一種由苦參素、靈芝和黃芪製成的藥物組合物的製作方法

2023-05-25 19:55:41

專利名稱：一種由苦參素、靈芝和黃芪製成的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體涉及一種主要由苦參素、靈芝或其提取物和黃芪或其提取物製成的藥物組合物，及其製備方法和用途。
背景技術：
肝炎是一種常見病和多發病，據不完全統計，我國肝炎患者和病毒攜帶者佔總人口的10％。其中以病毒性肝炎為主，病毒性肝炎又可分為急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎和膽型肝炎。慢性肝炎又可分為遷延性肝炎和活動性肝炎。肝炎是一種傳染性疾病，由於其流行性廣、危害性大、發病率高，是目前國內外公認的疑難病症之一，以B型肝炎為例，治癒率僅為10％，絕大部分轉為慢性肝炎，嚴重的轉化為肝腹水、肝癌。其中肝纖維化的形成和發展是影響預後和病情轉危的關鍵病理變化之一，也是臨床慢性肝病治療中最為複雜的疑難問題。目前治療慢性B型肝炎的療法主要有抗病毒藥物療法、免疫調控藥物療法、改善肝微循環療法、保護療法、中醫辨證論治等。國內外近年來治療肝炎的藥物雖然有許多，但大多沒有十分公認的療效，並且療效並不理想，另外治療後病情易反覆，且價格又十分昂貴。至今，市場上仍缺少抗肝炎療效確切又副作用較小的藥物。
苦參素是從豆科植物苦豆子、苦參中提取的生物鹼，主要成份是氧化苦參鹼和極少量的氧化槐果鹼。苦參素已收載入國家藥品監督管理局國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第16冊363頁(國家藥典委員會編)，其中規定含氧化苦參鹼(C15H24N2O2)不得少於98.0％。苦參素主要用於慢性B肝的治療及腫瘤放療、化療引起的白細胞低下及其他原因引起的白細胞減少症。苦參素具有良好的抗肝炎作用應用苦參素治療慢性B型肝炎的臨床症狀，如乏力、納減和腹脹等，有效率在90％左右。氧化苦參鹼的結構式如下 氧化苦參鹼靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Ley-ss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganodermasinense Zhao，Xu et Zhang的乾燥子實體。性甘，平，歸心、肺、肝、腎經。具有補氣安神，止咳平喘之功效，主要用於眩暈不眠，心悸氣短，虛勞咳嗽。靈芝是家喻戶曉的中藥，俗稱「仙草」。始載於《神農本草經》，被認為能「益心氣」「安精魂」「補肝益氣」「堅筋骨」，列為上品。《本草綱目》認為靈芝有「滋補強壯」「延年益壽」「利關節」「治耳聾」等功效。靈芝能夠扶正固本，增強免疫功能，提高機體免疫力，在整體上雙向調節人體機能平衡，調節機體內部活力，調節人體新陳代謝機能，提高自身免疫力，促進內臟或器官機能正常化。靈芝的主要有效成分為靈芝多糖，靈芝多糖有顯著的增強免疫的作用。
黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)的乾燥根。甘，溫，歸肺、脾經，具有補氣固表、利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌之功效，主要用於氣虛乏力，食少便溏，中氣下陷，久瀉脫肛，便血崩漏，表虛自汗，氣虛水腫，癰疽難潰，久潰不斂，血虛痿黃，內熱消渴；慢性腎炎蛋白病，糖尿病。現代藥理實驗表明黃芪可促進免疫功能，主要有效成分為多糖和皂苷。黃芪多糖可顯著提高機體的免疫力，增強人體細胞的生理代謝作用，顯著促進骨髓造血細胞DNA合成，加快有核細胞分裂過程，對體內血糖水平有雙向調節作用。黃芪皂苷具有抗肝損傷的作用，能減輕肝中毒引起的病變。
目前利用苦參素、靈芝或其提取物和黃芪或其提取物的相互作用，配伍組方用於製備治療肝臟疾病的藥物中的應用還未見報導。

發明內容為了滿足臨床需要，本發明提供了一種新的主要用於製備治療肝臟疾病的藥物的藥物組合物，並提供了其製備方法。
本發明藥物組合物主要由苦參素、靈芝和黃芪製成，其重量份數為苦參素100～1600份、靈芝500～24000份、黃芪1000～80000份；優選為苦參素200～800份、靈芝1000～12000份、黃芪10000～40000份；最佳為苦參素400份、靈芝3000～9000份、黃芪20000份。
上述藥物組合物中靈芝、黃芪可以用適宜的溶劑分別或混合經過提取加工得到其提取物，總提取物再與苦參素和藥學上可接受的輔料混合製成任一臨床上或藥學上可接受的劑型。「單獨提取」是指，靈芝、黃芪每一味藥材分別通過不同的工藝單獨提取得到提取物，再將各提取物混合得到總提取物。「混合提取」是指，靈芝、黃芪兩味藥材一起提取得到總提取物。總提取物中所含的主要有效成分為多糖或多糖和總皂苷，總提取物中主要有效成分的含量不低於30％。
靈芝可以用適宜的溶劑經過提取加工得到靈芝多糖，其中的溶劑優選酸水或乙醇，靈芝多糖的提取方法可以為浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續提取法中的一種或幾種，也可參照文獻方法製備。
本發明提供了靈芝的優選的提取方法如下取靈芝藥材，粉碎成粗粒，加水4倍量潤溼24h後煎煮三次，第一次加12倍量水煎煮3小時，第二次加10倍量水煎煮2小時，第三次加10倍量水煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10～1.15，濾過，濾液用Sevage法除蛋白，濾過，濾液加乙醇至含醇量為60％，攪勻，冷藏靜置24小時，濾過，收集濾餅，加適量的水攪拌溶解，濾過，濾液加乙醇至含醇量為85％，攪勻，冷藏靜置24小時，濾過，收集濾餅，加入適量丙酮、乙醇洗滌反覆洗滌多次，抽濾，沉澱加適量水使溶解，超濾，收集分子量大於50000道爾頓的部分，濃縮，真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的靈芝多糖的得率為0.5～3％，靈芝多糖中多糖的含量不低於80％。
除採用上述方法外，靈芝還可通過以下方法製備，但不僅限於下述方法方法一取靈芝藥材，粉碎成粗粒，加水3倍量潤溼24h後加水煎煮三次，第一次加12倍量水提取3小時，第二、三次加10倍量水提取2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.03～1.08，濾過，濾液用Sevage法除蛋白，濾過，濾液加乙醇使含醇量為70％，攪勻，冷藏放置24小時，濾過，收集濾餅，加適量的水攪拌溶解，濾過，濾液加乙醇使含醇量為85％，攪勻，冷藏放置24小時，濾過，收集濾餅，加入適量丙酮、乙醇洗滌反覆洗滌多次，抽濾，沉澱加適量水使溶解，冷藏放置24小時，濾過收集濾液，濃縮，真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的靈芝多糖的得率為2～4％，靈芝多糖的含量不低於60％。
方法二取靈芝藥材，粉碎成粗粒，加水3倍量潤溼24h後煎煮二次，第一次3小時加水12倍量，第二次2小時加水10倍量，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.02～1.06，濾過，濾液用Sevage法除蛋白，濾過，濾液加乙醇使含醇量為65％，攪勻，冷藏放置24小時，濾過，收集濾餅，加適量水使溶解，濾過，濾液加乙醇使含醇量為80％，攪勻，冷藏放置24小時，濾過，收集濾餅，加適量水使溶解，冷藏放置48小時，濾過，濾液濃縮，真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的靈芝多糖的得率為3～5％，靈芝多糖的含量不低於50％。
現代藥理學實驗表明，黃芪中的黃芪多糖具有提高免疫力活性，黃芪總皂苷具有保肝活性，因此黃芪的「單獨提取」方法因其活性成分的不同可採用不同的提取方法，分別如下本發明組合物中以多糖為主要有效成分的黃芪的製備方法如下取黃芪藥材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，提取液合併，濃縮至提取液體積與生藥材的比例為1.05∶1，加入乙醇沉澱使含醇量達到70％，過濾，得沉澱，沉澱用70％乙醇洗滌，再用適量水溶解，過濾，濾液過大孔樹脂，用水洗脫，收集水洗液，將水洗液濃縮至藥液體積與藥材比例為1∶2.5，加入乙醇使含醇量達到70％，得沉澱，將沉澱用95％乙醇和丙酮洗滌脫水，減壓乾燥(60℃)，即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為0.5～2％，其中多糖的含量不低於50％。
