來源於植物的二酯醯甘油醯基轉移酶基因的製作方法

2023-05-25 12:07:06 2

專利名稱：來源於植物的二酯醯甘油醯基轉移酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及可用於對植物特性進行遺傳操作的植物基因。更為具體的，本發明涉及二酯醯甘油醯基轉移酶(DGAT)基因的鑑定、分離和導入，該基因可以用於，例如，在經濟作物或農作物中改變籽油的含量、籽油中二酯醯甘油/三酯醯甘油部分的比例、脂肪酸合成、籽油醯基組成、種子體積/重量比和進入其他種子組份的碳代謝流量。
在上述的三個位於內質網(ER)內的脂肪酸醯基輔酶A醯基轉移酶中，只有LPAT的基因曾被從植物中克隆出來(Knutzon等，1995，Lassner等，1995)。與在貯存性脂類生物合成中所涉及的幾種其他的酶類類似，醯基轉移酶是內在性的內質網蛋白質，而且非常難於純化。對植物DGAT的研究很大程度上被局限於研究特定級份的活性特徵，這些級份是通過對種子或小孢子來源的胚胎勻漿物進行差速離心而得到的(Weselake等，1993)。雖然對來自於發芽大豆種子子葉的DGAT進行的部分純化曾被報導過(Kwanyuan和Wilson，1986)，但是該酶的具體分子特徵依然未知。
相應的，儘管Kennedy途徑已知而且顯示了在植物的TAGs生物合成的步驟，但是並沒有任何關於特定遺傳因子的鑑定和使用方法的報導，該遺傳因子能夠以一種可能進行商業應用的形式，可靠地用於在植物體內修飾TAG合成和組成。
本發明的另一個目的是鑑定、分離和表徵來源於擬南芥的二酯醯甘油醯基轉移酶(DGAT)基因和cDNA序列並且利用這些序列對植物進行遺傳操作。
本發明的另一個目的是提供一個有義方向含有來源於擬南芥的全長DGAT cDNA序列的載體，該cDNA序列位於一個種子特異性啟動子(例如，napin；見Josefsson等，1987；Radke等，1988；Voelker等，1992)的控制下，用於將該載體重新導入擬南芥或導入其他植物中。
本發明的另一個目的是提供一個含有來源於擬南芥的基因組片段的載體，該基因組片段由全長的DGAT基因位於它本身的5｀上遊調控序列控制下而組成，用於將該載體重新導入擬南芥或導入其他植物中。
本發明的另一個目的是提供一種構建含有來源於擬南芥的全長DGAT序列或DGAT序列的重要片段(significant fragment)的載體的方法，該序列或其片段以反義方向位於一個組成型啟動子或一個種子特異性啟動子的控制之下，用於將該載體重新導入擬南芥或導入其他植物中。
本發明的另一個目的是提供一種修飾擬南芥或其他植物的方法，以改變其籽油含量。
本發明的另一個目的是提供一種修飾擬南芥或其他植物的方法，以改變其籽油中的醯基組成。
本發明的另一個目的是提供一種修飾擬南芥或其他植物的方法以改變其平均種子質量或大小。
根據本發明的一個方面，提供了一個含有經過分離和純化的SEQID NO1脫氧核糖核酸(cDNA)的載體(pDGATcDNA；ATCC No.PTA-989)，用於將該cDNA以有義方向導入植物細胞。
作為本發明的另一個方面，提供了一個含有經過分離和純化的SEQ ID NO3(pDGATgene；ATCC No.PTA-988)基因組脫氧核糖核酸(基因組DNA)的載體，用於將基因組基因以有義方向導入到植物細胞中。
根據本發明的另一個目的，提供了一種製備含有SEQ ID NO1或其部分片段的載體的方法，用於將該基因或其部分片段以反義方向導入植物細胞。
根據本發明的另一個目的，提供了擬南芥哥倫比亞生態型突變體AS11(ATCC No.PTA-1013)的種子以及其脂類表型的表徵(Katavic等，1995；Zou等，1999)。該AS11突變體種子系具有一個位於染色體II的TAG1位點上的插入突變，能夠生產具有低DGAT活性(圖4)和種子發育過程低TAG/DAG比例(表1)的植株，因而導致在發育過程中(圖3)和成熟期(表1中低的TAG/DAG比例)種子脂肪醯基組成的改變(圖2)、油含量的降低(表1)、和籽油二酯醯甘油含量的提高。AS11 DGAT的cDNA序列如SEQ ID NO23所示，基因組DNA序列如SEQ ID NO24所示，AS11 DGAT翻譯得到的蛋白質序列如SEQ ID NO25所示。
本發明也涉及特定的轉基因植物和植物種子，這些植物和種子的基因組含有導入的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3 DNA序列，以及生產上述植物和植物種子的方法。
