木輪轂刺桐的水醇提取物、藥物組合物和生產這些物質的方法
2023-05-25 06:19:56
專利名稱：木輪轂刺桐的水醇提取物、藥物組合物和生產這些物質的方法
技術領域：
本發明涉及對膽鹼能和/或5-羥色胺能系統起作用的分子。更具體，而言，本發明涉及可用於製備抗焦慮藥物的刺桐副產物。還提供了含有所述分子的藥物組合物以及製備所述藥物組合物的方法。
背景技術：
木輪轂刺桐(Erythrina mulungu)(蝶形花科(Papilionaceae)一豆科(Leguminoseae))為具有紅色花朵的木本植物(高10-14米)，生長在巴拉那盆地的半落葉性闊葉森林和主要在聖保羅州的西部地區和米那斯三角洲的灌木叢林地區(LORENZI，1992)。該植物的樹皮被當地人用作安定藥和鎮靜藥。一般稱之為木輪轂(mulungu)、珊瑚樹、珊瑚木輪轂和珊瑚灌木(種族名稱包括capa-homem，suiná-suiná，tiricoiro等)(LORENZI，1992)。巴西出產八個品種的刺桐木輪轂刺桐(E.mulungu)、E.velurina、雞冠刺桐(E.crita-galli)、E.poeppigiana，褐花刺桐(E.fusca)、E.faleata、象牙花(E.speciosa)和E.verna(LORENZI，1992)。儘管對木輪轂刺桐種的研究很少，但是已進行很多工作以確認該品種的其它種的植物化學(fitochemical)和藥理學性質，所述其它種還因為被廣泛地用作鎮靜藥、安定藥並且還用作輕瀉劑、抗炎劑和抗利尿劑而廣為人知 et al.，2000)。
植物化學(Fitochemistry)對刺桐屬種的研究產生興趣始於1877年，當時 和Altamirano發現美國刺桐(E.americana)的種子提取物的藥理學作用與右旋氯筒箭毒鹼(從南美防己(Chondodendron tomentosum)中提取得到的物質)的作用相似(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986； et al.，2000)。此後進行了對刺桐不同種的提取物的植物化學和藥理學性質的研究。數年之後，在確認了刺桐不同種的提取物中所展示的藥理學作用後，研究致力於在這類植物中分離和鑑定生物鹼(SARRAGIOTO et al.，1981)。直到此時藥理學測試依然是在粗提產物上進行。1937年，Folkers和Major(1937)對美國刺桐(E.americana Mill.)的種子進行了化學研究，並分離了結晶生物鹼刺桐定(erythroidine)，刺桐定呈現出與右旋氯筒箭毒鹼相似的膽鹼能活性。隨後的分析(BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)表明刺桐定是命名為α-刺桐定和β-刺桐定的兩種同分異構生物鹼的混合物，後者具有膽鹼能活性(HARGREAVES et al.，1974；HIDER etal.，1986； et al.，2000)。分離了美國刺桐的α和β-刺桐定後，對刺桐的其它種進行了研究，並分離出新的刺桐骨架生物鹼(FOLKERS and KONIUSZY，1940；FOLKERS et al.，1944；BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953；TANDONet al.，1969；ITO et al.，1970；BARTON et al.，1970；GHOSAL，1970；GHOSAL et al.，1971；ITO et al.，1971；MIANA et al.，1972；GHOSALet al.，1972a，b；BARTON et al.，1973；ITO et al.，1973，a，b，c，d；GHOSAL and SRIVASTAVA，1974；MILLINGTON et al.，1974；GAMES etal.，1974；ITO et al.，1976；BARAKAT et al.，1977；EL-OLEMY etal.，1978；AHMAD et al.，1979；TIWARI and MASSOD，1979a，b；SARRAGIOTO et al.，1981)。
