用於山茱萸品種鑑定的dna片段及其製備方法

2023-05-25 16:17:21 2

專利名稱：：用於山茱萸品種鑑定的dna片段及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及物質，特別是一種用於山茱萸品種鑑定的DNA片段及其製備方法。二
背景技術：
：中藥山茱萸，又名山萸肉、萸肉、藥棗、棗皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cowwo^7c/"flfoSieb.etZucc，除去果核的乾燥成熟果肉，為常用中藥材，具有補益肝腎，澀精固脫的功效，主治眩暈耳鳴，腰膝酸痛，陽痿遺精，遺尿尿頻，崩漏帶下，大汗虛脫，內熱消渴等症。山茱萸主產於我國的河南、浙江、陝西等省，四川、安徽、山東亦有栽培，但山茱萸在長期應用和栽培的過程中，種內產生很大變異，出現較多栽培品種，主要表現在這些品種的果實從形狀、大小、顏色、重量到產量、乾果肉(藥材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有較大的差異，即它們的經濟價值和藥材質量是明顯不同的，由於其藥用和商業價值，為確保真品，對其進行鑑定是必要的。目前，應用較為廣泛的遺傳標記有形態標記(morphologicalmarkers)，細胞t示i己(cytologicalmarkers)、生f七禾示i己(biochemicalmarkers)禾口分子標記(molecularmarkers)。形態標記指植物的外部特徵，細胞標記主要是染色體的核型和帶型，生化標記主要包括同功酶和貯藏蛋白。這3種標記都是基因表達的結果，是對基因的間接反映，標記數目有限，多態性較差，易受環境條件的影響。而DNA分子標記是直接在DNA分子上檢測生物間的差異，是DNA水平遺傳變異的直接反映，DNA分子標記能對各個發育時期的個體、各個組織器官甚至細胞作檢測，不受環境與基因表達與否的限制，數量極多，遍及整個基因組，多態性高，遺傳穩定。所以，DNA分子標記從它誕生之日起，就引起了生物科學家極大的興趣。在短暫的幾十年中，經歷了迅猛的發展，分子標記日趨成熟。目前，DNA分子標記技術已廣泛用於生物多樣性的分析、種質資源的分類演化、遺傳圖譜的構建、基因的分離測序、作物品種及純度的鑑定、雜交育種等許多方面，並顯示了獨到的優勢，那麼能否利用基因DNA對山茱萸進行真假鑑定呢？三
發明內容針對上述情況，本發明之目的就是提供一種用於山茱萸品種鑑定的DNA片段及其製備方法，可有效解決山茱萸種質資源分析、藥材鑑別、雜交育種，防止山茱萸假品出現的問題，其解決的技術方案是，根據分子生物學研究發現，生物類藥材所依賴的資源-"物種"的多樣性是由於其基因多態性的結果，而基因多態性最直接，最好是在DNA分子水平上進行檢測，據此，本發明用於山茱萸品種鑑定的DNA片段為10條(5對)DNA片段，它們是-P1/P2:5'CTTGTCTGTGGATGGT3'/5'GTGTGGAmTAITGG3';P3/P4:5'TAGCCCGAGGTGTTCT3'/5'TCTTGTrCCCGTTGTr3';P5/P6:5'TCGGTGTGTTGAGTATTGGC3'/5'TCGTTGilTl'lWGCTGGT3';P7/P8:5'TGTGGCAGGGACTTCA3'/5'GCATCAGCAAAAACGG3';P9/P10:5'CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3'/5'CACGCACGACAGGACGCT3'，其製備方法是取山茱萸植物葉片研碎成細粉，將細粉置於提取緩衝液中，離心，棄去上清液，再加入用Vc+2xCTAB製成的抽提液以及e-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)製成的溶液處理2次，除去雜質，離心，取上清液，加入異丙醇，沉澱，收集沉澱物，抽乾乙醇，得DNA物質，再利用DNA物質製備RAPD片段，並對其進行克隆，對克隆後RAPD片段的DNA序列進行測定，根據測定的DNA序列設計出了5對(IO條)DNA片段，本發明可用於中藥山茱萸品種的鑑定及與其混偽品的鑑別，並可有效用於中藥山茱萸的品種改良及新品種選育，利用設計的5對(IO條)DNA片段可分別對山茱萸幼苗進行鑑定，可以大大縮短山茱萸品種改良及新品種選育的周期，節省成本。