一種薩伊型伊波拉病毒的恆溫擴增檢測試劑盒及檢測方法

2023-05-25 22:48:56

一種薩伊型伊波拉病毒的恆溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒包括RNA提取試劑、恆溫擴增反應液、陽性對照和陰性對照；本發明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高；從病毒RNA逆轉錄到鏈置換擴增全部恆定同一溫度，恆溫擴增僅需35分鐘，核酸試紙條檢測結果需1-2分鐘，全程從接受樣品到獲得結果整個檢測過程僅需1小時左右，且整個反應過程只需一個恆溫儀器，特別適合現場快速檢測使用。
【專利說明】一種薩伊型伊波拉病毒的恆溫擴增檢測試劑盒及檢測方 法 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種針對薩伊型伊波拉病毒核酸的恆溫擴增快速檢測技術，適合對 薩伊型伊波拉病毒的定性檢測。 (二）

【背景技術】
[0002] 伊波拉出血熱是由伊波拉病毒感染引起的一種高度接觸性烈性傳染病，感染人類 後可引起嚴重的急性出血熱，易人傳人，致死率高達70-90%。伊波拉病毒具有囊膜，基因組 不分節段，為單鏈負股RNA，屬於單負股病毒目絲狀病毒科絲狀病毒屬。伊波拉病毒含有一 個線性RNA基因組，長約19Kb，含有7個基因，依次編碼核蛋白（NP)、病毒結構蛋白（VP35， VP40)、糖蛋白（GP)、額外病毒結構蛋白（VP30，VP24)、RNA依賴RNA聚合酶（L)。伊波拉出 血熱需要通過實驗室手段確診，常用的方法有病毒分離、電鏡觀察、常規PCR、免疫螢光、熒 光定量PCR和ELISA等。這些方法或是操作複雜，費時、費力，或是敏感度不夠，需要特殊儀 器設備等，不能快速獲得結果，亟待需要一種快速、簡單、準確的檢測方法。 (三）


【發明內容】

[0003] 本發明目的是提供一種準確、靈敏、快速地檢測薩伊型伊波拉病毒核酸的恆溫 擴增檢測試劑盒及其檢測方法。
[0004] 本發明採用的技術方案是：
[0005] 本發明提供一種薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下 組成：
[0006] (I) RNA提取試劑（優選德國QIAGEN RNA提取試劑盒（Qia-74104));
[0007] (2)恆溫擴增反應液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴 增引物、IXThermol BufTer、MgS04、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶和無菌雙蒸 水；其中：
[0008] 所述的外圍引物分別為：
[0009] 外圍正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，；
[0010] 外圍反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3' ；
[0011] 所述兩條探針的序列分別為：
[0012] 正向5'端Biotin標記探針：
[0013] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3/ ；
[0014] 反向5'端Fitc標記探針：
[0015] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3/ ；
[0016] 所述兩條擴增交叉引物分別為：
[0017] 擴增正向引物：
[0018] 5，-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3，；
[0019] 擴增反向引物：
[0020] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3;；
[0021] (3)陽性對照：含有薩伊型伊波拉病毒的糖蛋白DNA質粒；
[0022] ⑷陰性對照：無菌雙蒸水。
[0023] 進一步，本發明所述的I XThermol buffer含有摩爾濃度為20mM的Tris-HCl、 IOmM 的KClUOmM 的（NH4) 2S04、2mM 的MgSO4 以及質量濃度為 0· 1% 的 Triton X-100，pH 8.8。
[0024] 進一步，本發明所述陽性對照為含有長189bp的薩伊型伊波拉病毒糖蛋白基因 序列，序列如下：
[0025] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0026] 進一步，本發明所述陽性對照按如下步驟製備：
[0027] 以包含擴增區域的伊波拉糖蛋白基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行PCR擴 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對PCR擴增產物進行純化；將純化後的擴 增產物通過T-easy質粒轉染試劑盒（Promega)構建完整的含有目的基因的質粒序列，用分 光光度計對所抽提的質粒測A 28tl定量並稀釋至10個拷貝/ μ 1，-20°C保存。
[0028] 進一步，本發明所述恆溫擴增反應液組成為：兩條外圍引物各自lOpmol，兩條探 針各自 20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，IXThermol buffer，MgSO4 為 6mmol，dNTPs 溶 液各0. 4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉錄酶5U，無菌雙蒸水組成補足至25 μ 1。
[0029] 本發明還提供一種所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒的應用，所述應 用為：
[0030] a)用試劑盒中RNA提取液從待檢測的標本中提取RNA ;
[0031] b)將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恆溫擴增反應液的PCR管中，在 58°C下擴增反應35分鐘；陽性對照PCR管中加入陽性模板，陰性對照PCR管中加入陰性模 板，所述陽性模板為含有薩伊型伊波拉病毒糖蛋白基因片段的質粒，所述陰性模板為無 菌雙蒸水；
[0032] c)將反應後的PCR管放置到核酸試紙條防汙染檢測裝置（杭州優思達生物技術 公司3號裝置）中進行檢測，2分鐘以後判讀結果，當試紙條的檢測線呈陽性時（即試紙條 T線為紅色，C線為紅色），說明樣品中含有薩伊型伊波拉病毒核酸。所述核酸試紙條防 汙染檢測裝置中試紙條包括在帶有不乾膠的襯墊上按順序有樣品墊、有色顆粒結合物墊和 吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設有檢測線和質控線，其中有色顆粒 結合物墊上的有色顆粒有抗FitC抗體包被，檢測線上有親和素包被，質控線上有抗FitC抗 體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0033] 在本發明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測探針。RNA 由逆轉錄酶逆轉錄成cDNA後，本試劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠 Bst DNA聚合酶的高 活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA合成不斷的自我擴增循環。在本發明提供的薩伊型 伊波拉病毒核酸的恆溫擴增檢測試劑盒中，對不同的反應條件進行了優化，如引物和探針 的濃度，Mg 2+濃度，反應溫度等的優化，並將本發明與核酸檢測試紙條檢測系統相結合，建立 了薩伊型伊波拉病毒核酸恆溫擴增定性檢測的方法。該試劑盒的靈敏度可在每個反應體 系中檢出100個拷貝，可以滿足快速檢測薩伊型伊波拉病毒的要求。
[0034] 本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：
[0035] (1)本發明所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒的特異性好，靈敏度高， 步驟簡單，可重複性高；
[0036] (2)反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1小時左右；
[0037] (3)整個擴增和檢測過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴增產物汙染的機會；整 個反應過程不需要複雜的儀器。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為核酸檢測試紙條原理示意圖。
[0039] 圖2為本發明試劑盒用於檢測薩伊型伊波拉病毒的特異性，1-5依次為西尼羅 熱病毒；基孔肯雅熱病毒；登革熱病毒；陽性對照（1〇 2拷貝/反應）；空白對照。
[0040] 圖3為本發明試劑盒用於檢測薩伊型伊波拉病毒的靈敏度，1-5依次為IO4拷貝 /反應、IO 3拷貝/反應、IO2拷貝/反應、IO1拷貝/反應、空白對照。 (五）