本發明也涉及SEQ ID NO1或SEQ ID NO3、或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一部分、或含有81bp插入序列的SEQ ID NO1[SEQID NO23]或含有147bp插入序列的SEQ ID NO3[SEQ ID NO24]，因而所編碼蛋白質的推測胺基酸序列含有重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK[SEQ ID NO25]，該重複序列中有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或者被保守替換所取代，其特徵在於該序列被以有義方向或反義方向導入植物細胞內，以及生產這種植物或植物種子的方法。
應當為該領域技術人員所理解的是，本發明也涉及來源於植物的基本同源的DNA序列，所編碼蛋白質的推測胺基酸序列具有25％或更高的同一性，以及40％或更高的相似性，該基本同源的DNA序列是利用SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ IDNO23]的SEQ ID NO1的序列信息通過已知的方法進行分離和/或表徵和/或設計得到的，因此所編碼的蛋白質的推測胺基酸序列含有重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK(SEQ ID NO25)，該重複序列中有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或者被保守替換所取代；本發明還涉及較短長度的部分序列，該序列仍然能夠以反義、共抑制(Transwitch；Jorgensen和Napoli 1994)或其他基因沉默技術的形式作為基因表達的抑制因子。本領域的技術人員應該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會導致該基因效能的降低或者加強，而且在一些應用(例如，反義或共抑制技術)中，部分序列經常會和全長序列同樣有效地發揮作用。基因序列變化或縮短的方法為本領域的技術人員所熟知，測試這些發生變體的基因的有效性的方法也是如此。因此，所有類似的基因的變體都被要求作為本發明組成部分。
其他對於所指出的序列的同一性的優選程度至少是30％、40％、50％、60％70％、80％、90％和95％；其他的相似性的優選程度至少是50％、60％、70％、80％、90％和95％。發明人使用了一套電腦程式以評估同源性，該程序稱為MegAlign，DNASTAR ofDNASTAR Inc.，1228 South Park Street，Madison，WI 53715，USA。這套程序是基於Clustal V算法(Higgins和Sharp(1998)A packagefor performing multiple sequence alignment on a microcomputer；GENE 73237-244)。對於引入排比的每一個缺口而言，程序就會從結果中扣除掉一個懲罰量(penalty)。較高的缺口懲罰量會抑制間隔；而較低的該數值會提高間隔。該程序也可以基於間隔長度評估懲罰量。缺口所跨越的殘基數越多，懲罰量越大。該程序可以從排比的整體結果中扣除掉這些懲罰量。
更為具體的說，本發明涉及從十字花科(Brassicaceae)(特別是擬南芥(Arabidopsis thaliana))中分離、純化和表徵二酯醯甘油醯基轉移酶(DGAT)基因，以及論證其在調節脂肪酸合成、籽油含量、二酯醯甘油/三酯醯甘油比例和種子體積/重量比中的作用。到目前為止，關於植物DGATs的基因結構或其通過遺傳操作在改變油含量或組成中的作用還沒有可用的具體數據。
考慮到改變的油含量和組成，和由具有統計顯著性數量的同一時間在同樣的條件下生長的相同的基因型的未轉化(對照)的植物或種子的平均數得到的結果比較，由具有統計顯著性數量的本發明的植物或種子的平均數得到的結果是最好的。這樣就考慮到了相同基因型不同個體植株間的差異，特別是當這些植株生長在不同的條件下時。用於形成所要求的平均數的植物和種子的確切數量是可變的，但是應該保證只要採用該數量，就足以提供基本穩定的平均值。一般的，該數量至少應該是10，更優選的至少是20、30、50或100。