除採用上述方法外，黃芪也可通過以下方法製備，但不僅限於下述方法方法一取黃芪藥材，加水回流提取三次，每次2小時，合併提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15～1.23，加乙醇使含醇量達80％，靜置24小時，濾過，沉澱加水溶解，濾過，再加乙醇使含醇量達85％，靜置24小時，濾過，收集沉澱，真空乾燥即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為2～4％，其中多糖的含量不低於40％。
方法二取黃芪藥材，加10倍量80％乙醇提取4小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，每次2小時，每次加水10倍量，提取液合併，過濾，濾液加乙醇使含醇量達85％，過濾，濾液減壓濃縮至稠膏狀，噴霧乾燥即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為3～4％，其中多糖的含量不低於30％。
本發明組合物中以總皂苷為主要有效成分的黃芪的製備方法如下取黃芪，加水煎煮三次，每次1.5小時，第一次加水10倍量，二、三次均為8倍量，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉澱處理2次，第一次溶液中含醇量為75％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇並濃縮至每1ml相當於原藥材10g，加於已處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用2倍體積的水衝柱，再用4倍體積的70％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮、真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為0.5～2％，總皂苷含量不低於50％，其中黃芪甲苷含量不低於2.0％。
除採用上述方法外，黃芪也可通過以下方法製備，但不僅限於下述方法方法一取黃芪，加水煎煮三次，每次2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉澱處理2次，第一次溶液中含乙醇量為60％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇並濃縮至每1ml相當於原藥材10g，減壓濃縮、真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為3～5％，總皂苷含量不低於30％，其中黃芪甲苷含量不低於1％。
方法二取黃芪，加水煎煮三次，每次1.5小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉澱處理1次使含乙醇量為60％，冷藏放置，回收乙醇並濃縮至每1ml相當於原藥材10g，並減壓濃縮、真空乾燥，即得。
通過本工藝製備的黃芪提取物的得率為2～4％，總皂苷含量為不低於40％，其中黃芪甲苷含量不低於1％。
本發明藥物組合物，可用靈芝多糖、黃芪多糖或黃芪總皂苷分別代替靈芝和黃芪投料製得，按照提取物相對於藥材的得率(靈芝多糖的得率為0.5～3％，黃芪多糖或總皂苷的得率均為0.5～2％)計算，可以有以下兩種不同配比，其重量份數分別為配比1苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪多糖5～1600份；優選為苦參素200～800份、靈芝多糖5～350份、黃芪多糖50～800份；最佳為苦參素400份、靈芝多糖15～250份、黃芪多糖100～400份。
配比2苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪總皂苷5～1600份；優選為苦參素200～800份、靈芝多糖5～350份、黃芪總皂苷50～800份；最佳為苦參素400份、靈芝多糖15～250份、黃芪總皂苷100～400份。
上述配比中，靈芝多糖中多糖的含量不低於50％，最好不低於80％；黃芪多糖中多糖的含量不低於30％，最好不低於50％；黃芪總皂苷中總皂苷的含量不低於30％，最好不低於50％，其中的黃芪甲苷的含量不低於1.0％，最好不低於2.0％。靈芝多糖、黃芪多糖和黃芪總皂苷均可參照前述方法自制。
本發明藥物組合物具有保肝、抗病毒、提高免疫力、抗炎等作用，可以用於治療急慢性肝炎和活動性肝硬化。
本發明還進一步要求保護包括上述藥物組合物作為必需的活性成分與藥學上可接受的載體的藥物組合物，為臨床上或藥學上可接受的任一劑型；可以腸胃外、口服、經皮給藥等方式施用於需要這種治療的患者，優選為口服製劑、注射劑。
用於腸胃外給藥時，可製成注射劑。注射劑係指藥物製成的供注入體內的溶液、乳液或混懸液及供臨用前配製或稀釋成溶液或混懸液的粉末或濃溶液的無菌製劑，注射劑可分為注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液。注射液係指藥物製成的供注射入體內用的無菌溶液型注射液、乳液型注射液或混懸型注射液，可用於肌內注射、靜脈注射、靜脈滴注等；其規格有1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、250ml、500ml等，其中供靜脈滴注用的大體積(一般不小於100ml)注射液也稱靜脈輸液。注射用無菌粉末係指藥物製成的供臨用前用適宜的無菌溶液配製成澄清溶液或均勻混懸液的無菌粉末或無菌塊狀物，可用適宜的注射用溶劑配製後注射，也可用靜脈輸液配製後靜脈滴注；無菌粉末用溶媒結晶法、噴霧乾燥法或冷凍乾燥法等製得。注射用濃溶液係指藥物製成的供臨用前稀釋供靜脈滴注用的無菌濃溶液。
製成注射劑時，可採用現有製藥領域中的常規方法生產，可選用水性溶劑或非水性溶劑。最常用的水性溶劑為注射用水，也可用0.9％氯化鈉溶液或其他適宜的水溶液；常用的非水性溶劑為植物油，主要為供注射用大豆油，其他還有乙醇、丙二醇、聚乙二醇等的水溶液。配製注射劑時，可以不加入附加劑，也可根據藥物的性質加入適宜的附加劑，如滲透壓調節劑、pH值調節劑、增溶劑、填充劑、抗氧劑、抑菌劑、乳化劑、助懸劑等。常用的滲透壓調節劑包括氯化鈉、葡萄糖、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、山梨醇等，優選氯化鈉或葡萄糖；常用的pH值調節劑包括醋酸-醋酸鈉、乳酸、枸櫞酸-枸櫞酸鈉、碳酸氫鈉-碳酸鈉等；常用的增溶劑包括聚山梨酯80、丙二醇、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油等；常用的填充劑包括乳糖、甘露醇、山梨醇、右旋糖酐等；常用的抗氧劑有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等；常用抑菌劑為苯酚、甲酚、三氯叔丁醇等。注射劑常用容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶等。
用於口服時，可製成常規的固體製劑，如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑等；也可製成口服液體製劑，如口服溶液劑、口服混懸劑、糖漿劑等。片劑係指藥物與適宜的輔料混勻壓制而成的圓片狀或異形片狀的固體製劑，以口服普通片為主，另有含片、舌下片、口腔貼片、咀嚼片、分散片、可溶片、泡騰片、緩釋片、控釋片與腸溶片等。膠囊劑係指藥物或加有輔料充填於空心膠囊或密封於軟質囊材中的固體製劑，依據其溶解與釋放特性，可分為硬膠囊(通稱為膠囊)、軟膠囊(膠丸)、緩釋膠囊、控釋膠囊和腸溶膠囊等。丸劑係指藥物與適宜的輔料均勻混合，以適當方法製成的球狀或類球狀固體製劑，包括滴丸、糖丸、小丸等。顆粒劑係指藥物與適宜的輔料製成具有一定粒度的乾燥顆粒狀製劑，可分為可溶顆粒(通稱為顆粒)、混懸顆粒、泡騰顆粒、腸溶顆粒、緩釋顆粒和控釋顆粒等。口服溶液劑係指藥物溶解於適宜溶劑中製成供口服的澄清液體製劑。口服混懸劑係指難溶性固體藥物，分散在液體介質中，製成供口服的混懸液體製劑，也包括幹混懸劑或濃混懸液。糖漿劑係指含有藥物的濃蔗糖水溶液。
製成口服製劑時，可以加入適宜的填充劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等。常用填充劑包括澱粉、糖粉、磷酸鈣、硫酸鈣二水物、糊精、微晶纖維素、乳糖、預膠化澱粉、甘露醇等；常用粘合劑包括羧甲基纖維素鈉、PVP-K30、羥丙基纖維素、澱粉漿、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙甲纖維素、膠化澱粉等；常用崩解劑包括幹澱粉、交聯聚維酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基澱粉鈉、低取代羥丙基纖維素等；常用潤滑劑包括硬脂酸鎂、滑石粉、十二烷基硫酸鈉、微粉矽膠等。