【具體實施方式】
[0041] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此：
[0042] 實施例1本發明試劑盒的組成與配製
[0043] a)RNA提取試劑：德國QIAGENRNA提取試劑盒（Qia-74104);
[0044] b)薩伊型伊波拉病毒核酸恆溫PCR擴增反應液：兩條外圍引物（lOpmol)，兩條 探針（20pmol)和兩條交叉引物（40pmol)，IXThermol buffer，MgSO4 (6mmol), dNTPs 溶液 (各0.4mm〇l)，Bst DNA聚合酶（8U)，AMV逆轉錄酶（5U)和無菌雙蒸水組成，總反應液體積 為 25 μ 1 ;
[0045] 外圍正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，
[0046] 外圍反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'
[0047] 正向5'端Biotin標記探針：
[0048] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3，
[0049] 反向5'端Fitc標記探針：
[0050] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3，
[0051] 擴增正向引物：
[0052] 5; -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3 ;
[0053] 擴增反向引物：
[0054] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3 ;
[0055] 所述的 IXThermol buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgSO4 以及質量濃度為 0· 1% 的 Triton X-100, pH 8. 8。
[0056] 所有的引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。
[0057] c)陽性對照：含有薩伊型伊波拉病毒糖蛋白的DNA片段，所述DNA片段長 189bp，基因序列如下：
[0058] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0059] 陽性對照按如下步驟製備：
[0060] 以包含擴增區域的伊波拉糖蛋白基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行PCR擴 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化；將純化後的擴增產物通 過T-easy質粒轉染試劑盒構建完整的含有目的基因的質粒序列，用分光光度計對所抽提 的質粒測A 28tl定量並稀釋至10個拷貝/ μ 1，-20°C保存。
[0061] d)陰性對照：無菌雙蒸水。
[0062] 實施例2用本發明試劑盒檢測薩伊型伊波拉病毒核酸的具體方法
[0063] a)用薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒中RNA提取液從待檢測的標本中 提取RNA (疑似病例提取核酸需在生物安全3級實驗室進行）作為標本RNA。
[0064] b)取標本RNA作為模板加入到裝有薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增反應液的PCR管 中，其中標本RNA 5 μ 1，反應液20 μ 1，58 °C擴增反應35分鐘；陽性和陰性對照PCR管中分 別加入陽性模板和陰性模板。
[0065] c)將反應後的PCR管放置到核酸試紙條防汙染檢測裝置（杭州優思達生物技術公 司3號裝置）中進行檢測，2分鐘以後判讀結果。當樣本中含有薩伊型伊波拉病毒核酸 時，試紙條的檢測線上呈陽性。
[0066] 反覆重複實驗3次，檢測結果無顯著性差異，說明本試劑盒的不同批次間的檢測 結果具有可比性，具有良好的重複性。上述實施例說明，用本發明的試劑盒來檢測重複性 好，且對樣本的檢測僅僅需要1個小時左右就能完成，大大縮短檢測時間。
[0067] 實施例3用本發明試劑盒檢測薩伊型伊波拉病毒的特異性
[0068] 按照實施例2的方法檢測西尼羅病毒核酸RNA ;基孔肯雅熱病毒RNA ;登革熱病毒 核酸RNA ;伊波拉病毒檢測試劑盒陽性對照品，其結果如圖2。從圖2測試結果可見，用本發 明試劑盒檢測薩伊型伊波拉病毒核酸具有很強的特異性。
[0069] 實施例4用本發明試劑盒檢測薩伊型伊波拉病毒核酸的靈敏度
[0070] 對薩伊型伊波拉病毒的質粒DNA進行定量，分別稀釋至濃度為IO4拷貝/微升、 IO3拷貝/微升、IO2拷貝/微升、IO1拷貝/微升，採用實施例2中所述方法來確定本發明試 劑盒用於檢測薩伊型伊波拉病毒核酸的靈敏度。結果如圖3所示，圖中1-4分別表示IO 4 拷貝/微升、IO3拷貝/微升、IO2拷貝/微升、10拷貝/微升，5是陰性對照，可以發現該試 劑盒可在每個反應體系中檢出100個拷貝，具有很高的靈敏度，可以滿足快速檢測薩伊 型伊波拉病毒的要求。