DGAT基因通過以下步驟從擬南芥進行克隆、表徵和鑑定(1)挑選和表徵與哺乳動物醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶具有部分同源性的植物ESTs；(2)在酵母細胞中進行全長cDNA的功能性表達；(3)表徵和分離來自於擬南芥突變株AS11的DGAT(TAG1)基因，該突變株含有DGAT基因上的插入突變，而且其籽油表型包括改變的DAG/TAG比例和改變的油含量以及醯基組成；(4)通過插入DGAT cDNA序列對AS11突變株進行基因互補以恢復野生型的脂肪酸組成；(5)DGAT cDNA在野生型擬南芥轉基因植株體內的過量表達，產生具有高的油含量、高的平均籽重和改變的籽油醯基組成的種子。
擬南芥DGAT的結構與其在哺乳動物細胞中的對應物具有顯著的同源性(在一個超過400個胺基酸殘基的區域內有40％以上完全相同)，而且與隨後報導的推定的歐洲油菜DGATs在核苷酸水平(92％)和推測的胺基酸水平(90％)上有高度的同源性(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏號AF 155224；AF164434)。
本發明的DGAT可用於調控植物體內DGAT的活性和三酯醯甘油的生物合成。例如，用一個含有有義方向的DGAT基因的結構轉化植物，在組織特異性啟動子(例如，種子特異性啟動子napin)的控制下，DGAT的表達和籽油的積累可以被增強或者籽油中的醯基組成被改變。而另外一個例子中DGAT cDNA的表達是在組成型啟動子(例如，35S(Datla等，1993))的控制下進行的，以提高營養組織(葉、根、莖)中TAG含量。這對於改變塊根類農作物的澱粉/油比例有特殊的優勢。
可選的，DGAT的表達可以通過反義或共抑制(Transwitch)現象(De Lange等，1995；Mol等，1990；Joegensen和Napoli，1994；Kinney，1995；Vaucheret等，1998；Taylor，1998)進行一定程度的沉默。例如，以種子特異性的方式沉默DGAT，可以導致TAG積累的下降。這種方法可以在降低大麥種子油的含量以提高儲存的穩定性方面進行應用。作為第二個例子，種子特異性沉默技術可以導致發育中或成熟的種子中相對高的DAG積累或DAG/TAG比例的提高。作為另外一個例子，突變的DGAT基因表達會導致在突變的DGAT蛋白中產生27個胺基酸殘基的重複插入(見圖5a)，這種現象可以用於改變發育中或成熟種子的DAG/TAG比例。上述的操作能夠使植物中產生天然的、含有提高的DAG相對水平/降低的TAG水平的可食用籽油(見圖3；表1)，可用於食品和糖果工業中作為全天然的乳化劑，或者通過抑制人體內中性脂肪的沉積，提高作為功能性食品的植物油類的營養/健康特性(例如，作為在色拉用調料、人造黃油，烹調用油、stir fry oils)。從canola和大豆中生產的經過加工的含有較高比例二酯醯甘油的植物油類曾被日本Kao公司(例如，Econa烹飪油；Kao公司KI，1-14-10 Nihombashi-Kayabacho，Chuoku，Tokyo 103Japan；[email protected])引用作為一種使血液中性脂肪在飯後難以升高以及脂肪難以附著到體內的產品，因而可以幫助那些體重超重或中性脂肪水平過高的人。作為第三個例子，以種子特異性方式沉默或降低DGAT的活性(如在突變體AS11中觀察到的，例如，通過過量表達SEQ ID NO23或SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的沉默表達)，並將這個特性和種子中產生多羥基烷羧酸酯(PHAs；例如多羥基丁酸酯)的能力結合起來(Poirier等，1992；1995)，將會使未酯化的脂肪酸進入β-氧化通路的流量提高(Poirier等，1999)。通過將未酯化的脂肪酸循環或轉移到β-氧化通路，產生的醯基輔酶A會導致多羥基烷羧酸酯(PHAs)的顯著提高或者PHA組份的改變(Poirier等，1999)。在種子中產生PHAs的轉基因植物具有作為生物可降解性熱塑性塑料的潛力。不過，到目前為止，所產生的PHAs水平還相對較低(Poirier等，1992；1995)。由於本發明的DGAT，在產生PHA的種子內利用轉基因途徑降低DGAT活性以顯著增加PHA產量(例如，增加10倍)目前已經是可能的。
一些利用DGAT基因或其部分可能進行的操作和遞送包括，但不局限於，下面所述具有提高或降低的油含量的種子；含有二酯醯甘油含量提高的油的種子；具有改變的醯基組成的籽油；產生更大或更重種子的植物；顯示出在其他貯藏性器官(例如，塊莖，、根)內具有提高的或改變的積累貯藏性化合物的能力的植物。
圖2是一張曲線圖，顯示了來源於擬南芥野生型(WT)和DGAT突變體AS11系的籽油中脂肪酸組分的比較。脂肪酸的比例以佔各系中總脂肪酸組分的摩爾百分比表示，記為Mol％。誤差線為±SE(n＝10每個測試系10棵植株，每次分析每個樣品50粒種子)。