對刺桐生物鹼的基本結構的了解可通過降解和合成實現(GRUNDONand BOEKELHEIDE，1953；GRUNDON et al.，1953；WEINSTOCK andBOEKELHEIDE，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)。證實了這些生物鹼的結構中存在螺旋胺骨架(spiroaminic skeleton)，所述鹼具有如下通式(表示二烯類(dienic type)刺桐生物鹼)。
對該結構的了解有助於隨後鑑定新的化合物。目前，已知有三類刺桐生物鹼。二烯類(Dienoid)代表A環和B環中的二烯系統。所述生物鹼在A環中具有雙鍵Δ1，6。第三組刺桐鹼包括刺桐二烯酮鹼(erysodienone)、3-去甲氧基刺桐替定酮鹼(3-desmethoxyerythratidinone)、α-刺桐定和β-刺桐定。還分離了並不存在刺桐骨架的某些刺桐種的一些生物鹼，這些生物鹼包括東罌粟靈(orientaline)、N-降東罌粟靈(N-Noorientaline)、原漢防己鹼(protosinomenine)、N-降原漢防己鹼(N-Norprotosinomenine)、異波爾定鹼(isoboldine)、刺桐雙定(erybidine)、scoureline、異種荷包牡丹鹼(coreximine)、hypaforin、coline。
使用由乾花製得的乙醇提取物對木輪轂刺桐進行植物化學研究分離得到五種鹼(erysothrina、N-erysothrina oxide、刺桐阿亭(erythrartine)、N-氧化刺桐阿亭(N-erythrartine oxide)和hypaforin)和萜類化合物fithol(SARRAGIOTO et al.，1981；SARRAGIOTO，1981)。最近的植物化學研究表明刺桐種還富含其它類物質，如黃烷酮、異黃烷酮、異黃酮和紫檀鹼(pterocarpane)(DA-CUNHAet al.，1998；TANAKA et al.，1996，1997a，b；1998；2001；OH et al.，1999；YENESEW et al.，2000；NKENGFACK et al.，2001)。
藥理學活性自刺桐獲得的物質的主要藥理學作用是其對膽鹼能系統的外周活性，該活性已與右旋氯筒箭毒鹼的作用相比較(HARGREAVES et al.，1974；HIDER et al.，1986； et al.，2000)。該作用歸因於生物鹼二氫-β-刺桐定(DHBE)，它是從美國刺桐(E.americana)(BOEKELHEIDE and GRUNDON，1953；BOEKELHEIDE et al.，1953)和E.tholloniana(CHAWLA et al，1985)分離獲得的菸鹼樣拮抗劑受體(HIDER et al.，1986)。近來，在一個體外實驗中，DHBE被表徵為5-羥色胺3拮抗劑受體(5-HT3)( et al.，1993)。刺桐品種的一些種還表現出對中樞神經系統的其它活性，例如抗驚厥、催眠、麻醉、鎮靜和抗焦慮作用(GHOSAL et al.，1972；HARGREAVES et al.，1974；RATNASOORIYA and DHARMASIRI，1999；ONUSIC et al.，2002)。但是，已報導的研究並未分析刺桐生物鹼在這些活性中的作用。
