空腸彎曲桿菌的聚合酶鏈反應檢測方法
2023-05-25 03:38:36 2
專利名稱：空腸彎曲桿菌的聚合酶鏈反應檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種人獸共患病病原一空腸彎曲桿菌的檢測方法，具體涉及一 種空腸彎曲桿菌的聚合酶鏈反應(PCR)檢測方法，屬於醫學生物技術領域。
背景技術：
空腸彎曲桿菌(C"m/7_y/Wa"w "/)是彎曲菌屬的一種，是近十幾年來受 到國內外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要可引起人體急性腸炎和食物中毒,並
伴發反應性關節炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利綜合症等免疫性損傷性疾病。 在獸醫學上，可引起家畜流產不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎。該菌通 過動物帶菌者或患病者的糞便進入環境中，並在水環境中可以進入一種稱為"活 的非可培養"(Viable butnonculturer-able， VBNC)狀態的休眠期，處於VBNC 狀態的細菌在特定條件下可以復甦且具有致病性。接觸畜禽類，或食入受到汙 染的禽製品、水源和牛奶是該菌感染人體的主要途徑。世界衛生組織己將該病 列為最常見的食源性傳染病之一。
空腸彎曲桿菌培養條件苛刻，在25'C不生長，42t:生長良好容易進入狀態
VBNC,使得常規的分離培養和生化鑑定耗時費力、靈敏度不高，所需時間長(一 般需要48-72 h)，而不利於暴發疫情的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測所要 求的快速、準確的原則。近年來，PCR方法取得了長足發展，它具有靈敏度高、 特異性強、檢測快速等優點。然而，國內外所報導的PCR方法對空腸彎曲桿菌 和結腸彎曲桿菌的鑑別存在特異性不高的缺陷。因此，建立一種能檢測動物及 其產品中空腸彎曲桿菌的快速、簡潔、準確的PCR方法，以實現對致病性空腸 彎曲桿菌簡便、快速、準確的檢測,對有效控制和預防該類食源性傳染病意義重 大。
發明內容
本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種空腸彎曲桿菌的聚合酶
鏈反應檢測方法，能快速、簡潔、準確的檢測動物產品中的空腸彎曲桿菌。
為實現這一目的，本發明採用了一種菌落PCR方法，首先對空腸彎曲桿菌 進行微需氧分離培養，獲得可疑空腸彎曲桿菌，再挑取單個可疑菌落溶於專用 於溶解空腸彎曲桿菌的緩衝液(K Buffer)中，煮沸離心後，取上清作為PCR 的模板，然後根據空腸彎曲桿菌VS1基因序列中的保守片段設計一對特異性引 物進行PCR反應，反應產物用瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現516bp條帶即為陽性 結果。
本發明的方法具體步驟如下
1、 可疑菌落分離培養無菌取動物組織裝入滅菌器皿中，作為待檢樣品； 將組織搗碎勻漿，先以0.65um的微孔濾膜過濾，直接劃線接種在選擇培養基平 板上，置於微需氧培養裝置中42 "C進行培養。
2、 挑取可疑菌落從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可疑 菌落不溶血，灰白色、棕黃色(可能出現淺紅色)，扁平、溼潤、有光澤，半 透明看上去像水滴，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；II型可 疑菌落也不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為l 2mm)，邊緣完整、發亮。
3、 PCR模板的製備挑取I型或II型可疑菌落，溶於專用於溶解空腸彎曲杆 菌的緩衝液中，混勻後煮沸，離心取上清作為PCR的模板。所述專用於溶解空 腸彎曲桿菌的緩衝液成分K buffer 50 mM KC1， 10mM Tris pH 8.0, 2.5 mM MgC12， 0.5%Tween20， 100 ug/ml proteinase K。
4、 PCR引物設計與合成根據網上 (http:〃www.sanger.ac,uk/Projects/CJejuni/)公布的空腸彎曲桿菌VS1基因序列
中的i呆守片段設計一對牛寺異引物VS-F:5， TAC GAT TTG TTT CATTG 3'， VS-R: 5'ATTTCTTTAGCAGGCATA 3，。
5、 可疑菌落的PCR檢測利用特異引物按照常規方法進行PCR擴增，擴 增出的DNA片段長度為516bp。