圖3是一張曲線圖，顯示了擬南芥野生型(WT)和DGAT突變體AS11系發育中的種子的DAG含量比較。更為具體的，所比較的是野生型綠色發育中種子的DAG庫中脂肪酸的含量和AS11突變體的脂肪酸含量。
圖4是一張曲線圖，顯示了擬南芥野生型(WT)和DGAT突變體AS11系中處於胚胎發育的乳狀期、早綠期、中綠期和棕綠期的發育中種子的DGAT活性(pmole/min/mg蛋白質)的比較。處於各個時期的發育中種子的挑選和DGAT酶的分析按照Katavic等以前所述的方法(1995)進行。
圖5(a)顯示了ArabidopsisDGAT(AtTAG1)[SEQ ID NO2]和哺乳動物(鼠和推測的人類)DGATs胺基酸序列的排列比較。MDGAT代表鼠DGAT[SEQ ID NO4]；GenBank/EMBL保藏號AF078752(Cases等，1998)]；HARGP1代表人ARGP1蛋白[SEQ ID NO5]；GenBank/EMBL保藏號AF059202；Oelkers等，1998]。點代表缺口。完全相同的胺基酸殘基以黑色突出顯示。保守的殘基加陰影顯示。由SEQ ID NO23(SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK)中發現的插入突變(81bp)在擬南芥突變體AS11中產生的27個胺基酸的重複序列以上劃線用……表示。推測的三酯醯甘油結合位點以上劃線用 表示。SnRK1目標位點以上劃線用 表示，在絲氨酸(S)上用星號(*)表示磷酸化作用目標位點。
圖5(b)顯示了DGAT蛋白的Kyte-Doolittle水療法曲線圖。
圖6(a)顯示了在擬南芥中表達的TAG1基因的Northern分析結果。總RNA提取自根(RT)、葉(LF)、花(FL)、幼苗(YS)、發育中的長角果實(SL)和發芽的種子(GS)。
圖6(b)顯示了擬南芥中TAG1基因的Sorthern印跡分析結果。基因組DNA用限制性內切酶BgIII(泳道1)、EcoRI(泳道2)和HindIII(泳道3)消化。TGA1DNA探針是通過隨機引物法用32P標記的。
圖7(a)以圖解的形式顯示了TAG1的基因結構。方框代表了16個外顯子(實心方框代表編碼區，開放方框代表非翻譯區)，直線代表了15個內含子。A、B和C表示對野生型(WT)和AS11的片段進行PCR擴增時的引物位置。特定的引物A、B和C在實驗步驟引物策略(見後)中有描述。
圖7(b)顯示了野生型(WT)和AS11的PCR擴增產物的凝膠分離結果。泳道1，以WT基因組DNA為模板用引物A和B得到的PCR擴增產物。泳道2，以AS11基因組DNA為模板用引物A和B得到的PCR擴增產物。泳道3，以WT基因組DNA為模板用引物C和B得到的PCR擴增產物。泳道4，以AS11基因組DNA為模板用引物C和B得到的PCR擴增產物。泳道5，以WT幼苗RNA製備的RNA為模板用引物A和B得到的RT-PCR擴增產物。泳道6，以AS11幼苗RNA製備的RNA為模板用引物A和B得到的RT-PCR擴增產物。
圖8是一張圖表，顯示了在用空質粒(pYES Con)和擬南芥DGATcDNA(pYESDGAT)質粒轉化的酵母菌株YMN5中微粒體DGAT的活性。該表說明TAG1cDNA在酵母中進行了表達。酵母菌株YMN5的寄主培養物僅用pYES2質粒(pYES2；無TAG1插入序列)或用含有TAG1 cDNA插入序列的pYES2質粒(pYES2TAG1)進行了轉化。用半乳糖進行誘導後，將轉化體按照實驗方法部分的描述進行裂解並分析DGAT活性。顯示了兩個獨立的DGAT活性試驗的結果。
圖9是可用作載體的質粒pSE 129A的結構示意圖。該載體有如下的可用於本發明植物轉化的顯著特性種子特異性的napin啟動子和NOS終止子，兩者之間是多克隆位點。


圖10是一張圖表，顯示了野生型cDNA對AS11 DGAT突變的互補作用。用napin啟動子控制下的DGAT cDNA[SEQ ID NO1]轉化擬南芥突變系AS11，會導致在轉化系3-4、9-1、14-2和9-4的籽油中恢復野生型(WT)脂肪酸組成。脂肪酸組成(wt％)的確定是通過從擬南芥未轉化對照(WT)、突變系AS11和napinDGAT轉基因系的T2種子中各選取100顆種子的樣品，然後從樣品中提取籽油進行測定而進行的。