對E.velutina的研究表明，用水醇提取物(hydroalcoholicextract)短暫處理降低了小鼠在曠場實驗中的活動情況(劑量為250和500mg/kg，口服攝入)，並且還增加了由戊巴比妥引起的睡眠周期以及毛果雲香鹼引起驚厥的起始周期(劑量為500和1000mg/kg，口服攝入)，這表明它對中樞神經系統有抑制作用(CABRAL et al.，2000)。另一項研究工作( et al.，2000)表明，與地西泮相似，用美國刺桐的己烷(hexanic)級分短暫處理(3mg/kg，i.p)降低了雄性小鼠的攻擊行為。最近，對木輪轂刺桐的水醇提取物的研究(ONUSICet al.，2002)觀察到，在高架式T迷宮試驗的抑制性逃避學習中，用200mg/kg的劑量短暫處理(口服攝入)表現出對小鼠的抗焦慮作用，這與苯二氮革類抗焦慮藥(BDZ)地西泮的作用相當。ONUSIC和他的同事們(2002)還在明暗箱模型中觀察到相同劑量木輪轂刺桐的抗焦慮作用，包括在兩箱之間的穿越次數以及在明箱裡停留的時間。另一項研究工作表明，通過口服攝入劑量為50、100和200mg/kg的木輪轂提取物長期處理(9天)，在抑制性逃避學習和從高架式T迷宮的開放臂脫逃中表現出抗焦慮作用(ONUSIC et al.，2003)。在明暗箱模型中，劑量為50mg/kg的木輪轂刺桐提取物在長期處理14天後也表現出抗焦慮效應(ONUSICet al.，2003)。
儘管已有很多方法，但是迄今為止，現有報導中並沒有將分離得到的刺桐活性成分或通過進行化學合成將其開發為抗焦慮藥劑，也沒有任何製備該藥劑的方法。
發明內容
本發明的主題是提供能對膽鹼能和/或5-羥色胺能系統起作用的分子以及包含所述分子的藥物組合物。
一方面，本發明的分子在動物模型中被證實為有活性的抗焦慮藥。因此，本發明的主題是提供可用於治療需要使用抗焦慮藥的焦慮相關疾病或其它臨床表現的分子。
另一方面，對本發明分子的分離、結構表徵以及藥理學活性的評估使得能開發出旨在治療焦慮疾病的標準化藥物組合物。因此，本發明的另一個主題在於提供包含抗焦慮分子的藥物組合物。
又一方面，本發明分子的分離和/或合成提供了生產包含所述分子的藥物組合物的簡便方法。因此，本發明的另一個主題在於提供生產藥物組合物的方法。
圖1示出木輪轂刺桐水醇粗提產物的提取和分級分離以及使用木輪轂刺桐水醇粗提產物分離生物鹼刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine的步驟的總體示意圖。
具體實施例方式
就本發明的目的而言，「藥物組合物」應該意味著含有活性成分、具有預防、緩解和/或治療目的、起著維持和/或恢復穩態作用的全部和任何一種組合物，並且可被局部給藥、腸胃外給藥、腸內給藥和/或鞘內給藥。
本發明中所說的藥物組合物屬於刺桐副產物類，包括11-OH-erythravine、其可藥用電子等排體(isotheral)、鹽、副產物和/或溶劑合物，任選地包含自木輪轂刺桐提取或通過化學合成獲得的刺桐阿亭和/或erythravine。
本發明化合物的治療應用在多個階段進行。下文給出的所進行實驗及其各自的結果僅為示例性的，並不限定所附權利要求的範圍。
實施例1-使用植物材料製備提取物並分級分離在Rifaina郡(SP)的冬天裡，從成年樹收集花。通過採用乙醇/水(EtOH/H2O)(7∶3)的浸漬法將新鮮植物材料(6kg)處理7天進行提取。然後過濾提取物並藉助旋轉蒸發器將其濃縮，得到292g乾燥水醇提取物。然後進行化學組成的生物監控分級分離和分離。接著進行酸鹼提取，目的在於優化刺桐生物鹼的分離。為實現該目的，將幹的水醇提取物(120g)溶於醋酸的水溶液(10％)中，並用氯仿(CHCl3)進行液/液萃取。將氯仿相與水相分離並將溶劑蒸發得到級分1(7.83g)。然後，用足以獲得9-10之間pH的體積的氫氧化銨(NH4OH)鹼化水相，然後再用CHCl3萃取。將氯仿相分離並將溶劑蒸發得到級分2(F2)(670mg)。