本發明的優點在於1、提供了一種新的製備治療肝臟疾病的藥物的中藥複方，滿足了臨床急需。
2、對本發明藥物組合物進行了藥理學研究，結果表明本發明藥物組合物可極顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清的ALT和AST，對小鼠免疫性肝損傷有顯著的保護作用；對鴨B型肝炎病毒均有極顯著的抑制作用；對慢性肝炎有很好的改善作用；對四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠血清TGFβ1水平顯著降低，大鼠肝組織膠原面積明顯減少。其效果明顯優於靈芝、黃芪和苦參素單獨給藥，提示三者有協同增效的作用。
3、通過本發明組合物不同配比灌胃和注射給藥對小鼠免疫性肝損傷保護作用的研究，篩選出了本發明組合物的優選配比。
4、本發明組合物中的靈芝和黃芪既可由靈芝、黃芪投料製得，也可由靈芝多糖、黃芪多糖或黃芪總皂苷直接投料，並提供了其製備方法，滿足了大生產的需要。
5、對本發明組合物提取物主要有效成分的含量分別進行了限定，便於控制產品的質量。
6、對本發明組合物進行了急性毒性實驗，結果表明本發明組合物毒性小，安全範圍大。
7、對本發明藥物組合物進行的穩定性實驗結果表明各項指標均比較穩定，保證了臨床用藥的安全。
以下通過實驗例來進一步闡述本發明藥物的有益效果。苦參素、靈芝多糖和黃芪多糖的組合物以下簡稱KLH組合物I，苦參素、靈芝多糖和黃芪總皂苷的組合物以下簡稱KLH組合物II。實驗例中所用的靈芝多糖取自實施例1，黃芪多糖取自實施例2，黃芪總皂苷取自實施例3。
實驗例1 KLH組合物合併用藥藥效學研究供試品0.9％生理鹽水，自製；化學純CCl4，成都聯合化工試劑研究所；苦參素注射液，2ml∶0.2g，天津市生物化學製藥廠；靈芝注射液，自製，5ml，含靈芝多糖91.8mg(相當於靈芝6g)；黃芪多糖注射液，自製，5ml，含黃芪多糖214.0mg(相當於黃芪20g)；黃芪總皂苷注射液，自製，5ml，含黃芪總皂苷212.0mg(相當於黃芪20g)；KLH組合物I注射液(苦參素+靈芝+黃芪)不同配比，自製，製備方法參照實施例4；KLH組合物II注射液(苦參素+靈芝+黃芪)不同配比，自製，製備方法參照實施例4。
試劑卡介苗(BCG)，上海生物製品研究所；脂多糖(LPS)，Sigma公司。
受試動物ICR種小鼠，體重16～20g，雌雄各半。
實驗方法取小鼠240隻，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組、模型組、苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組、KLH組合物I不同配比組和KLH組合物II不同配比組，每組10隻。除對照組每鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2ml外，其它各組每鼠尾靜脈注射0.2ml卡介苗(含5×107活菌)。次日起開始治療，對照組和模型組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.5ml，其它各組腹腔注射相應藥物，給藥量見表1。12天後，除對照組給予生理鹽水0.2ml/只尾靜脈注射外，其餘各鼠均由尾靜脈注射脂多糖0.2ml/7.5μg/只。12小時後，眼眶取血，常規分離血清，應用IFCC推薦法測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)活性。
表1 KLH組合物對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST(n＝10)的影響
注與生理鹽水對照組相比，ΔΔp＜0.01；與模型組相比，**p＜0.01；與苦參素組相比，ap＜0.01；與靈芝組相比，bp＜0.01；與黃芪多糖組相比，cp＜0.01；與黃芪總皂苷組相比，dp＜0.01。
實驗結果由表1可知1)與生理鹽水對照組相比，模型組小鼠血清ALT和AST活性極顯著增高(p＜0.01)，說明造模成功。
2)與模型組相比，各給藥組均能極顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清的ALT和AST(p＜0.01)。
3)與苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組單用藥物組相比，KLH組合物I各劑量組注射液效果更顯著(p＜0.01)；與苦參素組、靈芝組、黃芪總皂苷組單用藥物組相比，KLH組合物II各劑量組注射液效果更顯著(p＜0.01)，說明苦參素、靈芝與黃芪三者有協同增效的作用。
結論由實驗結果可知，苦參素、靈芝與黃芪三者合用有協同增效作用。尤其當苦參素∶靈芝∶黃芪＝400∶6000∶20000時效果最好。
實驗例2 KLH組合物對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性的影響供試品0.9％生理鹽水，自製；化學純CCl4，成都聯合化工試劑研究所；苦參素膠囊，0.1g/粒，寧夏博爾泰力藥業股份有限公司；靈芝膠囊，自製，含靈芝多糖91.8mg/粒(相當於靈芝6g)；黃芪多糖膠囊，自製，含黃芪多糖214.0mg/粒(相當於黃芪20g)；黃芪總皂苷膠囊，自製，含黃芪總皂苷212.0mg粒(相當於黃芪20g)；KLH組合物I膠囊(苦參素+靈芝+黃芪)不同配比，自製，製備方法參照實施例9；KLH組合物II膠囊(苦參素+靈芝+黃芪)不同配比，自製，製備方法參照實施例9。
試劑卡介苗(BCG)，上海生物製品研究所；脂多糖(LPS)，Sigma公司。
受試動物ICR種小鼠，體重16～20g，雌雄各半。
實驗方法取小鼠360隻，將小鼠隨機分為生理鹽水對照組、模型組、苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組、KLH組合物I不同配比組和KLH組合物II不同配比組，每組10隻。除生理鹽水對照組每鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2ml外，其它各組每鼠尾靜脈注射0.2ml卡介苗(含5×107活菌)。次日起開始治療，對照組和模型組每鼠每天灌胃生理鹽水0.5ml，其它各組每天灌胃給藥相應藥物，所給藥物給藥前用生理鹽水溶解稀釋成適宜的濃度，給藥量見表2。12天後，除對照組給予生理鹽水0.2ml/只尾靜脈注射外，其餘各鼠均由尾靜脈注射脂多糖0.2ml/7.5μg/只。12小時後，眼眶取血，常規分離血清，應用IFCC推薦法測定血清谷丙轉氨酶(ALT)和穀草轉氨酶(AST)活性。
實驗結果由表2結果可知1)與生理鹽水對照組相比，模型組小鼠血清ALT和AST活性極顯著增高(p＜0.01)，說明造模成功。
2)與模型組相比，各給藥組均能極顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清的ALT和AST(p＜0.01)。
3)與苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組單用藥物組相比，KLH組合物I各劑量組注射液效果更顯著(p＜0.01)，與苦參素組、靈芝組、黃芪總皂苷組單用藥物組相比，KLH組合物II各劑量組注射液效果更顯著(p＜0.01)，說明苦參素、靈芝與黃芪三者有協同增效的作用。
表2 KLH組合物對免疫性肝損傷小鼠血清ALT和AST(n＝10)的影響
注與生理鹽水對照組相比，ΔΔp＜0.01；與模型組相比，**p＜0.01；與苦參素組相比，ap＜0.01；與靈芝組相比，bp＜0.01；與黃芪多糖組相比，cp＜0.01；與黃芪總皂苷組相比，dp＜0.01。
結論由實驗結果可知，苦參素、靈芝與黃芪三者合用有協同增效作用。尤其當苦參素∶靈芝∶黃芪＝400∶6000∶20000時效果最好。
實驗例3 KLH組合物抗B肝病毒實驗研究供試品0.9％生理鹽水，自製；注射用阿昔洛韋，石藥集團中諾藥業(石家莊)有限公司；苦參素膠囊，0.1g/粒，寧夏博爾泰力藥業股份有限公司；靈芝顆粒，自製，含靈芝多糖91.8mg/袋(相當於靈芝6g)；黃芪多糖顆粒，自製，含黃芪多糖214.0mg/袋(相當於黃芪20g)；黃芪總皂苷顆粒，自製，含黃芪總皂苷212.0mg/袋(相當於黃芪20g)；KLH組合物I顆粒劑(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例10；KLH組合物II顆粒劑(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例10。