圖11是一張圖表，顯示了未轉化WT對照和pRD400對照(空質粒)以及napinDGAT T2轉基因擬南芥種子系的籽油含量。更為具體的，該圖表顯示了用napin啟動子控制下的DGAT cDNA[SEQ ID NO1]轉化野生型(WT)擬南芥後，導致在DGAT轉基因系中產生更高的籽油含量。籽油含量以每100顆來自擬南芥未轉化對照(WT con)、pRD400對照(空質粒)轉基因系和napinDGAT轉基因系1｀、2｀、9、10和11的T2種子的種子中含有的μg總脂肪酸(FAs)量的形式表示。顯示了對照系的標準誤差線；n＝10。
圖12是一幅圖表，顯示了未轉化對照(WT con)、pRD400對照(空質粒)和napinDGAT T2轉基因擬南芥種子系的100顆種子平均的重量。更為具體的，該圖表顯示了在野生型(WT)中napin啟動子控制下DGAT基因的過量表達，導致了更高的平均種子重量。來自擬南芥未轉化對照(WT con)、pRD400對照(空質粒)轉基因系和napinDGAT轉基因系1｀、2｀、9、10和11的T2種子的100顆種子樣品平均的重量以mg乾重形式(DW)表示。
圖13是一張圖表，顯示了擬南芥未轉化對照(WT con◆)、pRD400對照(空質粒)轉基因系和napinDGAT轉基因系1｀、2｀、9、10和11(■)T2種子的籽油含量(以μg總脂肪酸(FAs)/100顆種子形式表示)和平均種子重量(以mgDW/100顆種子樣品形式表示)間的正相關性，以mg乾重(DW)形式表示。
有鑑於此，本發明的發明人決定要研究DGAT以確定在植物體內其相應的基因能否被測序、克隆以及用於以一種可進行商業應用的方式修飾植物的籽油含量和脂肪酸的組成。
醯基輔酶A依賴性的sn-1，2-DAG醯基化作用是被DGAT所催化的(Stymne和Stobart，1987)。在發育中或發芽的含油種子植物的種子中，TAG積累和DGAT的活性顯示出與內質網相關(ER；高速微粒體部分)(Stobart等，1986；Cao和Huang，1986；Stymne和Stobart，1987；Frentzen，1993；Settlage等，1995；Lacey和Hills，1996)。微粒體DGAT的生化特徵在包括歐洲油菜的發育中的種子(Bernerth和Frentzen，1990；Vogel和Browse，1996；Cao和Huang，1987)以及胚胎培養物(Taylor等，1991；weselake等，1991；Taylor等，1992；Little等，1994)在內的許多植物系統(Frentzen，1993)中被研究過。總之，對發育中的種子的研究結果顯示DGAT的活性在油類積累的活躍階段升高很快，在種子的酯類含量達到穩定時期後顯著下降(Tzen等，1993；Weselake等，1993)。
許多對哺乳動物(Mayorek等，1989；tijburg等，1989)和植物(Ichihara等，1988；Perry和Harwood，1993a和1993b；settlage等，1995)系統的研究表明DGAT可以在TAG的生物合成中催化一個限速反應。不過，這種假設到目前為止並未進行過嚴格的檢驗證實，而且也沒有變成通過在植物和動物系統中轉基因表達任何DGAT基因的實踐活動。歐洲油菜、Shiralee栽培種的發育中的種子被證實在油類積累的活躍階段具有顯著的DAG水平，這種現象說明DGAT催化的反應可能調節進入TAG的碳代謝流量(Perry和Harwood，1993a和1993b)。另外，乙基甲烷磺酸鹽誘導(EMS誘導)的擬南芥突變株，命名為AS11，被證實具有降低的DGAT活性，該活性的降低與DAG含量的升高和TAG積累的降低相關(Katavic等，1995)。假設其在TAG生物合成中可能的速度限制作用，本發明的發明人把DGAT作為對植物脂類生物合成進行基因修飾的一個潛在的目標。
之前，關於ESS誘導的具有改變的脂肪酸組成的擬南芥突變體，AS11的部分表徵有所報導(Katavic等，1995)。與野生型植物種子相比，AS11的種子具有較低水平的超長鏈脂肪酸二十烷酸(20∶1)和低的油酸(18∶1)以及積累的α-亞麻酸作為三酯醯甘油主要的脂肪酸來源(圖2)。AS11突變體在發育中的種子中具有恆定較低的TAG/DAG比，而且積累較多數量的種子DAG(圖3)，作為三酯醯甘油醯基轉移酶的底物。通過一系列生化分析，顯示出AS11在種子發育過程中具有較低水平的三酯醯甘油醯基轉移酶活性(圖4)。AS11也具有較低的油含量(25-30％)的表型，這提供了證明DGAT可能控制進入TAG生物合成的代謝流量的證據，如下表1所示。AS11不具有在其它低籽油突變體中所描述的褶皺種子表型(Focks和Benning，1998)。