四具體實施例方式以下結合實際情況對本發明的具體實施方式作詳細說明，由上述技術方案給出，本發明的DNA片段是由10條(5對)序列構成的物質，具體是:Pl/P2:5'CTTGTCTGTGGArGGT3'/5'GTGTGGATnTATTGG3';P3/P4:5'TAGCCCGAGGTGTTCT3'/5'TCTTGTrCCCGTrGTT3';P5/P6:5'TCGGTGTGTTGAGTAITGGC3'/5'TCGTTGTTmTATGCTGGT3';P7/P8:5'TGTGGCAGGGACTTCA3'/5'GCATCAGCAAAAACGG3';P9/P10:5'CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3'/5'CACGCACGACAGGACGCT3'。其生產方法是由以下步驟實現的-(一)、DNA提取方法(1)取山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10%PVP粉末，在液氮中研磨成細粉；(2)將細粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩衝液1200^(該緩衝液為25mMTris-HCl，pH=8.00)，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2xCTAB製成的抽提液600pl(該抽提液為0.25gVc/mlCTAB，pH=6.06.5;2xCTAB的組成2%CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA,1.4MNaCl，pH=8.0)，再加入50plP-巰基乙醇，混勻後成混合液，65°C，保溫4h，其間不時搖動；G)將上述裝有混合液的離心管取出，4°C，12000r/min，離心15min;取上層溶液，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)混勻，4°C，12000r/min離心10min，取上層溶液，然後加入等體積的氯仿-異戊醇混合製成的液體，其氯仿異戊醇=24:1，在4。C，12000r/min離心10min，重複抽提2次，去其雜質成抽提液；(4)將上述抽提液，加入0.61.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉澱物的溶液(可放在-2(TC冰箱30min12h，冷凍條件有利於沉澱物的生成)；(5)將上述含有沉澱物的溶液，於4°C，12000r/min離心15min;收集沉澱物，加入300|1175%乙醇洗滌沉澱，12000r/min離心5min，棄上清液，棄上清液後的沉澱物，再加入300(il75%乙醇洗滌沉澱，12000r/min離心5min，重複洗滌1次，得到沉澱物；(6)將裝有沉澱物的試管置於真空乾燥器中510min，抽乾乙醇(不能太乾燥，否則DNA不易水溶)；用50pl去離子水溶解DNA沉澱物，-20"C冰箱保存備用。(二)、RAPD片段的製備用上^XS系列的弓物對山^IC^其ifet咅品種進行RAPD分析。反應體系為10Xbuffer2.5ul，dMP(2.5mmol/L)3.0p1，Mg2+(25mmol/L)3.0ul，引物(該引物為S37或S43或S92，j被為2勵l/L)2.5ul，模板DNA3.0yl(模板DNA為上述(6)步驟中的DNA沉澱物製成)，Taq酶(5U/Pl)1.0ul，去離子水10.0iU補足25yl。擴增^Z循環^fC為94。C予跤性8min，變性94。C，1min;退火38°C，1min;延伸72。C，1.5min，如此反覆35個循環，72。C體10min，得，。94°C降驢U38"的時間以^/人38-C升繊lj72。C的時間^S^為'Kil升降溫。對±^行1.2%瓊月離繊電泳，0.5ug/ml溴化乙錠溶&在紫外^:丁下樹則。其中在S37、S43、S92擴增的圖譜中分別各有1條特徵帶ST37、ST43、ST92。用消毒刀片切下目的DNA條帶，用UNIQ"10柱式DNA膠回收i凝lJ盒(SK1132，上^X公司),目標M，得到RAPD片段ST37、ST43、ST92。