實驗動物市售1日齡北京鴨DHBV(鴨B型肝炎病毒)陽性血清，復旦大學醫學院微生物學教研室。
動物模型北京鴨經足靜脈注射0.2mlDHBV陽性血清，7d後取血，分離血清，-20℃保存待檢。
實驗方法篩選出感染成功的陽性鴨72隻，隨機分為12組，分別為空白對照組、陽性對照組、苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組、KLH組合物I低、中、高劑量組和KLH組合物II低、中、高劑量組，每組6隻。空白對照組每日灌胃生理鹽水20ml/kg，每日2次，連續14d；給藥組灌胃給藥相應藥物，所給藥物給藥前用生理鹽水溶解稀釋成適宜的濃度，每日2次，劑量見下表，連續14d。陽性藥物作為治療對照組，以(阿昔洛韋)ACV按100mg/kg灌胃，2次/d，給藥2周。分別於用藥前1d(T0)、用藥第7天(T7)，用藥第14天(T14)和停藥後第7天(P7)。自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-20℃保存待檢。
DHBV-DNA檢測方法取上述鴨血清，每批同時點膜，測定鴨血清中DHBV-DNA水平的變化，按缺口翻譯試劑盒說明方法，用32p標記DHBV-DNA探針，並作鴨血清斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，在酶標檢測儀上測定OD值(濾光片波長約490nm)，計算血清DHBV-DNA密度。
實驗結果由表3結果可見1)與生理鹽水對照組比較，陽性對照(阿昔洛韋)組在給藥後第7天和第14天，與給藥前的差異有顯著性(p＜0.01)，但停藥後有反跳現象，與給藥前比較差異無顯著性(p＞0.05)。
2)與生理鹽水對照組比較，苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組四個單獨給藥組在給藥後第7天和第14天，與給藥前的差異有顯著性(p＜0.05)，且停藥後無反跳現象。
3)與生理鹽水對照組比較，KLH組合物I三個不同劑量組、KLH組合物II三個不同劑量組在給藥後第7天和第14天，與給藥前的差異有顯著性(p＜0.01)，且停藥後無回升現象。
4)與苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組單獨給藥組比較，KLH組合物I三個不同劑量組在給藥後第7天和第14天，與給藥前的差異有顯著性(p＜0.05)，與苦參素組、靈芝組、黃芪總皂苷組單獨給藥組比較，KLH組合物II三個不同劑量組在給藥後第7天和第14天，與給藥前的差異有顯著性(p＜0.05)。
表3 KLH組合物對鴨體內DHBV-DNA的抑制作用
注與空白對照組相比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與陽性對照組相比較，#p＜0.05；與苦參素組相比較，ap＜0.05；與靈芝組相比較，bp＜0.05；與黃芪多糖組相比較，cp＜0.05；與黃芪總皂苷組相比較，dp＜0.05。
結論各給藥組對鴨體內DHBV-DNA的抑制作用在給藥後第7天和第14天與給藥前的差異與生理鹽水組比較均有顯著性，但陽性對照組停藥後有反跳現象。本發明藥物組合物療效均優於單用苦參素、靈芝、黃芪多糖和黃芪總皂苷組，效果顯著，且無反跳現象，說明苦參素、靈芝和黃芪三藥合用，有協同增效作用。
實驗例4 對大鼠慢性肝損傷的防護作用實驗動物雄性Wistar大鼠，鼠齡8周，體重(207±21)g供試品0.9％生理鹽水，自製；化學純CCl4，成都聯合化工試劑研究所；苦參素膠囊，0.1g/粒，寧夏博爾泰力藥業股份有限公司；靈芝片，自製，含靈芝多糖91.8mg/片(相當於靈芝6g)；黃芪多糖片，自製，含黃芪多糖214.0mg/片(相當於黃芪20g)；黃芪總皂苷片，自製，含黃芪總皂苷212.0mg/片(相當於黃芪20g)；KLH組合物I注射液(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例8；KLH組合物II注射液(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例8。
實驗方法將216隻大鼠隨機分為正常對照組、模型組、苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組、KLH組合物I各劑量組和KLH組合物II各劑量組，每組大鼠均18隻。除正常對照組外，其餘各組均用50％CCl4-橄欖油1mL/kg後大腿皮下注射，每周2次，共12周，造成大鼠慢性肝損傷，同時分別灌胃給予相應藥物，所給藥物給藥前用生理鹽水溶解稀釋成適宜的濃度，每日1次。正常對照組灌胃等量生理鹽水，每日1次。在實驗的第4，9，12周各組隨機處死6隻大鼠。
標本的留取腹腔注射2.5％戊巴比妥溶液50mg/kg以麻醉，沿腹白線打開腹腔，從下腔靜脈取血，分離血清，-20℃保存；取肝臟10％甲醛固定。
血清學指標檢測ALT用全自動生化測定儀檢測。
統計學處理數據以 表示，用F檢驗和t檢驗處理相應數據。
實驗結果與正常對照組比較，模型組大鼠第4，9，12周的ALT水平均顯著升高(p＜0.01)，說明造模成功；與模型組比較，苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組大鼠第4，9，12周的ALT水平均明顯降低(p＜0.05)；KLH組合物I各劑量組和KLH組合物II各劑量組大鼠第4，9，12周的ALT水平均顯著降低(p＜0.01)。
表4 KLH組合物對慢性肝損傷小鼠的保護作用
注與正常對照組相比，ΔΔp＜0.01；與模型組相比，*p＜0.05，**p＜0.01；與苦參素組相比，ap＜0.05；與靈芝組相比，bp＜0.05；與黃芪多糖組相比，cp＜0.05；與黃芪總皂苷組相比，dp＜0.05。
結論血清ALT活性被廣泛用作臨床診斷肝臟炎性損傷和判斷其臨床療效的敏感指標。由以上結果表明，KLH組合物I和KLH組合物II能抑制肝組織內炎症活動和纖維組織增生，從而對CCl4造成的大鼠慢性幹損傷具有防治作用。
實驗例5 KLH組合物抗大鼠肝纖維化作用受試動物健康雄性SD大鼠，120隻，體重140～160g，隨機分為12組，每組10隻。
供試品0.9％生理鹽水，自製化學純CCl4，成都聯合化工試劑研究所；苦參素注射液，2ml∶0.2g，天津市生物化學製藥廠；靈芝注射液，自製，5ml，含靈芝多糖91.8mg(相當於靈芝6g)；黃芪多糖注射液，自製，5ml，含黃芪多糖214.0mg(相當於黃芪20g)；黃芪總皂苷注射液，自製，5m1，含黃芪總皂苷212.0mg(相當於黃芪20g)；KLH組合物I注射液(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例4；KLH組合物II注射液(苦參素+靈芝+黃芪400mg+6g+20g)，自製，製備方法參照實施例4。
實驗方法將120隻大鼠隨機分為12組，每組10隻，分別為空白對照組、模型照組、苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組、KLH組合物I低、中、高劑量組和KLH組合物II低、中、高劑量組。用CCl4皮下注射法誘導大鼠肝纖維化模型，即用300ml/LCCl4石蠟油溶液，以3ml/kg做皮下注射，每周2次，共8周，空白對照組給予等量生理鹽水皮下注射。各給藥組在造模的同時腹腔注射給藥，給藥量見表5，CCl4模型組造模同時給予生理鹽水腹腔注射，空白對照組給予等體積的生理鹽水。各組動物在最後一次CCl4注射後48h處死，取血清和肝組織標本待驗。
檢測方法血清按照試劑說明書以酶聯免疫吸附法(ELISA)監測TGFβ1水平，肝組織標本以中性福馬林溶液固定、石蠟包埋，以多聚賴氨酸塗布的載玻片製作5μm組織切片，進行HE染色和Massion三重膠原染色作組織病理學檢查；免疫組織化學(immunohistochemistry，IH)方法檢測Smad 3蛋白表達水平，光學顯微鏡下觀察結果。
表5 各組大鼠肝組織檢查結果
注與空白對照組比較，##p＜0.01；與模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與苦參素組相比較，ap＜0.05；與靈芝組相比較，bp＜0.05；與黃芪多糖組相比較，cp＜0.05；與黃芪總皂苷組相比較，dp＜0.05。