表1AS11[Katavic等，(1995)]和野生型擬南芥種子在發育中期的脂類分布特徵以及成熟種子中TAG、DAG和固醇酯的相對含量的比較。種子 發育中期 成熟期a成熟期TAG 成熟期固醇酯含量類型 TAG/DAG比aTAG/DAG比a相對含量b(％總脂類提取物)dc(nmol/mg DW)WT 17 901.00b0.8c(255)AS11 5200.6b1.15c(174)a胚胎期劃分和脂類測定如Katavic等所述(1995)；b根據Rutar(1989)的方法用MASS-1H-NMR測定200顆AS11和WT的種子樣品的相對TAG含量。將可歸於液體樣油類的綜合共振反應相加，AS11種子的數值以相對於WT對照組樣品共振反應的形式報導(後者設為1.00)；cTAG含量(nmol/mg DW)的測定是通過TLC純化的TAG片段的轉甲基反應，然後進行脂肪酸甲酯的GC分析而進行的；d總脂肪酸提取物是通過Taylor等(1991；1992)描述的方法製備的，固醇酯的分離和表徵如實驗方法所述。
遺傳分析顯示脂肪酸表型是由於核基因的半顯性突變引起的，命名為TAG1。該突變定位於染色體II上，估計位於距sti位點約17.5±3cM和距cp2位點8±2cM的區域中。
由於DGAT基因迄今還沒有從任何一種植物中被克隆出來，所以到目前為止，還不可能提出通過調節植物DGAT活性而進行基因修飾以改變碳代謝流量，提高脂肪酸合成、油含量、油醯基組成或種子體積的可能性。
然而，有很多對植物代謝進行了成功地修飾的例子，這些修飾通過基因工程技術轉移新的基因到植物體內或改變植物已有基因的表達而實現。現在通過將基因導入到許多具有重要農藝價值的植物品種體內以提高作物性能(例如，籽油或塊莖澱粉含量/組成；谷粉改進；除草劑、疾病或昆蟲抗性、重金屬耐受性等)照例也是可能的(MacKenzie和Jain，1997；Budziszewski等，1996；Somerville，1993；Kishore和Somerville，1993)。
例如，關鍵性脂肪酸的比例和籽油的數量的提高已經通過將各種脂肪酸生物合成和醯基轉移酶基因導入到油類種子作物中得以實現。包括以下示例在Brassicaseae中表達硬脂醯-ACPΔ9脫飽和酶反義構建會導致硬脂酸含量的升高(Knutzon等，1992)。在Brassicaseae中表達來自加利福尼亞月桂樹的中鏈脂肪乙醯-ACP硫酯酶，被證明可以提高其月桂酸(12∶0)的含量(Voelker等，1992；1996)；在低芥子酸Brassicaseae中表達加州希蒙得木β-酮醯基輔酶A合酶會導致芥子酸(22∶1)水平的升高；在高芥子酸品種中表達該基因的產生作用可以忽略(Lassner等，1996)。在歐洲油菜和大豆中提高油酸的比例已經通過沉默微粒體FAD2(Δ12)脫飽和酶基因得以實現(Hitz等，1995；Kinney，1995；1997)。用酵母sn-2醯基轉移酶轉化擬南芥和油菜籽(歐洲油菜)會導致籽油中22∶1以及其它超長鏈脂肪酸比例的升高和籽油含量的顯著升高(Zou等，1997)。
澱粉的沉積也可以通過基因工程方法改變。在馬鈴薯塊莖中表達編碼ADP葡萄糖焦磷酸化酶的突變型E.coli glgC16基因，會導致澱粉積累的增加(Stark等，1992)。
因此發明人認為DGAT基因有很大希望可以用於植物TAGs預期的修飾。
實施本發明最佳的方式可以從下述對發明人所進行的試驗的結果的描述中清楚地看到。
發明人選擇使用被廣泛接受的模型植物系統擬南芥用於克隆DGAT，作為改變DGAT表達、研究改變DGAT表達對種子三酯醯甘油生物合成影響的基因工程操作的宿主系統。這是因為，在過去幾年裡，擬南芥，一種典型開花植物，在植物生物學研究中作為模型系統得到了越來越多的普及。由於擬南芥給傳統遺傳學和分子遺傳學研究工作帶來的方便，該植物作為模型生物已經廣泛地應用於植物分子遺傳學、發育、生理和生化的研究中(Meyerowitz和Chang，1985；Meyerowitz，1987；Goodman等，1995)。該雙子葉模型植物與Brassica作物種關係很近，而且越來越明顯地是關於擬南芥基本生物學過程遺傳控制的信息能夠轉移到其它物種中(Lagercrantz等，1996)。
實際上，有許多的例子都是首先用模型植物擬南芥進行試驗的，然後在其它植物，尤其是穀物植物中，得到相似的表型。在這些例子中研究的是特定代謝途徑或發育過程中的分子生物學和生物化學特性以及通過遺傳工程手段對該代謝途徑或過程進行改變的可能性。