(三)、對RAPD片段進行克隆，方法是1、驗用上^I公司的PCR/^tJ克lti錄lJ盒將RAPD片段ST37、ST43、ST92分另lJ雜到pUCnrT質舉4^體中(戶刑兌的PCR/^克斷敘lJ餘市售產品，由上WlX生產，編號SK2214)，1623。C連接1小時S1夜(g卩12-14小時)得3i^產物，通常雜1小時即可超ihi!S:研究的要求。保存-20°0#|備用。2、帝恪感免態細胞方線1)將￡^i杆m^株以線鄉式凃械LBJt^S^肚，37。Ci^^過繊f^g的克隆。2)挑單克輕2mlSOBJ3g^基中，37°C，160r/min，搖菌過夜(12-14小時)成歸基的菌液。3)在250ml瓶中裝50mlS0BJ^^基，隨後將過夜i歸的菌液接種於i^^基中，其接種比例每100gif^基中接i錄的菌液lml(100:1)，37°C搖菌至Aaonm約0.35，在冰JJ爐10餘4)將菌^t移到5ml的離L、管中，3500rpm離心10-15^H中後，棄上清液，讓沉澱物儘可能真空千燥，加4mlSolutionB(高效製備感受態細胞i敘U盒中的。C保存。其中i^^fi兌的LBi^^ffl^板是由LB(Luria-Bertani)ig^基製成，LBi歸基為配製每升Ji^基，驗950ml去離子水中力口入月對七蛋白腖10g，酵母提取物5g，NaCllOg，搖動容器:tM溶質溶解，用5mol/LNaOH(約0.2ml)調pH〈輊7.0，用去離子水定容至1L，在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸n^菌20min，將液體i^^基倒A^^皿中放涼，凝固形成平板狀；附兌的SOBig^基為配偉晦升i^^基，在950ml去離子水中力口入，腐七蛋白腖20g，酵母提取物5g，NaClO.5g,搖動容器使溶質魅溶解，力口編250mmo1/LKC1溶液(將1.86gKC1用100ml去離子水溶解即酉誠250ramol/LKC1溶衝用5mol/LNaOH調pH值至7.0，用去離子7jC定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸^^菌20min，該溶鵬4頓前，力口入5ml滅菌的2mol/LMgCl2[2mol/LMga溶液的配製方法如下:用90ml去離子水溶解19gMgCL，用去離子水調辦積為100ml，在15psi(1.05kg/cm2)高壓下蒸頓菌20min];臓的SOC線基為SOC歸基除含有20ramo1/L鰣糖外，期tM分與SOB土^#對目同，S0Bi^^基經高壓滅菌後冷至60。C或60。C以下，力口20ml除菌的lmol/L葡萄糖溶液(lmo1/1葡萄糖溶液的配製方法是用90ml去離子水溶解18g■糖，完全溶解後，用去離子水定容至100ml，用0.22um濾器過濾除菌)；戶/H兌的X~€al的儲存M:將X"Gal溶於二甲基甲醐安中，酉誠20mg/ml、鵬的溶液，裝於^^瓶中^^丙烯管中，裝溶液的管應以錫箔爐以防止見光使X"Gal穀鵬，-20。C保存，該溶液不必過濾除衝所說的IPTG溶液的配法將2g的IPTG溶於8ml水中，用7jC調節^^只到10ml，用0.22um的一次性濾^i濾除菌，^^ilmM喻，-2(TC保存。3、對J^i魏細鵬行轉化1)200p1感受態細胞，置於冰上，完^凍後輕輕將細胞均勻懸浮。力口入10y1雜，，輕輕混勻。冰±30併中。2)42。C;K^m60秒，冰J^嬗2^H中。加400ulS0Ci^^基，37°C，200250r/min振蕩i^1小時。3)室溫下4000rpm離心5力H中，用槍頭卩鵬400y1上清夜，用乘除的:t歸割鄉胞懸浮。4)將細菌塗^S!5feffl20ullOOmmol/LIPTC和100u120mg/mlX-gal塗布的含有氨精黴素的LB職舒社。5)平板在37。C下正向方爐1小時以吸鵬多的液體，然後倒影§#^夜。6)選^SIPTG/X-gal平fei^長的白色，，用3^侄^M^t黴素的LB液體:feg^基，37。Ci^:夜，得到含有目的DNA片^M粒載體的菌液。(四)、RAPD片段的DNA序列測定t鵬實驗要求我們,了直^S行測序法,將含有目的DNA片^M粒載體的茅賴羊菌液M送出觀U序，測^^司為上^E公司。