6、 PCR擴增產物的鑑定取PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳，取膠置於凝膠 成像系統拍攝和分析，在516bp處出現條帶，即可確定樣品為空腸彎曲桿菌。
本發明方法直接從可疑菌落檢測空腸彎曲桿菌，省去了增菌培養環節，設 計的引物也增加了 PCR檢測方法的靈敏度和特異性，解決了常規方法檢測空腸
彎曲桿菌時間長的難點，為畜、禽及其產品中空腸彎曲桿菌檢測提供了快速、
簡潔、準確可靠的檢測方法，適合基層單位推廣應用。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步詳細描述。以下實施 例不構成對本發明的限定。 實施例1
1、 可疑菌落分離培養無菌條件下取雞肝臟，裝入加適量滅菌生理鹽水的 青黴素瓶中，先以0.65 um的微孔濾膜過濾，直接劃線接種在改良Camp—BAP 選擇培養基平板上，置於微需氧培養裝置中42 'C進行培養。
2、 挑取可疑菌落從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可 疑菌落不溶血，灰白色、棕黃色、扁平、溼潤、有光澤，呈半透明水滴狀，凸 起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；II型可疑菌落也不溶血，圓形、 有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為1 2mm)，邊緣完整、發 亮。上述菌落均可以作為空腸彎曲桿菌的可疑菌落進行進一步鑑定。
3、 PCR模板的製作挑取一個可疑的I型菌落，溶於80ul專用於溶解空 腸彎曲桿菌的緩衝液中(K buffer 50 mM KC1， 10mM Tris pH 8.0, 2.5 mM MgC12， 0.5 % Tween 20， 100 ug/ml proteinase K)，混勻後煮沸10分鐘，然後離心5分 鍾，取5pl上清液作為PCR的模板。
4、 PCR引物設計與合成
根據網上(http:〃www.sanger.ac.uk/Projects/CJejuni/)公布的空腸彎曲桿菌 VS1基因序列中的保守片段，用Premier5.0軟體設計一對特異引物。序列如下 VS-F: 5' TACGATTTGTTTCATTG 3' VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，。
5、 可疑I型菌落的PCR檢測擴增反應總體積為25^1，其中滅菌重蒸水
8.5^1， PCRMasterMix 12.5nl (包括DNATaqE、 dNTP、 buffer、 Mg+2)， 20pmo1/ L引物(VS-F: 5' TACGATTTGTTTCATTG3'， VS-R:5， ATTTCTTTAGCAGGC ATA 3')各lpl，模板DNA5p1.，置DNA擴增儀上進行PCR反應。循環參 數為94°C預變性5 min， 94 °C 30 S， 55 °C 60S， 72 °C 60S,共35個循環，最 後72'C延伸10min。
擴增出的DNA片段長度為516bp。
6、 PCR擴增產物的鑑定按常規方法配置1%的瓊脂糖凝膠。按0.5mg/L 加溴化乙綻(EB)制膠。取5^1 PCR產物和1^1 l(Moading buffer混合加樣。用 DL2000 Marker對照。90V電壓電泳40min。取膠置於凝膠成像系統拍攝和分析， 結果顯示，在516bp處出現清晰條帶，雖有模糊的雜帶背景，但可以基本確定 樣品中含有空腸彎曲桿菌。 實施例2
1、 可疑菌落分離培養無菌條件下取豬盲腸裝入加適量滅菌生理鹽水的青 黴素瓶中，先以0.65um的微孔濾膜過濾，直接劃線接種在改良Camp—BAP選 擇培養基平板上，置於微需氧培養裝置中42T進行培養。
2、 挑取可疑菌落從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可 疑菌落不溶血,灰白色、棕黃色(可能出現淺紅色)、扁平、溼潤、有光澤,半透 明看上去像水滴，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；II型可疑 菌落也不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的單個菌落(直徑為1 2mm)，邊緣完整、發亮。
3、 PCR模板的製作挑取一個可疑II型菌落，溶於80ul專用於溶解空腸 彎曲桿菌的緩衝液中(K buffer 50 mMKCl， 10mM Tris pH 8.0， 2.5mMMgC12， 0.5 % Tween 20， 100 ug/ml proteinase K)，混勻後煮沸10分鐘，然後離心5分 鍾，取5 ul上清液作為PCR的模板。