實驗結果由表5結果可見1)與空白對照組比較，模型組大鼠血清TGFβ1水平顯著升高(p＜0.01)，說明肝纖維化的形成過程伴隨有TGFβ1合成的顯著增加，從而促進肝臟膠原纖維的合成與沉積；HE染色光鏡下可見模型組大鼠肝細胞廣泛脂肪變性、壞死(p＜0.01)，Masson染色見藍色膠原纖維明顯增加(p＜0.01)；免疫組織化檢測表明模型組大鼠肝組織Smad3蛋白表達明顯增強(p＜0.01)；以上結果均說明造模成功。
2)與模型組相比，苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組四個單獨給藥組TGFβ1水平、組織學積分和肝組織Smad3蛋白表達均明顯降低(p＜0.05)，膠原面積顯著降低(p＜0.01)；KLH組合物I各劑量組、KLH組合物II各劑量組TGFβ1水平、組織學積分、肝組織Smad3蛋白表達和膠原面積均顯著降低(p＜0.01)。
3)與苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組單獨給藥組比較，KLH組合物I各劑量組TGFβ1水平、組織學積分、肝組織Smad3蛋白表達和膠原面積均明顯降低(p＜0.05)，與苦參素組、靈芝組、黃芪總皂苷組單獨給藥組比較，KLH組合物II各劑量組TGFβ1水平、組織學積分、肝組織Smad3蛋白表達和膠原面積均明顯降低(p＜0.05)。
結論與模型組相比，各給藥組預防性治療的大鼠血清TGFβ1水平顯著減少，大鼠肝組織膠原面積明顯減少，Smad3表達陽性率明顯減少；且KLH組合物I各劑量組、KLH組合物II各劑量組的效果優於苦參素組、靈芝組、黃芪多糖組、黃芪總皂苷組四個單獨給藥組。
實驗例6 小鼠注射給藥急性毒性實驗(1)實驗方法供試品KLH組合物注射液I，劑型水針，規格10ml，來源於實施例4；KLH組合物注射液II，劑型水針，規格10ml，來源於實施例4。
受試動物小鼠，每組雌雄各5隻，雄性體重25～28g，雌性體重21～24g。
給藥途徑靜脈注射、腹腔注射。
觀察專案死亡數、一般狀態、體重、剖檢、半數致死劑量。
(2)實驗結果按照急性毒性實驗要求進行預試，腹腔注射及靜脈注射兩給藥途徑皆無法測出藥物的半數致死量，也未見明顯的毒性反應，故進行日最大給藥量實驗。給藥劑量尾靜脈注射0.2ml/10g，腹腔注射0.2ml/10g，一日2次。
死亡數未出現死亡。
一般狀態未見異常變化。
體重於給藥前1天，給藥日，給藥後2、4、6、8、10、12、14天測量；未見異常變化。
剖檢心、肝、肺、腎等組織未見異常變化。
(3)結論本實驗中未出現死亡，KLH組合物注射液I、KLH組合物注射液II對雌雄小鼠靜脈和腹腔注射給藥的最大耐受量為0.4ml/10g，相當於50kg體重人日最大用量20ml的100倍。表明本品低毒，安全性高。
實驗例7 KLH組合物注射液穩定性實驗供試品KLH組合物注射液I，劑型水針，規格10ml，來源於實施例4；KLH組合物注射液II，劑型水針，規格10ml，來源於實施例4。
考察項目性狀、pH值、澄明度、有關物質、標示含量；並在加速實驗6個月和長期實驗期末增加無菌和熱原檢查。
1、影響因素實驗強光照射實驗取供試品，置照度為4500Lx的光照箱內放置10天。
高溫實驗取供試品，分別置於40℃、60℃條件下放置10天。
低溫實驗取供試品，在4℃冰箱中放置10天。
上述實驗，分別於第5、10天取樣測定。比較性狀後測試各項指標，並將結果與0天比較。
結果光照4500Lx條件下放置10天，除有關物質略有升高外，其它各項指標均無明顯變化。高溫60℃條件下放置10天，外觀變為淡黃色澄明液體，標示含量下降，有關物質略有升高。高溫40℃、低溫4℃條件下放置10天，各項指標無明顯變化。
2、加速實驗方法置溫度40℃±2℃、相對溼度75％±5％的條件下放置6個月。在實驗期間分別於第1個月、2個月、3個月、6個月末取樣，比較外觀後，測試各項指標，將結果與0個月比較；並在6個月末增加無菌和熱原檢查。
結果溫度40℃±2℃、相對溼度75％±5％的條件下放置6個月，除有關物質略有增加，標示含量略有下降外，其它各項指標均無明顯變化，加速實驗6個月末，熱原、無菌檢查均符合規定。
3、長期實驗方法置溫度25℃±2℃、相對溼度60％±10％的條件下放置18個月。分別於第3個月、6個月、9個月、12個月、18個月，比較外觀後，測試各項指標，將結果與0個月比較；並在18個月末增加無菌和熱原檢查。
結果溫度25℃±2℃、相對溼度60％±10％的條件下放置18個月，各項指標均無明顯變化，長期實驗18個月末，熱原、無菌檢查均符合規定。
結論由上述考察結果得出結論，各項實驗中，本發明藥物組合物注射液比較穩定。
具體實施方式以下通過實施例來進一步闡述本發明藥物組合物的製備方法，但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。以下實施例中各劑型的輔料可以用藥學上可接受的輔料替換，或者減少、增加。以下實施例4～11中的靈芝多糖取自實施例1，黃芪多糖取自實施例2，黃芪總皂苷取自實施例3。
實施例1 靈芝多糖的製備取靈芝藥材，粉碎成粗粒，加水4倍量潤溼過夜，次日煎煮三次，第一次加12倍量水煎煮3小時，第二次加10倍量水煎煮2小時，第三次加10倍量水煎煮1小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10～1.15，濾過，濾液用Sevage法除蛋白，濾過，濾液加乙醇至含醇量為60％，攪勻，冷藏靜置24小時，濾過，收集濾餅，加適量的水攪拌溶解，濾過，濾液加乙醇至含醇量為85％，攪勻，冷藏靜置24小時，濾過，收集濾餅，加入適量丙酮、乙醇洗滌反覆洗滌多次，抽濾，沉澱加適量水使溶解，超濾，收集分子量大於50000道爾頓的部分，濃縮，真空乾燥，即得。
鑑別取本品50mg，加乙醇25ml，加熱回流30分鐘，濾過，濾液蒸乾，殘渣加甲醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取靈芝對照藥材2g，同法製成對照藥材溶液。照薄層色譜法實驗，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點於同一矽膠G板上，以石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾乾，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
含量測定對照品溶液的製備精密稱取105℃乾燥至恆重的葡萄糖對照品適量，加水製成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
標準曲線的製備 分別靜密吸取對照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，置10ml具塞試管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液(靜密稱取蒽酮0.1g，加80％硫酸溶液100ml使溶解，搖勻)6ml，搖勻，置水浴中加熱15分鐘，取出，放入水浴中冷卻15分鐘，以相應的溶劑為空白，在625nm下測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。
供試品溶液的製備取本品20mg，置50ml量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻即得。
測定法精密吸取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，照標準曲線下測定方法，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液的葡萄糖的重量，計算，即得。
根據上述工藝，製得靈芝多糖三批樣品，其得率和含量見下表。
表6 靈芝多糖得率和含量測定結果
實施例2 黃芪多糖的製備取黃芪藥材，加7倍量70％乙醇提取二次，每次2小時，提取液棄去，取藥渣加水提取二次，提取液合併，濃縮至提取液體積與生藥材的比例為1.05∶1，加入乙醇沉澱使含醇量達到70％，過濾，得沉澱，沉澱用70％乙醇洗滌，再用適量水溶解，過濾，濾液過大孔樹脂，用水洗脫，收集水洗液，將水洗液濃縮至藥液體積與藥材比例為1∶2.5，加入乙醇使含醇量達到70％，得沉澱，將沉澱用95％乙醇和丙酮洗滌脫水，減壓乾燥(60℃)，即得。
鑑別(1)取本品約0.2g，加水5ml溶解後，加鹼性酒石酸銅試液5滴，加熱即產生紅色沉澱，冷卻，濾過，取濾液加鹽酸1滴使成酸性，水浴加熱10分鐘，放冷，調節pH值至中性，加鹼性酒石酸銅試液0.5ml，水浴加熱即產生紅色的氧化亞銅沉澱。