ST37錄589bp，ST43錄825bp，ST92錄837bp。ST37的全序列一589bp1CTTGTCTMGGJITGGTGCTCGGUCCGTAiTACGACTCACTAU&GKGACAUTGATCGAT以TATCCCATGWC(JMC81GCCT隨CCKTTGTCT&麗隠KM脂&ACTTT脇GTTTT簡CA161MGCTTCAM麗畫GCJL畫JITTTTCC顧CACTAA纖GCCGTGTTCT麗CT服腿d241TTKTTTT&AGMATTCAAT以CCACMCATGGTCGTTTGTCTTACACACMTAGCTTCGATCCACTTAGATAC&TMTC321薩隨腿T麵MTTA,A固鵬畫TCCTA麵,GCCCC蔵ATTG畫TT401薩A冊MTTC,GGT讀tt讓畫GG應HTC腿A&TTM匿&GGAA函CTTA481CMT腿CTTK麗n廳T鵬K謹MA廳C皿C鹿TTTTT薩麗CT腿謹SS1薦薦CT畫G磁TTTT皿G;ST43的全序列一825bp1TAACCC隠GTT匿TTCCCGTM懇AC認簡TATCCCATO81G眼謀GTCTGGT匿TTGATTCCTTC匿MGTCACCT&CTGGCAT&ATGTCTT丄S1TGATGTTT(JTCGTTGUTTGC露腹CTTGTTATCCCCTGACTCCTCTAMCM隠n觸謡241T歸GCTGGGCCTGC潔匿UMCTT願TT皿GCT(JTGTTGTUTCGCTGCCCTCTT職C321C園T證TC跳認服GCCKCC證G羅GG認服匿TGGCTCTTCCTCCKTTCCTTA401C認T薦TGC脇CTTCGTTCT認CG謂匿TUG應ATG匿AMGTTATT薦AC481A謂C層MTMCGCMG威MCTTAT匿AGATCGTCAT雄ACCCCA隠GCGTCKTGCSS1TGCTTTTATTCCA薦CTCACCAGC腿TCCTAAACCACG認GCCCC匿CTGGCS41TCTT腦TG羅TTCTCTGTTTCTCCTG:TAGM雷TCCG認GTGTTCT隱CTCTATC應A721M匿TCTCCTTCT而CCCTTCA謀TT簡窗TT蔵CTCT301GAC薦CTGCCTTTT隱TTGTT;ST92的全序列一837bp1QMAMCGGC扁腿TTCAAGCTCWT腦T纖CCACTA,GC隱TAT匿GATG麗隠T81&,&認CT腦腿曙TCAGCTC艦C腦C&證WOTT,薦ATC曙T(JGTC腦GGGG1S1C腹C腿隱CT匿TC脇認AGTGGTG加,GGCTAG鵬TT腦C認A隠G隱隱C241CGGGACGCAGGCAGATTTCAGACCTCCTCTTCCTTCTCAGACAGAGGCTTATGCTCAGAGATTCCAGTCTGGtJMGGGTG321獄薦ACT認G認CAG認GTCC陽GGGTTC認AGA匿隱GCGC簡CC謀T懇G401CTGTTCTTGC腦CTTGCG(JMG認AGAGGCT磁C謀CCTTCA鐘雄GGGT纖TTGCCTTTGTCACC481GTHTOCTG皿G匿TTGCATT證證CC匿C皿腦C匿G而T隱CAGCTTTG脇T&CTSS1G腿T歸AT曙匿CCCCCTCTTGTG腿TTCCT脇GCGTGCA認吸C懇C腿GG皿隠TS"ACTGTGGMA謀CATTCT隨T腿(JCTGATA認廳(!叫&薩G艦GKG腐CTG麗函TT721TCGTG認A窗TTGGCC廳T露GGCTCTCTTGAT認TCTGGGTG跳GTCAG認腿AC腿観801T認艦TGTTTGT,腿CACCCCG歸TC。(五)、能夠用於山茱萸品種鑑定DNA片段的設計根據RAPD片段ST37、ST43、ST92的DNA序列，設計10條(5對)DNA片段，可用於山茱萸品種鑑定。本發明(1)、可用於中藥山茱萸品種的鑑定及與其混偽品的鑑別，可根據設計的5對(10條)DNA片段，選用適當的分子鑑定技術，並摸索出有效的方法，進行中藥材的真偽鑑定甚至品質上的評價。目前植物總DNA的提取方法已比較完善，可從長期貯存的標本中進行提取、擴增與測序，使中藥材的分子鑑別在方法學上得到保證。山茱萸藥材的混偽品有山茱萸科植物川鄂山茱萸Coe/7"c^'/7e/7s^Wanger.的乾燥成熟果肉、鼠李科植物酸棗Ziz7P力ws力j'i/6eMill.、滇朿lj麥Z2Xfp力〃5"Lam.的乾燥成熟果皮、小檗科植物小檗^e2^e/^aM/re/7S"Rupr.