例如，與質體外膜相關的油酸(18∶1)Δ12(ω-6)脫飽和酶基因，FAD2，是最初在擬南芥中進行研究然後從擬南芥中通過鑑定擬南芥缺陷突變體中發現的卵磷脂骨架的損傷而克隆出來的，該突變體在將油酸脫飽和成亞油酸(18∶2)的步驟上有缺陷。這就導致了一個在擬南芥籽油中高油酸含量的表型(Okuley等，1994)。對大豆(Glycinemax.)和歐洲油菜進行遺傳工程操作，通過反義或共抑制方法，以種子特異性方式沉默其本身的FAD2基因，會導致類似的高油酸籽油表型(Kinney，1995；1997)。
酵母sn-2醯基轉移酶(SLC1-1)基因的轉基因表達以實現增加籽油和超長鏈脂肪酸的含量，首先是在擬南芥上進行的，然後在轉基因油菜籽(歐洲油菜)實驗中也得到相似的表型(Zou等，1997)。擬南芥已經反覆顯示出它本身是一個對所有高等植物都普遍具有的代謝途徑(例如，脂類生物合成、光合作用)或過程(器官形成、生殖發育等)進行代謝工程的有用的模型系統。
在次級代謝/信號傳導領域，一個來源於單子葉玉米的花色苷途徑特異性轉錄激活因子，命名為R(與玉米仁糊粉細胞花色苷合成中的生物合成基因的激活有關的myc轉錄因子)，在雙子葉的擬南芥中表達，會引起花序中花色苷色素沉積增加。接著在另一種雙子葉植物，菸草(Nicotiana tabacum)中表達，導致了相似的花色素沉積的改變(Lloyd等，1992)。這些實驗說明了對所有開花植物普遍具有的整個途徑可以通過導入轉錄調節因子進行同等程度的調節控制，而且其機制對不同的植物種來說是共同的。
在本發明的上下文中，所有的植物種子都積累一定量的三酯醯甘油(油)，這個普遍存在的現象如前面所描述的，至少部分被微粒體DGAT的活性所影響。因此，在擬南芥中觀察到的通過遺傳工程操作調節DGAT表達所帶來的影響可以被預期並且可以預測在其它所有植物中實施後會導致類似的表型。例如，本發明實施後，通過顯示歐洲油菜具有一個高度同源的DGAT基因(Nikiforuk等，1999)可以得到支持本發明發明人的發現的相關信息，因此歐洲油菜是一個基因修飾的明顯的目標，該修飾類似於對擬南芥所進行的基因修飾。
有很多方法可以將基因或基因結構導入植物，而且植物轉化技術和組織培養技術的結合已經被成功的整合成用於產生轉基因農作物植株的有效方法。這些可以用於本發明的方法，在其他文獻中已進行過廣泛的介紹和評述(Potrykus，1991；Vasil，1994；Walden和Wingender，1995；Songstad等，1995)，而且為本領域技術人員所熟知。例如，一個本領域的技術人員肯定會知道，除了利用真空滲入(Bechtold等，1993)或創傷接種(Katavic等，1994)進行農桿菌屬介導的擬南芥轉化外，同樣也可以用農桿菌Ti質粒介導轉化(例如，下胚軸(DeBlock等，1998)或子葉葉柄(Moloney等，1989)創傷感染)，微粒轟擊/biolistic方法(Sanford等，1987；Nehra等，1994；Becker等，1994)或聚乙二醇輔助原生質體轉化(Rhodes等，1988；Shimamoto等，1989)方法轉化其他植物或作物品種。
本領域技術人員同樣應該明確的看到，如其它文獻所廣泛評述的(Meyer，1995；Datla等，1997)，使用植物啟動子以引導任何預期的對轉基因表達的增量或減量調節都是可能的，這些啟動子包括組成型啟動子(例如，以CaMV35S為基礎的啟動子)或能夠將基因表達定位於特定細胞、組織(例如，用於在發育中的種子子葉中表達外源基因的napin啟動子)、器官(例如，根)，特定發育時期或對特定外界刺激(例如，熱激)有反應的啟動子。
根據本發明特別優選的用於修飾的植物包括擬南芥、琉璃苣(Borago種)、Canola、蓖麻(Ricinus comm unis)、可可豆(Theobromacacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium spp)、海甘藍、萼距花種、亞麻(Linum種)、Lesquerella和Limnanthes種、linola、旱金蓮(Tropaeolum種)、月見草、橄欖樹(Olea種)、棕櫚樹(Elaeis種)、花生(Arachis種)、油菜籽、紅花(Carthamus種)、大豆(Glycine和Soja種)、向日葵(Helianthus種)、菸草(Nicotiana種)、Vernonia種、小麥(Triticum種)、大麥(Hordeum spp)、水稻(Oryza種)、燕麥(Avena種)、高梁(Sorghum種)、黑麥(Secale種)或其它禾本科成員。