(2)取本品約0.2g，加水2ml溶解後，加5％α-萘酚乙醇溶液0.5ml搖勻，緩緩加入硫酸3ml，兩液面交界處顯紫紅色環。
含量測定標準溶液的製備稱取經105℃乾燥至恆重的葡萄糖100mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水溶解，並稀釋至刻度，搖勻。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。
標準曲線繪製精密量取標準溶液0.1ml～0.6ml共6份，分別置25ml量瓶中，加水至2.0ml，並加苯酚溶液(取苯酚300g，鋁片0.3g，碳酸氫鈉0.15g，混合蒸餾，收集182℃餾分，配製成5％水溶液)1.0ml，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0ml，搖勻，放置5min，置水浴中加熱15min，取出，迅速冷卻至室溫，另以2.0ml水同上平行操作作為空白對照，在490nm波長處測定吸收值，計算回歸方程。
測定方法取黃芪提取物0.5g置25ml量瓶中，照標準曲線繪製項下的方法自「加水至2.0ml」起，依法測定吸收值，依回歸方程計算多糖的含量。
根據上述工藝，製得黃芪提取物三批樣品，其得率和含量見下表。
表7 黃芪多糖的得率和含量測定結果
實施例3 黃芪總皂苷的製備取黃芪，加水煎煮三次，每次1.5小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.25(60℃)，用乙醇沉澱處理2次，第一次溶液中含醇量為75％，第二次為85％，每次均冷藏放置，回收乙醇並濃縮至每1ml相當於原藥材10g，用注射用水稀釋至每1ml相當於原藥材1g，冷藏放置12小時，濾過，濾液減壓濃縮、真空乾燥，即得。
分別製得三批黃芪總皂苷，提取物得率和含量結果見下表6。
鑑別一取本品0.01g，加甲醇20ml，加熱回流1小時，濾過，濾液加於中性氧化鋁柱(100～120目，5g，內徑10～15mm)上，用40％甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸乾，殘渣加水30ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合併正丁醇液；用水洗滌2次，每次20ml；棄去水液，正丁醇液蒸乾，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇製成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各2μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以三氯甲烷—甲醇—水(13∶7∶2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，涼幹，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點；紫外光燈(365nm)下顯相同的橙黃色螢光斑點。
鑑別二取本品0.01g，加乙醇30ml，加熱回流20分鐘，濾過，濾液加0.3％氫氧化鈉溶液15ml使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調節pH值至5～6，用乙酸乙酯15ml振搖提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸乾，殘渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材2g，同法製成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以三氯甲烷—甲醇(10∶1)作為展開劑，展開，取出，涼幹，置氨蒸氣中燻後置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光主斑點。
含量測定總皂苷的含量測定對照品溶液的製備 精密稱取於105℃乾燥至恆重的黃芪甲苷對照品約10mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含黃芪甲苷幹品0.1mg)。
供試品溶液的製備取本品0.1g，精密稱定，加水25ml使溶解，移至分液漏鬥中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20ml，合併正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次10ml，棄去水液，正丁醇至水浴上蒸乾，殘渣加甲醇溶解，移至25ml量瓶中，並加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
測定法精密量取對照品溶液、供試品溶液各1ml，置25ml納氏比色管，置水浴中蒸乾，放冷，加新鮮配製的5％香草醛—冰醋酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，搖勻，放置5分鐘，置沸水浴中顯色15分鐘，取出，立即置冰浴中冷卻至室溫，加入8ml冰醋酸，搖勻，在538nm波長處測定吸光度，計算，即得。
黃芪甲苷的含量測定色譜條件與系統適用性實驗 以十八烷基鍵合矽膠為填充劑；以乙腈—水(32∶68)為流動相；蒸發光散射檢測器。理論板數以黃芪甲苷峰計算不低於4000。
對照品溶液的製備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
供試品溶液的製備 精密稱取本品0.04g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4小時，提取液回收溶劑並濃縮至幹，殘渣加水10ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40ml，合併正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40ml，棄去氨液，正丁醇液蒸乾，殘渣加水5ml使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5cm，長12cm)，以水50ml洗脫，棄去水液，再用40％乙醇30ml洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇80ml洗脫，收集洗脫液，蒸乾，用甲醇溶解並轉移至5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液10μl、20μl與供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點對數方程計算，即得。
根據上述工藝，製得黃芪提取物三批樣品，其得率和含量見下表。
表8 黃芪總皂苷的得率和含量測定結果
實施例4 KLH組合物水針劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g注射用水 加至10000ml
共製備 1000支
KLH組合物I處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 45.9g(相當於靈芝3kg)黃芪多糖 428.0g(相當於黃芪40kg)聚山梨酯80 20g注射用水 加至10000ml
共製備 1000支KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 50g注射用水 加至10000ml
共製備 1000支KLH組合物II處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪總皂苷 106.0g(相當於黃芪10kg)聚山梨酯80 50g注射用水 加至10000ml
共製備 1000支製備工藝提前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水衝洗；將靈芝多糖加入配液量30％的注射用水中加熱攪拌溶解完全；將苦參素和黃芪多糖(或黃芪總皂苷)加入少量注射用水，加入處方量的聚山梨酯80加熱攪拌溶解；合併上述溶液，補加注射用水至全量；加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘；經砂濾棒過濾脫炭。測定並調節溶液的pH值；經0.45um的微孔濾膜精濾；檢查溶液的澄明度，半成品化驗；將溶液熔封於玻璃安瓿中；100℃流通蒸汽滅菌30分鐘；趁熱將樣品放入0.01％的亞甲藍溶液中檢漏；燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實施例5 KLH組合物粉針劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g甘露醇 400g無菌注射用水 加至5000ml
