mL，0.75mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.0mg/mL，2.5mg/mL，3.0mg/mL G418的YPD平板上，在含有3.0mg/mL G418的平板上篩選到8個多拷貝轉化子(圖4)實施例3.基因工程菌纖維二糖水解酶I蛋白的誘導表達(1)挑選一單菌落，置於裝有25mL BMGY培養基的250mL搖瓶中，於28-30℃/250-300rpm培養至0D600＝2-6(大約16-18h)；(2)室溫下1500-3000g離心5min，收集菌體，用BMMY重懸菌體，使OD600＝1.0左右(約200mL)；(3)將步驟2所得的菌液置於1L搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置於28-30℃/250-300rpm的搖床上繼續生長；(4)每隔24h向培養基添加100％甲醇至終濃度為0.5％(約1mL)；(5)在第24、48、72、96、120、144、168小時取樣檢測cbh1基因在酵母中的表達情況。
實施例4.酵母基因工程蛋白的提取方法(1)、蛋白分離方法a.誘導培養150h後離心收集上清液b.用70％飽和硫酸銨沉澱3h後，5000r/min離心10min，收集沉澱c小心收集沉澱，將其用適量(一般為50ml左右)的Tris-HCl緩衝液(pH8.0，50mmol/L)充分溶解d.裝入透析袋中在相同緩衝液(1000ml)中透析24h，透析時用磁力攪拌器不停的攪拌透析液，其間每隔6h更換一次緩衝液，以便於達到透析完全的效果e.將透析袋中的溶液收集，低溫下離心5min(10,000rpm，4℃)，取上清液。長期貯存時，將其分成小份於液氮中快速冷凍，-80℃貯存；(2)、SDS-PAGE電泳分析cbh1基因的表達情況a.凝膠的灌制將配製好的12％的分離膠溶液混合均勻後，將凝膠溶液迅速傾入制膠玻璃板中，至膠液面距玻璃板凹槽3cm左右，然後在膠面上輕輕鋪注1cm高的水層，垂直放置膠板，約20-30min後，膠即可凝聚。然後吸出膠面上的水。將配製好的3％濃縮膠迅速注入到分離膠的上層，至液面與玻璃板的凹槽平齊，而後插入梳子，在室溫下放置20-30min，使其凝聚。小心拔出梳子並灌入電極緩衝液。
b.上樣及電泳在酵母誘導發酵液中加等體積的加樣緩衝液，於100℃加熱3-5min變性，按順序加樣，以100V電泳至溴酚藍進分離膠，提高電壓至150V，當溴酚藍到達底部前約1cm處結束電泳；c.染色和脫色將電泳完畢的膠板取出，用去離子水衝洗乾淨後，置於約100ml染色液中染色，室溫下，在平臺搖床上染色至少20min。棄去染色液，衝洗後置於100-200ml高甲醇脫色液中脫色。當脫色液的顏色與膠的顏色一樣深時更換脫色液。如此約3-4次，通常至大部分藍色褪盡為止。凝膠置於約100ml標準(低甲醇)脫色液中4-6h或過夜，使之完全脫色。至此，膠板的本底基本清潔。脫色後，將膠板保存於室溫，去離子水中。
d.電泳結果得到cbh1基因在酵母表達載體中的表達情況(圖5)。
實施例5.基因工程纖維二糖水解酶I蛋白的活性測定稱取4mg脫脂棉，加入0.1mL適當稀釋的酶液、0.1mL 50mmol/L pH 5.0醋酸緩衝液混合後，50℃下保溫24h，加入0.1mL DNS試劑測還原糖量。一個酶活力單位(U)定義為每分鐘水解纖維素產生1μmol葡萄糖所需酶蛋白量。
權利要求
1.一種表達cbh1基因編碼蛋白的酵母基因工程菌株，其特徵是該菌株為一種畢赤酵母，名稱為Pichia pastoris GS-H，該工程菌能夠高效表達纖維二糖水解酶I，表達蛋白具有較高的熱穩定性，酶活性可達21U/mL。
2.根據權利要求1所述的一種表達cbh1基因編碼蛋白的酵母工程菌株，其特徵在於根據毛殼菌cbh1基因序列，應用PCR方法以嗜熱毛殼菌CT2的總RNA反轉錄產物為模板，擴增出cbh1的成熟蛋白編碼基因片段，克隆到下一載體pMD18-T上，測序證實後，再將克隆到的CT2纖維二糖水解酶I基因插入到畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體pPIC9K的多克隆位點，再通過電轉化導入畢赤酵母宿主Gs115中，再從中篩選出高效表達纖維二糖水解酶I的酵母基因工程菌。
全文摘要
本發明提出一種酵母基因工程菌Pichia pastorisGS－H是通過PCR方法，從毛殼屬菌株—嗜熱毛殼菌CT2中篩選獲得纖維二糖水解酶I基因，將其克隆並插入到畢赤酵母整合表達載體中，然後將得到的纖維二糖水解酶I基因表達載體導入到畢赤酵母中，再從中篩選出一種高效表達纖維二糖水解酶I的酵母基因工程菌，表達量超過1.4g/L。用該酵母基因工程菌製備的纖維二糖水解酶I，具有較高的熱穩定性，其酶活性可達21U/mL以上。通過酵母基因工程菌株發酵，大量生產具有生物活性的cbh1蛋白，用於轉化纖維廢料及其它工業領域，具有非常顯著的經濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/56GK1757710SQ20051004407
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月15日 優先權日2005年7月15日
發明者李多川, 劉守安 申請人:山東農業大學