實施例2-色譜法、儀器操作和光譜測定法使用Degree溶劑用於「分析」。為進行分析，使用二氧化矽薄層色譜法(CCD)，CHCl3/甲醇(MeOH)(9∶1)用作溶劑系統。F2中的生物鹼Dragendorf測試為陽性，將所述F2進行空心柱色譜分析(open-columnchromatography，CCA)(直徑為5cm，高為15cm)。為進行CCA(0,035-0,070mm，Φ6ηm)，將矽膠用作固定相，CHCl3/MeOH(10∶0-8∶2)用作流動相。為進行分離，使用了670mg F2，並收集到約20ml的101級分。對101級分進行了流動相為CHCl3/MeOH(7∶1)的分析性CCD並用Dragendorf分析顯示後，101級分被分為級分A(FA-136.2mg)(1-27)、級分B(FB-93.4mg)(28-50)、級分C(FC-148.3mg)(51-69)、級分D(FD-284.5mg)(70-101)。為分離和純化生物鹼，使用製備型薄層色譜法(CCDP)，將螢光素(fluoresceine)用作矽膠固定相(Merck)，將甲苯、丙酮、乙醇和NH4OH(45∶45∶7∶3)用作流動相。為了對從CCDP分離得到的物質進行光譜測定分析，使用在500MHz進行的核磁共振(NMR)光度計Varian Unit。將氘化氯仿(CDCl3)用作溶劑。為測定分離出的生物鹼的化學結構，使用1H和13C的NMR光譜測定法，以及HMQC、HMBC和COSY二維光譜測定法。將結果與當前可在關於刺桐生物鹼的文獻中獲得的信息相比較。通過對FB的CCDP手段分離得到生物鹼1，自FC和FD分離出生物鹼2。使用FD還可分離得到生物鹼3。物質1、2和3在CDCl3中的1H和13C NMR光譜(表1)表明存在具有刺桐鹼骨架特徵的信號。
表1-刺桐阿亭，erythravine和11-OH-erythravine的1H和13C(在CD3Cl中)的NMR(500MHz)的化學位移值(δ)和耦合(J)。
如表1所示，可以鑑定與氫H-14和H-17相關的芳香族質子的兩個單峰信號以及由碳C-15和C-16位的甲氧基氫所引起的兩個單峰信號。三個烯屬質子信號(較寬單峰(s1)，H-7；較寬雙峰(d1)，H-1；兩個雙峰(dd)，H-2)的存在可能是由於刺桐骨架的二烯系統氫所導致。儘管先前的工作(Sarragioto et al.，1982)已報導C-1和C-2分別在δ125.3和δ131.2發生共振，但是在本發明的開發工作中，HMQC二維光譜的化學位移之間的關係表明這些共振分別發生在δ131.5和δ125.5。
11-羥基-erythravine(11-OH-erythravine)與erythravine相似，11-OH-erythravine的1H NMR光譜(表2)中，在C-3位沒有甲氧基氫信號，而對於刺桐阿亭，相對於氧合取代基在δ4.5處僅有一個多重峰，這是由於C-3位所引起。與在刺桐阿亭觀察到的方式相同，1H和13C NMR光譜發現在δ4.74(t)和δ63.69分別存在化學位移，這是由於在C-11存在羥基。這些結果首次公開，因此物質3被認為是新的刺桐生物鹼，並被稱為11-羥基-erythravine(11-OH-erythravine)。生物鹼11-OH-erythravine分離自木輪轂刺桐的花的粗提產物，其化學結構如下圖所示。