4 、 PCR引物設計與合成
根據網上(http:〃www.sanger.ac.uk/Projects/CJejuni/)公布的空腸彎曲桿菌 VS1基因序列中的保守片段，用Premier 5. 0軟體設計一對特異引物。引物序列如下
VS-F: 5' TAC GAT TTG TTT CAT TG 3' VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，。
5、 可疑II型菌落的PCR檢測擴增反應總體積為25pl，其中滅菌重蒸水 8.5(il， PCRMasterMix 12.5^1 (包括DNATaqE、 dNTP、 buffer、 Mg+2)， 20pmol/ L引物(VS-F: 5' TAC GAT TTG TTT CAT TG 3 ，， VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，) 各lpl，模板DNA5(x1.，置DNA擴增儀上進行PCR反應。循環參 數為94°C預變性5 min， 94 °C 30 S， 58 °C 60S， 72 °C 60S,共35個循環，最 後72。C延伸10min。
擴增出的DNA片段長度為516bp。
6、 PCR擴增產物的鑑定按常規方法配置1%的瓊脂糖凝膠。按0.5mg/L 加溴化乙錠(EB)制膠。取5pl PCR產物和1 pi 1 (Moading buffer混合加樣。用 DL2000 Marker對照。90V電壓電泳40min。取膠置於凝膠成像系統拍攝和分析， 結果顯示，在516bp處出現清洗條帶，因而確定樣品中含有空腸彎曲桿菌。該 步驟中退夥溫度改為58"C，背景無雜帶，表現出很強的特異性。
權利要求
1、一種空腸彎曲桿菌的聚合酶鏈反應檢測方法，其特徵在於包括如下步驟1)無菌取動物組織作為待檢樣品裝入滅菌器皿中，將動物組織搗碎勻漿後以0.65um的微孔濾膜過濾，直接劃線接種在選擇培養基平板上，置於微需氧培養裝置中42℃進行培養；2)從樣品培養所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可疑菌落不溶血，灰白色、棕黃色或淺紅色，扁平、溼潤、有光澤，半透明，凸起、光滑，邊緣不整有從接種線向外擴散的傾向；II型可疑菌落不溶血，圓形、有光澤、半透明，常呈分散凸起的直徑為1～2mm的單個菌落，邊緣完整、發亮；3)將挑取的I型或II型可疑菌落溶於專用於溶解空腸彎曲桿菌的緩衝液中，混勻後煮沸，離心取上清作為聚合酶鏈式反應PCR的模板；所述專用於溶解空腸彎曲桿菌的緩衝液成分K buffer 50mM KCl，10mM Tris pH 8.0，2.5mMMgCl2，0.5％Tween 20，100ug/ml proteinase K；4)根據空腸彎曲桿菌VS1基因序列中的保守片段設計一對特異引物VS-F5』TAC GAT TTG TTT CAT TG 3』，VS-R5』ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3』；5)利用特異引物進行PCR擴增，擴增出的DNA片段長度為516bp；6)取PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳，取膠置於凝膠成像系統拍攝和分析，在516bp處出現條帶，即確定樣品為空腸彎曲桿菌。
全文摘要
本發明涉及一種空腸彎曲桿菌的聚合酶鏈反應檢測方法，先對空腸彎曲杆進行微需氧分離培養，挑取可疑菌落溶於專用於溶解空腸彎曲桿菌的緩衝液中，煮沸離心後，取上清作為PCR的模板，然後根據空腸彎曲桿菌VS1基因序列中的保守片段設計一對特異性引物進行PCR反應，反應產物用瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現516bp條帶即為陽性結果。本發明方法直接從可疑菌落檢測空腸彎曲桿菌，省去了增菌培養環節，設計的特異性引物也增加了PCR檢測方法的靈敏度和特異性，解決了常規方法檢測空腸彎曲桿菌時間長的難點，為畜、禽及其產品中空腸彎曲桿菌檢測提供了可靠的快速檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101353699SQ20081004278
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月11日 優先權日2008年9月11日
發明者侯建軍, 華修國, 吳忠亮, 毅 姜, 朱建國 申請人:上海交通大學