的乾燥成熟果實、葡萄科植物葡萄W/LZ'/eraL.的乾燥成熟果皮、薔薇科植物山荊子船^s6accata(L.)Barkh.的乾燥成熟果實、薔薇科植物山裡紅Crs"e^/s/^./朋tj'/!z.a^Bge.7ar,鵬乂。rN.E.Br.、山楂Cratge卵51/w./朋d/!z'c/aBge.、野山楂Crstee^Ac朋eaz^Sieb.etZucc.的乾燥成熟果皮。(2)可用於中藥山茱萸的品種改良及新品種選育，山茱萸栽培品種的劃分主要指標是果實的形狀和果形指數(果實直徑/果實長度)，但是山茱萸是木本植物，從幼苗到開始掛果需要6-8年的時間，故以果實的性狀對山茱萸的品種進行鑑別、篩選與純化是非常困難的。而利用設計的5對(10條)DNA片段可對山茱萸幼苗進行鑑定，可以大大縮短山茱萸品種改良及新品種選育的周期，節省成本。用現有DNA技術，對市場山茱萸產品170例進行測定，準確率為99.89%，效果非常之好，是未曾預料到的，而且方法簡單，節省成本，是藥品鑑定，品種培育、改良上的一大創造，經濟和社會效益巨大。序列表河南中醫學院用於山茱萸品種鑑定的DNA片段及其製備方法用於山茱萸品種鑑定的DNA片段及其製備方法<140〉200810049408.22008-03-25<腸3Patentlnversion3.21〈211〉589DNA山茱萸禾鬥的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)1cttgtctgtggatggtgctcggtaccgtaatacgactcact￡lt^gggCg￡lcatatgatcg60atgatatcccstgggcggccgcctgcagaccaggtctgaccgcttgtctgtggatggt肌120gca鄉gtgactttatgggtcacaccgtactttttcatcaaagcttcaaatgatctattg180cagaaatattttcctccatcgcccgaggtgttctaaatctaggtaagaca240ttggttttgag3CC8C幼CEltggtcgtttgtcttacacacaatagcttcg300atccacttagatacgtaatctacagcgacaagaatatacaaattaccg犯卿gttgggg360aaaggtcctatgaaatcaatgCCCC￡l8￡LC￡lttg卿attttgatgetttagaattcgatta420ggtggcatcatatttcatttggaaatgtttcataatagttaacaacgggaacaagactta480caataaagcttggtatccttaaatatggggatccetcactgc犯犯ttttt540gcagcaattctatgatcactaaagtggcctctsigtgtggattttattgg5892825DNA〈213〉山茱萸科的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)2taacccggcagttgtaattcgagctcggt3ccgtaatacgactcactatagggcgacata60tgatcgatgatatcccatgggcggccgcctgcagacc3ggtctggtgatcUgattcctt120cctgcaagtcacctgctggcatgatgtcttgttgcagtgatgatgtttgtcgttggttgc180tgtgagatcttgttatcccctgactcctctaaacatcgtaccaggaagcattaagtggtg240tgggggctgggcctgcttacg肌tg肌cttaactttatttgctgtgttgttatcgctgcc300ctctttgcactcagaaaagccgtgttggcatctgtattgaU卿ccgccccgacacgag360aatcggtgtgttgagt3ttggctcttcctccgcttccttactcgcttacctgctgcgctt420cgttctgctgctgcgeigcagcgtcatcatcttag犯agatgcagt幼tgttattatccac480aataacgcaagaaacaactt3tgeigc鄉tcgtC3t3鄉3CCCC3gCC3540