檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條及其製備方法
2023-05-25 18:43:01
專利名稱：檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條及其製備方法
技術領域：
本發明涉及赤羽病抗體的檢測試劑，具體涉及檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條及 其製備方法。
背景技術：
赤羽病又稱阿卡斑病，由阿卡斑病毒(AKAV)引起，可導致流產、早產、死產以及 產出先天性關節彎曲-積水性無腦症候群胎兒，是牛的四大流產病之一，我國農業部也將 該病列為禁止進出境的重要傳染病。該病分布於熱帶和溫帶地區，李昌林等0994年對全 國2639份牛、羊血清進行檢測，牛陽性率為39. 18%，羊的陽性率為12.6%，且南方的陽性 率比北方高。衛龍興等19999年對上海兩家流產率較高的奶牛場進行抽樣調查，陽性率竟 高達92. 85%。1996年-1997年上海爆發本病，牛場中流產、早產、死產和畸形胎兒約佔 20%-30%，給牧場帶來巨大損失。從上述數據可以看出，這種病在我國南方已經流行，個別 地區還相當嚴重，已經給養牛業造成嚴重損失。目前，我國檢測赤羽病抗體的方法主要是瓊 脂免疫擴散試驗、病毒中和試驗和酶聯免疫試驗(ELISA)。瓊脂免疫擴散試驗特異性很好， 但靈敏度不高；病毒中和試驗中細胞易受汙染，檢測周期長；酶聯免疫試驗試劑昂貴，且需 配套儀器。上述三種方法均能夠準確檢測到赤羽病抗體，但具體操作複雜，均需要較為熟練 的專業技術人員和配備相應的儀器設備，不利於基層赤羽病快速驗放，尤其是養殖場的日 常監測。免疫膠體金技術是60年代繼三大標記技術(螢光素、放射性同位素和酶)後發展 起來的固相標記免疫測定技術，免疫膠體試紙條技術，具有單份測定、簡單快速、特異敏感， 不需任何儀器設備和試劑，幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的實驗結果，並可保存實驗 結果的優點；免疫膠體金層析技術現已成為當今最快速敏感的免疫學檢測技術之一，特別 適合於廣大基層單位、醫院、野外作業人員以及大批量時間緊的檢測和大面積普查等，因此 該技術具有巨大的發展潛力和應用前景。如授權公告號為CN100494352，名稱為「檢測牛結 核抗體的免疫膠體金試紙條及其製備方法」的發明專利，就公開了由樣品墊、結合墊(玻璃 纖維膜)、硝酸纖維素膜、吸水墊和背襯(底襯)組裝而成的免疫膠體金試紙條，其中結合墊 上包被有MPB83蛋白-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上包被有由純化MPB70蛋白構成的檢 測線和純化的免疫MPB83蛋白IgG構成的質控線。赤羽病抗體為赤羽病病毒的免疫應答蛋白，目前本領域技術人員用常規純化技術 都可以得到單克隆抗體或多克隆抗體，如公開號為CN101200709，名稱為「抗赤羽病病毒單 克隆抗體的雜交瘤細胞系、單克隆抗體及其試劑盒和用途」的發明專利申請，就公開了單克 隆抗體的製備，其製備方法較複雜。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供了檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條，該膠體金 試紙條具有檢測簡便、快捷、特異、敏感和成本低等優點，使普通作業人員，在基層也可以方便檢測赤羽病抗體。本發明還公開了上述膠體金試紙條的製備方法，該製備方法較簡單，成本也較低， 得到膠體金試紙條特異性好，敏感度高。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為檢測赤羽病抗體的膠體金試紙 條，色括底襯，所述底襯上設置有吸水墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和樣品墊，所述硝酸纖 維素膜上設置有檢測帶和質控帶，所述檢測帶中包被有Gl重組蛋白，所述質控帶中包被有 赤羽病抗體，所述玻璃纖維膜中包被有膠體金-Gl重組蛋白，所述Gl重組蛋白的胺基酸序 列如序列表SEQ ID NO. 2所示。所述赤羽病抗體為多克隆抗體。檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條的製備方法，包括下述步驟DRNA製備用病毒RNA抽提試劑盒從赤羽病病毒中抽提分離囊膜糖蛋白Gl基 因，以該Gl基因為模板進行RT-PCR擴增反應，測序，得到Gl基因，所述Gl基因的核苷酸序 列如序列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR擴增反應的上遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示，下遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；引物由大連寶生生物有限 公司合成；2)G1重組蛋白製備將上述Gl基因構建到表達載體pET_28a(+)中得到重組質 粒，再將該重組質粒導入表達宿主大腸桿菌BL21中，將該大腸桿菌BL21夜培養，按體積比 1 200，將上述大腸桿菌BL21接種至LB培養基中，37°C培養至0D_為1時，加入異丙基 硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至其終濃度為lmmol/L，誘導表達4h，得到誘導菌液，將該誘 導菌液5000r/min離心lOmin，收集細菌沉澱，所述細菌沉澱先用0. 