【權利要求】
1. 一種薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括下列組 成： (I)RNA提取試劑； ⑵恆溫擴增反應液：包括正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條擴增交叉引 物、IX Thermol Buffer, MgSO4, dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆轉錄酶和無菌雙蒸水； 所述正向外圍引物為# -TGGITCAAGTGCACAGTCAA-3'; 反向外圍引物為-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'; 所述兩條探針的序列分別為： 正向 5' 端 Biotin 標記探針 5' -Biotin-GCAAGGGITGTCAGATGCG-3'; 反向 3 ' 端 FitC 標記探針 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAAC TTGAC-3'； 所述兩條擴增交叉引物分別為： 擴增正向引物： 5' -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3'； 擴增反向引物： 5' -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3'； (3) 陽性對照：含有薩伊型伊波拉病毒的糖蛋白DNA質粒； (4) 陰性對照：無菌雙蒸水。
2. 如權利要求1所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於所述 IXThermol Buffer 含有摩爾濃度為 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的MgSO4以及質量濃度為0? 1 %的Triton X-100, pH 8. 8。
3. 如權利要求1所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於所述陽性 對照為含有長189bp的薩伊型伊波拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下： TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGA GTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCT GAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
4. 如權利要求1所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於所述陽性 對照按如下步驟製備： 以包含擴增區域的伊波拉糖蛋白基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行PCR擴增 獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化；將純化後的擴增產物通過 T-easy質粒轉染試劑盒構建完整的含有目的基因的質粒序列，用分光光度計對所抽提的質 粒測A 28tl定量並稀釋至10個拷貝/yl，-20°C保存。
5. 如權利要求1所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒，其特徵在於所述恆溫 擴增反應液組成為：兩條外圍引物各自lOpmol，兩條探針各自20pmol，兩條交叉引物各自 40pmol，I XThermol buffer，MgSO4 為 6mmol，dNTPs 溶液各 0? 4mmo1, Bst DNA 聚合酶 8U, AMV逆轉錄酶5U，無菌雙蒸水組成補足至25 ill。
6. -種權利要求1所述薩伊型伊波拉病毒恆溫擴增檢測試劑盒的應用，其特徵在於 所述應用為： a)用試劑盒中RNA提取液從待檢測的標本中提取RNA ; b) 將步驟a)提取得到的RNA作為模板加入到裝有恆溫擴增反應液的PCR管中，在58°C 下擴增反應35分鐘；陽性對照PCR管中加入標準陽性模板，陰性對照PCR管中加入標準陰 性模板，所述陽性對照模板為含有薩伊型伊波拉病毒糖蛋白基因片段的質粒，所述陰性 對照模板為無菌雙蒸水； c) 將反應後的PCR管放置到核酸試紙條防汙染檢測裝置中進行檢測，2分鐘以後判讀 結果，當試紙條的檢測線呈陽性時，說明樣品中含有薩伊型伊波拉病毒核酸。
【文檔編號】C12Q1/70GK104313179SQ201410503330
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】徐昌平, 盧亦愚, 馮燕, 陳寅, 高見 申請人:浙江省疾病預防控制中心