ccgaaacgaggcgtcgctgctgcttttattccatagcctccgccccgctg3CC3gCElt犯600tcctaaaccacgtggcgcccccaccctggctcttactatgatgcttctct660gtttctcctgtag幼tagctccgtcgtgtgttctgaagctacgacgctgactatca肌ga720aatacctctccttctttctcccttcsggaggcgcggttctttttcatactgactgtggat780ttaaacctctgcatctgcaggacacccctgccttttgggcUgtt825〈210〉3837腿〈213〉山茱萸科的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)〈400〉3caaaaaacggcaagttgaattcaagctcggtaccgtaatacgactcactatagggcgaca60tatgatcgatgatatccc3tgggcggccgcctgcagaccaggtctcagctcacgacagag120cggggag織ttg柳tgccatcggtgtggtcagccggggC3CEttC￡L￡L￡l￡lggaactgtcc180tcatggtggcagtggtgcaggagtggctaggggttttcagcacggacccaggccagccac240cgggacgcaggcagatttcagacctcctcttccttctcagacagaggcttatgctc8gag300attccagtctgggaagggtgtggcagggacttcaggtcagc卿cgggtcccaggggggg360ggttcccggagagatccgccgcgcacatccgcgcttacagctgttcttgctgcgcttgcg420g￡iagaggg￡igaggcttccaccgacccttcaatggitcgggggtaggattgcctttgtcacc480gtttttgctgatgcggtagttgC3ttggg3gccaccgtgccatacattgcgaacgatttt540ggaacagctttgacggtgctgattatgccgatcgatgtgcccccctcttgtgagcattcc600t3tgggCgtgC3tgtgggCCtggscagaaggatgccacatactgtggaaatgaccattct660catstgc肌gctgstatgtgattacgtggggEltCg3C肪ggcgagtcctgatatggaatt720tcgtgscgcattggttggccgctctcttgattcgatctgggtgaagggtc780agtaag幼gaacaagat￡Lgatacggaaaatgtttgtgggggg3C￡ltC83權利要求1、一種用於山茱萸品種鑑定的DNA片段，其特徵在於，該片段為10條5對DNA片段，它們是P1/P25′CTTGTCTGTGGATGGT3′/5′GTGTGGATTTTATTGG3′；P3/P45′TAGCCCGAGGTGTTCT3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT3′；P5/P65′TCGGTGTGTTGAGTATTGGC3′/5′TCGTTGTTTTTTATGCTGGT3′；P7/P85′TGTGGCAGGGACTTCA3′/5′GCATCAGCAAAAACGG3′；P9/P105′CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3′/5′CACGCACGACAGGACGCT3′。2、權禾腰求1所^J用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，由以下步驟實現A、提取DNA，方法是(1)將山茱萸植物葉片0.2g放入研缽，加入葉片重量的10%PVP粉末，在液氮中研磨成細粉；(2)將細粉裝到1.5ml離心管，加入冷藏的提取緩衝液1200ixl，冰上放置10min，8000r/min離心5min，棄去上清液，加入用Vc+2xCTAB製成的抽提液600W，再加入50ialP-巰基乙醇，混勻後成混合液，65°C，保溫4h，其間不時搖動；(3)將上述裝有混合液的離心管取出，4°C，12000r/min，離心15min;取上層溶液，加入等體積的由飽和酚、氯仿和異戊醇組成的液體混勻，4'C，12000r/min離心10min，取上層溶液，然後加入等體積的由氯仿、異戊醇混合製成的液體，其氯仿異戊醇=24:1，在4。