實施例3-藥理學評估使用自聖保羅州立大學(UNESP/Araraquara)的中心動物實驗室獲得的、重25-35g的Swiss小鼠。動物被分為10-12隻/組、在底部填有木屑的聚丙烯籠中飼養，給予足量的食物和水。將動物實驗室保持在22±1℃的恆定溫度，光照控制為12小時一個循環，從7:00am至7:00pm，溼度保持在50-60％之間。用提取物、標準藥物和載體進行藥理學評估。因此，除了使用F2(3、6、10、17和30mg/kg)和生物鹼刺桐阿亭、erythravine和11-OH-erythravine(3和10mg/kg)外，還使用了冷凍乾燥的水醇提取物(50、100、200和400mg/kg)，通過採用管飼法的口服攝入給藥。所使用的標準藥物是劑量為2mg/kg的地西泮(DZP)(通過腹膜內給藥，i.p)。所有溶液在實驗當天由0.9％氯化鈉製備得到，並對其進行超聲處理15分鐘，而地西泮溶於0.9％氯化鈉和Tween-80的溶液中。實驗在11:00am和5:00pm之間進行，實驗儀器和方法如上所述。高架式T迷宮由透明玻璃壁和木質地板製成，由兩個開放臂(30×5×0.25cm)和與其垂直連接的一個封閉臂(30×5×15cm)組成，由木質支持物使其距離地面38.5cm。在該測試中，對抑制性逃避進行了五次連續測量(基礎時間、逃避1、2、3和4)並對從開放臂脫逃進行了一次測量，每次測試之間間隔30秒鐘。在逃避測量中，將動物置於封閉臂的遠端，記錄從該封閉臂爬行至開放臂的脫逃時間。在脫逃測量中，將動物置於右手側開放臂的端部，並測量從該開放臂離開的時間。在這些測量中動物停留在迷宮的臂中的最長時間為300秒。對每隻動物進行測量之後，用20％乙醇清洗該裝置。為了避免假陽性或假陰性，在高架式T迷宮中測試後，立即在活動場所對動物進行活動度測試。所述裝置具有由30cm高的壁體圍繞的矩形基底(40×48cm)的白色聚丙烯盒組成。將地面分為30個正方格(8×8cm)。在該測試中，將動物置於盒中央，並將其活動情況錄像記錄五分鐘，用於隨後進行對穿過方格區域(quadrant area)的數目以及stretch-attend姿勢的數目的分析(WALSH and CUMMINS，1976)。
來自動物模型的所有結果首先進行Levene同質性檢驗。將異質性結果轉化為對數尺度，隨後進行統計分析。自高架式T迷宮獲得的數據用於雙因子方差分析(ANOVA)，處理情況作為獨立因子，測試情況作為非獨立因子。處理效果被證明為顯著時，使用單因子ANOVA然後使用Duncan post hoc檢驗對數據進行分析。將得自活動場所的結果進行單因子ANOVA檢驗，然後進行Duncan post hoc檢驗。數值P≤0.05被當作顯著結果。
高架式T迷宮測試如表2所示，在高架式T迷宮模型的抑制性逃避學習中，11-OH-erythravine損害了動物的行為表現。雙因子ANOVA表明在處理(F(3，33)＝8,30；p＜0,001)、測試(F(4，132)＝14,75；p＜0,0001)以及處理和測試之間的相互作用(F(12，132)＝2,42；p＜0,01)中有顯著差異。單因子ANOVA表明E1(F(3，33)＝4,47；p＜0,01)、E2(F(3，33)＝5,29；p＜0,01)、E3(F(3，33)＝5,29；p＜0,01)和E4(F(3，33)＝10,29；p＜0,0001)中處理組次之間有顯著差異，但是在基礎時間(F(3，33)＝0,51；p＜0,67)中沒有顯著差異。表2示出根據Duncanpost hoc檢驗的、與對照組相比的組次的差異。
關於從開放臂脫逃的測量，單因子ANOVA表明，在與對照組相比較時處理組之間沒有差異(F(3，33)＝0,71；p＜0,54)。
表2-將小鼠用11-OH-erythravine進行短暫處理、隨後進行高架式T迷宮測試的效果(平均值±EPM)
活動度-活動場所單因子ANOVA表明，就穿過活動場所的方格的數目(F(3，33)＝0,76；p＜0,51)以及stretch-attend姿勢(F(3，33)＝1,20；p＜0,32)而言，所使用的11-OH-erythravine劑量均未改變活動度。表3示出通過活動度測試獲得的數據。