共製備 1000支
KLH合物I處方2苦參素 200.0g靈芝多糖 45.9g(相當於靈芝3kg)黃芪多糖 428.0g(相當於黃芪40kg)聚山梨酯80 20g甘露醇 400g無菌注射用水 加至5000ml
共製備 1000支KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g甘露醇 400g無菌注射用水 加至5000ml
共製備 1000支KLH組合物II處方2苦參素 200.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g甘露醇 400g無菌注射用水 加至5000ml
共製備 1000支製備工藝首先將配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，膠塞等進行無菌處理；按照處方量稱取原、輔料；將靈芝多糖加入配液量30％的注射用水中加熱攪拌溶解完全，將苦參素和黃芪多糖(或黃芪總皂苷)加入少量注射用水，加入處方量的聚山梨酯80加熱攪拌溶解，合併上述溶液，補加無菌注射用水至全量；加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘；經砂濾棒過濾脫炭。測定並調節溶液的pH值；經0.22um的微孔濾膜精濾；檢查溶液的澄明度，半成品化驗；分裝於抗生素玻璃瓶中，半壓塞。將樣品放入凍幹機中冷凍乾燥。預凍-45℃5小時，低溫真空乾燥-45℃～0℃20小時，然後升溫至25℃真空乾燥3小時；凍乾結束，壓塞，軋蓋；成品全檢，包裝入庫。
實施例6 KLH組合物氯化鈉輸液的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g氯化鈉 900g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物I處方2苦參素 200.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪多糖 107.0g(相當於黃芪10kg)聚山梨酯80 20g氯化鈉 900g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物Ⅱ處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g氯化鈉 900g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物II處方2苦參素 800.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g氯化鈉 900g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶製備工藝前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水衝洗；將靈芝多糖加入配液量30％的注射用水中加熱攪拌溶解完全，將苦參素和黃芪多糖(或黃芪總皂苷)加入少量注射用水，加入處方量的聚山梨酯80加熱攪拌溶解，將氯化鈉用適量注射用水溶解完全，合併上述溶液，補加注射用水至全量；加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘；經砂濾棒過濾脫炭。測定並調節溶液的pH值；經0.45um的微孔濾膜精濾；檢查溶液的澄明度，半成品化驗；灌裝於100ml的輸液瓶中；115℃熱壓滅菌30分鐘；燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實施例7 KLH組合物葡萄糖輸液的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g葡萄糖 5000g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物I處方2苦參素 800.0g靈芝多糖 45.9g(相當於靈芝3kg)黃芪多糖 428.0g(相當於黃芪40kg)聚山梨酯80 20g葡萄糖 5000g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g葡萄糖 5000g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶KLH組合物II處方2苦參素 800.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪總皂苷 106.0g(相當於黃芪10kg)聚山梨酯80 20g葡萄糖 5000g注射用水 加至100000ml
共製備 1000瓶製備工藝提前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水衝洗；將靈芝多糖加入配液量30％的注射用水中加熱攪拌溶解完全，將苦參素和黃芪多糖(或黃芪總皂苷)加入少量注射用水，加入處方量的聚山梨酯80加熱攪拌溶解，合併上述溶液；將葡萄糖用配液量40％的注射用水溶解完全，加熱煮沸15分鐘；合併上述溶液，補加注射用水至全量；加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘；經砂濾棒過濾脫炭。測定並調節溶液的pH值；經0.45um的微孔濾膜精濾；檢查溶液的澄明度，半成品化驗；灌裝於100ml的輸液瓶中；115℃熱壓滅菌30分鐘；燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實施例8 KLH組合物片劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)澱粉 40g微晶纖維素 40g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g羧甲澱粉鈉 10.0g
.共製備 2000片KLH組合物I處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 107.0g(相當於黃芪10kg)澱粉 40g微晶纖維素 40g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g羧甲澱粉鈉 10.0g
.共製備 2000片KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)澱粉 40g微晶纖維素 40g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g羧甲澱粉鈉 10.0g
共製備 2000片KLH組合物II處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 424.0g(相當於黃芪40kg)澱粉 40g微晶纖維素 40g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g羧甲澱粉鈉 10.0g
共製備 2000片製備工藝將靈芝多糖、黃芪多糖(或黃芪總皂苷)和若參素分別粉碎過100目篩備用；按照處方量稱取原、輔料；將羥丙甲纖維素溶於水中製成2％的水溶液備用；將黃芪多糖(或黃芪總皂苷)、苦參素、靈芝多糖、澱粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC水溶液適量，攪拌均勻，製成適宜軟材；過20目篩制顆粒；60℃的條件下烘乾；乾燥好的顆粒加入硬脂酸鎂和羧甲澱粉鈉，過18目篩整粒，混合均勻；取樣，半成品化驗；按照化驗確定的片重壓片；成品全檢，包裝入庫。
實施例9 KLH組合物膠囊劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)澱粉 20.0g微晶纖維素 60.0g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂5.0g