C，12000r/min離心10min，重複抽提2次，去其雜質成抽提液，所說的飽和酚氯仿異戊醇=25:24:1;(4)將上述抽提液，加入0.61.0倍體積的異丙醇，放置10到30min，生成含有沉澱物的溶液；(5)將上述含有沉澱物的溶液，於4°C，12000r/min離心15min;收集沉澱物，加入300pl75。/。乙醇洗滌沉澱，12000r/min離心5min，棄上清液，再加入300^175%乙醇洗滌沉澱，12000r/min離心5min，重複洗滌l次，得到沉澱物；(6)將裝有沉澱物的離心管置於真空乾燥器中510min，抽乾乙醇；用50|il去離子水溶解DNA沉澱物，-20C冰箱保存備用；B、製備RAPD片段，方法是將上述用去離子水溶解的DNA沉澱物，置於反應體系中進行反應，方法是用10Xbuffer2.5ul，dNTP3.0"1，Mg2+3.0ul，引物2.5ul，DNA沉澱物3.0ul，Taq酶1.0ul，去離子7jC10,0u1補足25u1j^g^體系，94。C予疲性8min，變性94。C，1min;退火38。C，1min;延伸72°C，1.5min，如此反覆35個循環，72。C方燈10min，得，，對J^tffi行1.2%瓊月^^繊電泳，0.5ug/ml溴化乙錠溶^fe，禾傭S37、S43、S92擴增的圖譜，切掉目的DNA的絲，得RAPD片段ST37、ST43、ST92;C、對RAPD片段進行克隆，方法是首先用PCR，克^i翁lJ^將將RAPD片段ST37、ST43、ST92分別j^妾到pUCnrT載體中，1623。C雜1小時S31夜，得至隨接，；將i^^^f拉伏腸桿菌DH5ci感受態細胞中，S^含有IPTG、X~Gal、Amp的LB瓊月默^^^p^h隔夜i歸，形成白色單，然後將單M^含有氨^t黴素的LB液體i^^基中^M夜，得到含有目的DNA片^M粒載體的菌液；取菌^S行RAPD片段的D織序列進行測定，得ST37錄589bp，ST43錄825bp,ST92錄837bp三^h^列片段，它們是ST37的全序列一589bp:1CTTGTC膨GAT薩TCGGT應MT羅酉T願證■■A腿TCCC腿曙81KCT謹CC薩認CGCT認TG蘭,GCMG陽CTT謹GTmTTC皿1S1認T腿腿墜C讓麗TTCCT,腿腿(JCC,TGTTCT應TAG隱ACA241nUGTHTGAGAMTTCMTTGGTCGTTTGTCTTACACACMTAGCTTCGATCCACTTAGATACGTMTC321腦隨廳廳纖觀腐T鵬畫TCCTAT畫匿GCCC匿AT認ATTT401TGATGATTAGMTTCGATTAGGTGGCATCATATTTCATTTG&MATGTTTCATMUGTTAACMCKGAACMGACTTA481CMT應TT薩CCTT麗A醒K眼TAAAA謹薦C廳TTTTKA曙TCT腿畫SSI薩謹畫G磁TT畫K;;ST43的全序列一825bp:tableseeoriginaldocumentpage43、根據權利要求2所述的用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，所說的審lj^ii^^態細胞是1)將f.coh^f杆^ffi株以線鄉式凃ttLBJt^^p社，37。Cig^過繊f^S的克隆；2)挑單克隆至2mlS0Bi^^基中，37°C，160r/min，搖菌過夜(12-14小時)成聯基的菌瓶3)在250ml瓶中裝50mlSOBi^^基，,將過夜i歸的菌^^f中於i^^基中，其接種比例每100gi^^基中^t歸的菌液lml(100:1),37°C搖菌至—約0.35，在冰i^爐10她4)將菌^t移到5ml的離心管中，3500rpm離心10-15^H中後，棄上清液，讓沉澱物儘可能真空千燥，加4mlSolutionB懸浮菌體，得到感^^細胞，按100"1/支^m存管中，方JtA—7(TC保存。