表3-用11-OH-erythravine進行短暫處理對小鼠在活動場所的活動度的影響(平均值±EPM)
(按照條約第19條的修改)1.木輪轂刺桐(Erythrina mulungu)的水醇提取物，其特徵在於含有具有如下通式的物質或其可藥用電子等排體、鹽和/或溶劑合物，它們與膽鹼能和/或5-羥色胺能系統的功能異常相關 2.根據權利要求1的水醇提取物，其特徵在於與膽鹼能和/或5-羥色胺能系統的功能異常相關的疾病是焦慮。
3.含有木輪轂刺桐水醇提取物的藥物組合物，其特徵在於包含可藥用載體和至少一種如下通式的活性物質或其可藥用電子等排體、鹽和/或溶劑合物 用於治療與膽鹼能和/或5-羥色胺能系統的功能異常相關的疾病。
4.根據權利要求3的藥物組合物，其特徵在於與膽鹼能和/或5-羥色胺能系統的功能異常相關的疾病是焦慮。
5.根據權利要求3和4的藥物組合物，其特徵在於還包含刺桐阿亭和/或erythravine。
6.生產用於治療與膽鹼能和/或5-羥色胺系統的功能異常相關的疾病的藥物的方法，其特徵在於包括如下步驟-製備可藥用載體；並
-將至少一種如下通式的活性物質或其可藥用電子等排體、鹽和/或溶劑合物摻入所述載體中 7.根據權利要求6的方法，其特徵在於任選地將活性物質刺桐阿亭和/或erythravine加入所述載體。
8.根據權利要求6的方法，其特徵在於所述活性物質由刺桐屬(Erythrina)植物的水醇提取物獲得。
9.根據權利要求8的方法，其特徵在於所述活性物質由木輪轂刺桐植物種的水醇提取物獲得。
權利要求
1.活性物質或其可藥用離子等排體、鹽、副產物和/或溶劑合物在脊椎動物的膽鹼能和/或5-羥色胺能系統模型中的用途，所述活性物質的特徵在於具有通式
2.根據權利要求1的用途，其中所述物質用作抗焦慮藥。
3.用於治療與膽鹼能和/或5-羥色胺能系統的功能異常相關的障礙的藥物組合物，所述藥物組合物的特徵在於包含可藥用載體和至少一種如下通式的活性物質或其可藥用離子等排體、鹽、副產物和/或溶劑合物
4.根據權利要求3的組合物，其中所述物質用作抗焦慮藥。
5.根據權利要求3和4的組合物，其特徵在於還包含刺桐阿亭和/或erythravine。
6.根據權利要求3、4或5的組合物，其特徵在於包含含有所述活性物質的木輪轂刺桐(Erythrina mulungu)的水醇提取物。
7.生產用於脊椎動物的膽鹼能和/或5-羥色胺系統模型的藥物的方法，其特徵在於包括如下步驟-製備可藥用載體；並-將至少一種如下通式的活性物質或其可藥用離子等排體、鹽、副產物和/或溶劑合物摻入所述載體中
8.根據權利要求7的方法，其中所述活性物質通過化學合成獲得。
9.根據權利要求7的方法，其中所述活性物質刺桐阿亭和/或erythravine另外摻入所述載體中。
10.根據權利要求7的方法，其中所述活性物質由刺桐品種植物的水醇提取物獲得。
11.根據權利要求10的方法，其中所述活性物質由木輪轂刺桐植物的水醇提取物獲得。
全文摘要
本發明提供了用於膽鹼能和/或5－羥色胺能系統模型的分子的用途，公開了用於治療焦慮疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有11－OH－erythravine、erythravine、刺桐阿亭、其可藥用電子等排體、鹽、副產物和/或溶劑合物，任選含有其它刺桐副產物；還公開了獲得所述藥物組合物的方法。
文檔編號A61K31/4748GK101060853SQ200580035748
公開日2007年10月24日 申請日期2005年10月20日 優先權日2004年10月20日
發明者B·范德蘭·達·席爾瓦, R·L·努涅斯·迪·索撒, F·J·奧塔維沃·阿佩爾西多 申請人:聖保羅州立大學儒利奧清真學院