共製備 2000粒KLH組合物I處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 45.9g(相當於靈芝3kg)黃芪多糖 107.0g(相當於黃芪10kg)澱粉 20.0g微晶纖維素 60.0g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g
共製備 2000粒KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)澱粉 20.0g微晶纖維素 60.0g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g
共製備 2000粒
KLH組合物II處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 45.9g(相當於靈芝3kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)澱粉 20.0g微晶纖維素 60.0g2％HPMC水溶液適量硬脂酸鎂 5.0g
共製備 2000粒製備工藝將靈芝多糖、黃芪多糖(或黃芪總皂苷)和苦參素分別粉碎過100目篩備用；按照處方量稱取原、輔料；將羥丙甲纖維素溶於水中製成2％的水溶液備用；將黃芪多糖(或黃芪總皂苷)、苦參素、靈芝多糖、澱粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC水溶液適量，攪拌均勻，製成適宜軟材；過20目篩制顆粒；顆粒在60℃的條件下烘乾；乾燥好的顆粒加入硬脂酸鎂，過18目篩整粒，混合均勻；取樣，半成品化驗；按照化驗確定的裝量裝入膠囊；成品全檢，包裝入庫。
實施例10 KLH組合物顆粒劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)糖粉 900.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量共製備 1000包KLH組合物I處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 107.0g(相當於黃芪10kg)糖粉 900.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量共製備 1000包KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)糖粉 900.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量共製備 1000包
KLH組合物II處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)糖粉 900.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量共製備 1000包製備工藝將蔗糖粉碎過100目篩備用，將靈芝多糖、黃芪多糖(或黃芪總皂苷)和苦參素分別粉碎過100目篩備用；按照處方量稱取原、輔料；將靈芝多糖、黃芪多糖(或黃芪總皂苷)、苦參素與糖粉以等量遞加的方法混合均勻，加入2％HPMC50％乙醇溶液適量，攪拌均勻，製成適宜軟材，過20目篩制顆粒；顆粒在60℃的條件下烘乾；幹顆粒過18目篩整粒；取樣，半成品化驗顆粒中主藥的含量，確定裝量；包裝，成品全檢，包裝入庫。
實施例11 KLH組合物口服液體劑的製備KLH組合物I處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪多糖 214.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g苯甲酸鈉 15g甜菊甙 20g純化水 加至10000ml
共製備 1000支KLH組合物I處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪多糖 107.0g(相當於黃芪10kg)聚山梨酯80 20g苯甲酸鈉 15g甜菊甙 20g純化水 加至10000ml
共製備 1000支KLH組合物II處方1苦參素 400.0g靈芝多糖 91.8g(相當於靈芝6kg)黃芪總皂苷 212.0g(相當於黃芪20kg)聚山梨酯80 20g苯甲酸鈉 15g甜菊甙 20g純化水 加至10000ml
共製備 1000支
KLH組合物II處方2苦參素 400.0g靈芝多糖 137.7g(相當於靈芝9kg)黃芪總皂苷 106.0g(相當於黃芪10kg)聚山梨酯80 20g苯甲酸鈉 15g甜菊甙 20g純化水 加至10000ml
共製備 1000支製備工藝將靈芝多糖加入配液量30％的水中加熱攪拌溶解完全，將苦參素和黃芪多糖(或黃芪總皂苷)加入少量水，加入處方量的聚山梨酯80加熱攪拌溶解，合併上述溶液；將苯甲酸鈉和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全；合併上述兩個溶液，補加水至全量；過0.8um的微孔濾膜過濾；半成品化驗；灌裝，成品全檢，包裝入庫。
權利要求
1.一種藥物組合物，其特徵在於，製成該組合物所含有效成分的原料藥的組成為苦參素100～1600份、靈芝500～24000份、黃芪1000～80000份。
2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，原料藥的重量份數為苦參素200～800份、靈芝1000～12000份、黃芪10000～40000份。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於，原料藥的重量份數為苦參素400份、靈芝3000～9000份、黃芪20000份。
4.如權利要求1～3所述的任一藥物組合物的製備方法，其特徵在於，所述的靈芝和黃芪可以用適宜的溶劑和方法單提或混提製備得到總提取物，總提取物再與苦參素和藥學上可接受的輔料混合製成任一製劑，總提取物中所含的主要有效成分為多糖或多糖和總皂苷，主要有效成分的總含量不低於30％。
5.如權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，該組合物還可以由下列原料藥製成苦參素、靈芝多糖和黃芪多糖或黃芪總皂苷，其重量配比為苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪多糖5～1600份；或者為苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪總皂苷5～1600份。
6.如權利要求5所述的藥物組合物，其特徵在於，其原料藥的重量配比為苦參素200～800份、靈芝多糖5～350份、黃芪多糖50～800份；或者為苦參素200～800份、靈芝多糖5～350份、黃芪總皂苷50～800份。
7.如權利要求6所述的藥物組合物，其特徵在於，其原料藥的重量配比為苦參素400份、靈芝多糖15～250份、黃芪多糖100～400份；或者為苦參素400份、靈芝多糖15～250份、黃芪總皂苷100～400份。
8.如權利要求5～7所述的任一藥物組合物，其特徵在於，所述的靈芝多糖中多糖的含量不低於50％；所述的黃芪多糖中多糖的含量不低於30％；所述的黃芪總皂苷中總皂苷的含量不低於30％，其中黃芪甲苷的含量不低於1％。
9.如權利要求1～3、5～7所述的任一藥物組合物，其特徵在於，該藥物組合物可以與藥學上可接受的輔料混合製成任何一種臨床上或藥學上可接受的劑型。
10.如權利要求1～3、5～7所述的任一藥物組合物在製備治療肝臟疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於醫藥技術領域，公開了一種新的藥物組合物及其製備方法，該藥物組合物主要由苦參素、靈芝和黃芪製成，其重量配比為苦參素100～1600份、靈芝500～24000份、黃芪1000～80000份。或者由苦參素、靈芝多糖、黃芪多糖或黃芪總皂苷製成，其重量配比為苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪多糖5～1600份；或者為苦參素100～1600份、靈芝多糖2.5～700份、黃芪總皂苷5～1600份。該藥物組合物可以製成各種藥學上可接受的劑型，優選注射劑或口服製劑。該藥物組合物具有保肝、抗病毒、提高免疫力、抗炎等作用，可以用於製備治療急慢性肝炎和活動性肝硬化的藥物。
文檔編號A61P31/20GK1977886SQ20061016345
公開日2007年6月13日 申請日期2006年12月4日 優先權日2005年12月5日
發明者黃振華 申請人:黃振華