01mol/L PH7. 4磷酸鹽 (PBS)緩衝液洗溶，然後5000r/min離心lOmin，洗溶離心重複3次，得到去雜的細菌，根據 Novagen公司的His. Bind Purification Kit說明書將去雜的細菌破碎、提取、純化、層析、 洗脫得到Gl重組蛋白溶液，測序Gl重組蛋白，該Gl重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID N0. 2所示，4°C冰箱保存備用；表達載體pET-28a(+)和大腸桿菌BL21由哈爾濱獸醫研 究所提供；蛋白製備請依上述說明書操作，在此不作詳述；3)膠體金-Gl重組蛋白製備用濃度為0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調 節至7. 9，然後在ImL的膠體金溶液中加入15. 9ug的Gl重組蛋白溶液，磁力攪拌混合均 勻30min，加入質量百分濃度為10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液，至牛血清白蛋白終濃度 為1%，繼續攪拌15min，再加入質量百分濃度為5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇終濃度為 0. 5%，再繼續攪拌15min，然後置於4°C冰箱過夜，次日以1500rpm離心lOmin，取上清液以 13000rpm離心lh，在沉澱中邊攪拌邊加入膠體金溶液至沉澱溶解，得到膠體金-Gl重組蛋 白溶液，4°C冰箱保存備用；膠體金溶液配製為常規方法，在此不作表述；4)赤羽病抗體製備按體積比1 1，在赤羽病病毒中加入弗氏完全佐劑(FCA) 乳化為乳化液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔14 天，再吸取上述乳化液1.5mL，注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔10天後，從耳靜脈採血 0. 5 1. 0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價，在抗體效價不低 於1 16時，放兔血並分離血清，該血清即為多克隆的赤羽病抗體溶液；該抗體製備操作簡 單，成本低，時間短，得到抗體符合要求；當然也可以用如CN101200709所述的單抗；5)膠體金試紙條製備將上述Gl重組蛋白溶液噴在硝酸纖維素膜的檢測帶上烘乾備用，將上述赤羽病抗體溶液噴在硝酸纖維素膜的質控帶上烘乾備用，將上述膠體金-Gl 重組蛋白溶液噴在玻璃纖維膜上烘乾備用，在不乾膠的底襯上按順序貼附吸水墊、含有Gl 重組蛋白和赤羽病抗體的硝酸纖維膜、含有膠體金-Gl重組蛋白的玻璃纖維膜、樣品墊，然 後切割成4mm寬的紙條，得到膠體金試紙條。與現有技術相比，本發明的優點在於檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條，色括底襯， 底襯上設置有吸水墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜上設置有檢測帶 和質控帶，檢測帶中包被有Gl重組蛋白，質控帶中包被有赤羽病抗體，玻璃纖維膜中包被 有膠體金-Gl重組蛋白，Gl重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；該膠體金試 紙條在養殖場等基層就可以檢測赤羽病抗體，也無需實驗室檢測儀器，對檢測技術要求也 不高，普通作業人員依說明書說可實施，且檢測快捷、特異、敏感和成本低，因此本發明具有 檢測簡便、快捷、特異、敏感和成本低等優點。通過RNA製備、Gl重組蛋白製備、膠體金-Gl 重組蛋白製備、赤羽病抗體製備和膠體金試紙條製備步驟製備方法，得到特異性好和敏感 度高的該膠體金試紙條，該製備方法較簡單，成本也較低。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條的製備過程1)RNA製備用病毒RNA抽提試劑盒從赤羽病病毒中抽提分離囊膜糖蛋白Gl基 因，以該Gl基因為模板進行RT-PCR擴增反應，測序，得到Gl基因，Gl基因的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR擴增反應的上遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，下遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 4所示；具體RT-PCR擴增反應為常規方 法，在此不作詳述；引物由大連寶生生物有限公司合成。2)G1重組蛋白製備將上述Gl基因構建到表達載體pET_28a(+)中得到重組質 粒，再將該重組質粒導入表達宿主大腸桿菌BL21中，將該大腸桿菌BL21夜培養，按體積比 1 200，將上述大腸桿菌BL21接種至LB培養基(市售)中，37°C培養至0D_為1時，加 入IPTG至其終濃度為lmmol/L，誘導表達4h，得到誘導菌液，將該誘導菌液5000r/min離 心lOmin，收集細菌沉澱，所述細菌沉澱先用O.Olmol/L PH7. 