4、根據權利要求2所述的用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，所說的對感^^細胞的轉化是1)200Pl感^^細胞，置於冰上，完儘凍後輕輕將細胞均勻懸浮，力口入IO"雜她雜混勻，冰JJ嫘30併中；2)42。C水^^60秒，冰J^ffl2麼H中，加400ylS0CJ^^基，37°C，200250r/min1小時；3)室溫下4000rpm離心5^!中，用槍頭鵬400ii1上清夜，用乘除的土^#基將細,孚；4)將細菌塗^S予!5feffl20"1100mmol/LIPTC和100u120mg/mlX-gal塗布的含有氨精黴素的LB歸舒社；5)平板在37"C下正向方嫘1小時以吸鵬多的液體，然後倒置i^l夜；6)選IPTG/X-gal平W:生長的白色M，用牙^^侄^M^ffi黴素的LB液體if^基，37。Ct^l夜，得到含有目的DNA片^^粒載體的菌液。5、根據權利要求2所述的用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，所說的IPTG溶液的配法將2g的IPTG溶於8ml水中，用水調節體積J(J10ml，用0.22um的一次性濾微濾除菌，^j^lml小份，-20。C條臓的X"Gal的儲存離將X"Gal溶於二甲基甲醐安中，酉誠20mg/ml、鵬的溶液，裝於l^i中職丙烯管中，裝溶液的管應以錫箔條以防ihJE光使X"Gal穀帔壞，-20。C保存，該溶液不必過濾除衝附兌的1^^^2板是由16;1^#基製成，LB培養基為配帝晦升i^^基，鵬950ml去離子水中加入腐七蛋白腖10g，酵母(物5g，NaCllOg，搖動容器1^溶質溶解，用5mol/LNaOH約0.2ml調pH值至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸n^菌20min，將液體i^^超到Ai^g^皿中放涼，凝固形成平板狀。6、根據權利要求3所述的用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，附兌的SOBi^^基為配製每升:tg^基，在950ml去離子水中加入，胰化蛋白腖20g，酵母提取物5g，NaClO.5g，搖動容器使溶質完全溶解，加10ml250mmo1/LKC1溶液，KCL溶液的配製方》戰，將1.86gKC1用100ml去離子水溶解即酉誠250ranol/LKC1溶液，用5mol/LNa0H調pH值至7.0，用去離子水定容至1L，在15psi高壓下蒸n^菌20min，該溶^j^頓前，力口入5ml滅菌的2mol/LMgCL,2mol/LMga溶液的配製;^接，用90ml去離子7jC溶解19gMgCl2，用去離子7jC調^^只為100ml，在15psi高壓T^^:菌20min。7、根據權利要求4所述的用於山茱萸品種鑑定的DNA片段的製備方法，其特徵在於，所說的SOCi3g^基為SOCi^^基除含有20mmol/L葡萄糖外，期1M分與S0Bi^^對目同，S0Bit^基經高壓滅菌後冷至60。C或60。C以下，力口20ml除菌的lmol/L葡萄糖溶液，lmo1/1葡萄糖溶液的配製方》提:用90ml去離子水溶解18g完全溶解後，用去離子水定容至100ml，用0.22um濾^1濾除菌。全文摘要本發明涉及用於山茱萸品種鑑定的DNA片段及其製備方法，有效解決山茱萸種質資源分析、藥材鑑別、雜交育種的問題，解決的技術方案是，該DNA片段為10條5對，即P1/P2-P9/P10，其製備方法是取山茱萸植物葉片研碎，加入PVP粉末研成細粉，將細粉置於提取緩衝液中，離心，棄去上清液，加入用Vc+2×CTAB製成的抽提液以及β-巰基乙醇，混勻，加入由等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇製成的溶液處理2次，除去雜質，離心，取上清液，加入異丙醇，收集沉澱物，抽乾乙醇，得DNA物質，製備RAPD片段，進行克隆，序列測定，利用設計的5對DNA片段對山茱萸幼苗進行鑑定，方法簡單，節省成本，經濟和社會效益巨大。文檔編號C12Q1/68GK101285099SQ200810049408公開日2008年10月15日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者盧小蕾,陳隨清申請人:河南中醫學院