4自配的PBS緩衝液洗溶，然 後5000r/min離心lOmin，洗溶離心重複3次，得到去雜的細菌，根據Novagen公司的His. Bind Purification Kit說明書將去雜的細菌破碎、提取、純化、層析、洗脫得到Gl重組蛋 白溶液，測序Gl重組蛋白，該Gl重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，4°C 冰箱保存備用。表達載體pET-28a(+)和大腸桿菌BL21由哈爾濱獸醫研究所提供。PBS 緩衝液的配製將 8g NaCL,0. 2g KCL、1.44g Na2HPO4、0. 24g KH2PO4 溶解在 800mL 蒸餾水 中，用HCL調節溶液的pH至7. 4，加水至1000. 00mL。蛋白製備請依上述說明書操作用 Denaturing Binding Buffer (pH7. 9)按菌液1 20的比例重懸細菌沉澱，超聲透明後， 10000r/min離心15min,取IOmL上清加入到處理好的Ni2+NTA(ImL)柱中，上清與樹脂 懸浮作用 30min 後，依次用 IOmL denaturing bindingbuffer (pH7. 9) >40mL denaturing washing buffer (pH7. 9) 、8mL denaturing elutionbuffer (pH7. 9)過柱，取不同時間的洗 液進行SDS-PAGE電泳分析純化結果；薄層掃描分析純化蛋白的濃度。
3)膠體金-Gl重組蛋白製備用濃度為0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調 節至7. 9，然後在ImL的膠體金溶液中加入15. 9ug的Gl重組蛋白溶液，磁力攪拌混合均 勻30min，加入質量百分濃度為10%的BSA(市售)溶液，至BSA終濃度為1%，繼續攪拌 15min，再加入質量百分濃度為5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇終濃度為0.5%，再繼續攪 拌15min，然後置於4°C冰箱過夜，次日以1500rpm離心lOmin，取上清液以13000rpm離心 lh，在沉澱中邊攪拌邊加入膠體金溶液至沉澱溶解，得到膠體金-Gl重組蛋白溶液，4°C冰 箱保存備用。4)赤羽病抗體製備按體積比1 1，在赤羽病病毒中加入FCA溶液(市售) 乳化為乳化液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔14 天，再吸取上述乳化液1.5mL，注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔10天後，從耳靜脈採血 0. 5 1. 0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價，在抗體效價不低 於1 16時，放兔血並分離血清，該血清即為多克隆的赤羽病抗體溶液。5)膠體金試紙條製備將上述Gl重組蛋白溶液噴在硝酸纖維素膜的檢測帶上烘 幹備用，將上述赤羽病抗體溶液噴在硝酸纖維素膜的質控帶上烘乾備用，將上述膠體金-Gl 重組蛋白溶液噴在玻璃纖維膜上烘乾備用，在不乾膠的底襯上按順序貼附吸水墊、含有Gl 重組蛋白和赤羽病抗體的硝酸纖維膜、含有膠體金-Gl重組蛋白的玻璃纖維膜、樣品墊，然 後切割成4mm寬的紙條，得到本發明用於檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條。上述赤羽病抗體也可以用如CN101200709所述的單抗，在此不作敘述。檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條的應用檢測取上述膠體金試紙條，平放於桌上，在樣品墊上分別滴入待測血清200uL， 當待檢血清滴到樣品點上後，根據虹吸原理會往上滲透，玻璃纖維膜上膠體金-Gl重組 蛋白隨著待檢血清上行，若待檢血清為陽性，在上行至檢測帶時，待檢血清中抗體與膠體 金-Gl重組蛋白以及檢測帶上的抗原形成複合體，顯色，一般20分鐘後就可判定結果。測 定標準分為無效、陰性、弱陽性、陽性。無效檢測帶和質控帶帶均不出現紫紅色線，說明本 試紙已失效；陰性檢測帶不出現色線，質控帶帶出現一條顏色較深的紫紅色線，說明檢測 樣品無AKAV抗體或有AKAV抗體，但抗體水平很低；弱陽性檢測帶出現一條顏色很淺的紫 紅色線，質控帶出現一條顏色較深的紫紅色線，說明檢測樣品中的AKAV抗體水平剛好達到 陽性值；陽性檢測帶和質控帶帶都出現顏色較深的紫紅色線，說明樣檢測品中的AKAV抗 體水平較高；檢測帶顏色越深，檢測樣品中的抗體水平越高。用AKAV標準陽性和陰性血清 進行8次重複試驗，結果一致；用本發明的膠體金試紙條對14份赤羽病臨床樣品進行檢測， 初步結果與進口 ELISA試劑盒比較，陽性符合率為83. 33%。
權利要求
檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條，色括底襯，所述底襯上設置有吸水墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和樣品墊，所述硝酸纖維素膜上設置有檢測帶和質控帶，其特徵在於所述檢測帶中包被有G1重組蛋白，所述質控帶中包被有赤羽病抗體，所述玻璃纖維膜中包被有膠體金 G1重組蛋白，所述G1重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。
2.如權利要求1所述的檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條，其特徵在於所述赤羽病抗體 為多克隆抗體。
3.權利要求2所述的檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條的製備方法，其特徵在於包括下 述步驟DRNA製備用病毒RNA抽提試劑盒從赤羽病病毒中抽提分離囊膜糖蛋白Gl基因，以 該Gl基因為模板進行RT-PCR擴增反應，測序，得到Gl基因，所述Gl基因的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO. 1所示，RT-PCR擴增反應的上遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，下遊引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.4所示；2)Gl重組蛋白製備將上述Gl基因構建到表達載體pET-28a(+)中得到重組質粒， 再將該重組質粒導入表達宿主大腸桿菌BL21中，將該大腸桿菌BL21夜培養，按體積比 1 200，將上述大腸桿菌BL21接種至LB培養基中，37°C培養至0D_為1時，加入異丙基 硫代_ β -D-半乳糖苷至其終濃度為lmmol/L，誘導表達4h，得到誘導菌液，將該誘導菌液 5000r/min離心lOmin，收集細菌沉澱，所述細菌沉澱先用0. 01mol/L PH7. 4磷酸鹽緩衝液 洗溶，然後5000r/min離心lOmin，重複洗離3次，得到去雜的細菌，根據Novagen公司的 His. Bind Purification Kit說明書將去雜的細菌破碎、提取、純化、層析、洗脫得到Gl重組 蛋白溶液，測序Gl重組蛋白，該Gl重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID而.2所示，41 冰箱保存備用；3)膠體金-Gl重組蛋白製備用濃度為0.lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調節 至7. 9，然後在ImL的膠體金溶液中加入15. 9ug的Gl重組蛋白溶液，磁力攪拌混合均勻 30min，加入質量百分濃度為10%的牛血清白蛋白溶液，至牛血清白蛋白終濃度為1%，繼 續攪拌15min，再加入質量百分濃度為5%的聚乙二醇溶液，至聚乙二醇終濃度為0. 5%，再 繼續攪拌15min，然後置於4°C冰箱過夜，次日以1500rpm離心lOmin，取上清液以13000rpm 離心lh，在沉澱中邊攪拌邊加入膠體金溶液至沉澱溶解，得到膠體金-Gl重組蛋白溶液， 4°C冰箱保存備用；4)赤羽病抗體製備按體積比1 1，在赤羽病病毒中加入弗氏完全佐劑乳化為乳化 液，用2ml注射器吸取上述乳化液lmL，注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔14天，再吸取上述 乳化液1. 5mL,注射至兔的腋下和腹股溝中，間隔10天後，從耳靜脈採血0. 5 1. 0ml，分離 血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價，在抗體效價不低於1 16時，放兔血 並分離血清，該血清即為多克隆的赤羽病抗體溶液；5)膠體金試紙條製備將上述Gl重組蛋白溶液噴在硝酸纖維素膜的檢測帶上烘乾備 用，將上述赤羽病抗體溶液噴在硝酸纖維素膜的質控帶上烘乾備用，將上述膠體金-Gl重 組蛋白溶液噴在玻璃纖維膜上烘乾備用，在不乾膠的底襯上按順序貼附吸水墊、含有Gl重 組蛋白和赤羽病抗體的硝酸纖維膜、含有膠體金-Gl重組蛋白的玻璃纖維膜、樣品墊，然後 切割成4mm寬的紙條，得到膠體金試紙條。
全文摘要
本發明公開了檢測赤羽病抗體的膠體金試紙條及其製備方法，試紙條色括底襯，底襯上設置有吸水墊、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜上設置有檢測帶和質控帶，檢測帶中包被有G1重組蛋白，質控帶中包被有赤羽病抗體，玻璃纖維膜中包被有膠體金-G1重組蛋白，G1重組蛋白的胺基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；本發明具有檢測簡便、快捷、特異、敏感和成本低等優點；製備方法包括RNA製備、G1重組蛋白製備、膠體金-G1重組蛋白製備、赤羽病抗體製備和膠體金試紙條製備，該製備方法得到特異性好和敏感度高的本發明試紙條，該製備方法較簡單，成本也較低。
文檔編號C07K16/10GK101949936SQ20101024548
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月2日 優先權日2010年8月2日
發明者吳東來, 張吉紅, 李如松, 聞偉剛, 黃素文 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院