本發明當用於修飾油類種子作物產生的油類種子的產量或組成時特別有用。油類種子作物是那些能夠以顯著的商業產量產生可食用或工業用油類的植物品種，包括上述的很多植物品種。這樣的油類種子作物為本領域技術人員所知。結果從擬南芥中分離TAG1(DGAT)cDNA既然AS11突變體最有可能的缺陷之一是由於DGAT本身(表1；圖4)，因而發明人的克隆策略試圖利用以與DGAT具有相同底物的特定酶的序列信息為基礎。可用於此目的的侯選酶之一是醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶(ACAT，EC 2.3.1.26)(Chang等，1997)。與DGAT類似，ACAT也是一種ER蛋白質，其功能是作為O-醯基轉移酶，利用醯基輔酶A作為醯基供體使游離膽固醇發生酯化作用生成膽固醇酯。通過BLAST資料庫檢索，發明人鑑定出一種擬南芥表達的序列標記(EST)[目錄號AA042298；SEQ ID NO6]，其推導出的胺基酸序列在EST的短序列(104個胺基酸殘基)中，具有與酵母醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶相應片段41％的同源性(Yang等，1996；Yu等，1996)。
相應的cDNA(E6B2T7)克隆是從擬南芥生物資源中心(Columbus，Ohio)獲得的。在完全測序的基礎上發現878bp的E6B2T7克隆只是部分cDNA。不過，這部分cDNA的ORF預測確定了最初的EST檢索結果，即所編碼的產物在結構上與ACAT類似，特別是在C-末端。通過ORF檢索，發明人確信該cDNA含有3｀非翻譯區，儘管缺失了polyA尾巴。
發明人進而利用該部分cDNA序列以檢索擬南芥基因組序列信息。鑑定出一個擬南芥｀IGF｀BAC克隆｀F27F23｀[目錄號AC003058]，該克隆包含一個與該cDNA匹配的區域，因而得出結論這就是包含相應基因的區域。而且該BAC克隆｀F27F23｀是包含在YAC克隆，CIC06E08中，根據公布的基因圖譜位置(http//weeds.mgh.harvard.edu/goodman/c2_b.html)，該YAC克隆代表了染色體II上位於35.9釐摩和38.7釐摩之間的區域；這個位置與TAG1的估計位置以及與根據AS11的突變鑑定的損傷(Katavic等，1995)類似。考慮到我們以前對AS11突變體表徵的研究結果，該基因的圖譜位置強烈的顯示出它可能編碼DGAT。
為了克隆全長度的cDNA，以位於覆蓋該部分cDNA區域5｀上遊不同位置的基因組序列為基礎，設計了一系列寡聚核苷酸引物。我們將這些引物和一個位於該部分cDNA(E6B2T7)3｀UTR位置的引物結合起來使用進行PCR反應，該PCR反應的模板是由擬南芥(哥倫比亞生態型)長角果特異性cDNA文庫(Giraudat等，1992)製備的cDNA噬菌粒。擴增得到的最長的cDNA長度為1904bp，我們將其命名為TAG1，然後保存在Genebank，其保藏號為AJ238008[SEQ ID NO1]。我們相信這段cDNA代表了一個全長的克隆，因為其大小與northern印跡(見圖6a)中檢測的轉錄產物的大小一致。最長的開放讀碼框架以一個134核苷長度的5｀非翻譯區域和一個203核苷長度的3｀非翻譯區域為側翼序列。其中有一個框內終止密碼子(TGA，位於nt-43位置上)，其後是一個位於nt-139位置上的框內ATG。因此可以推斷出位於nt-139位置上ATG是起始密碼子。TAG1的一級結構預測了一種DGAT相關的酶預測的TAG1 cDNA開放讀碼框架編碼一個520個胺基酸殘基的多肽，其計算出的分子量為58993道爾頓。通過BLAST檢索程序(Altschul等，1990)發現最近報導的小鼠二酯醯甘油醯基轉移酶[保藏號AF078752](Cases等，1998)是一種與推測的TAG1胺基酸序列(圖5a)具有最高序列同源性的蛋白質。TAG1同樣也與人醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶相關的酶(保藏號AF059202)類似。人醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶，也叫做ARGP1，是最有可能成為一個沒有顯著ACAT活性的DGAT，儘管該酶的確切本質還有待進一步確定(Oelkers等，1998)。TAG1和哺乳動物DGAT的相似性遍及一個長度超過400個胺基酸的區域，其序列同一性約41％。一個推定的二酯醯甘油/佛波醇酯結合基序，HKW-X-X-RH-X-Y-X-P，該基序是一個對DGAT唯一的而在ACTAs中不存在的標記序列(Oelkers等，1998)，被定位於414-424位胺基酸上([SEQ ID NO7]；圖5a)。該二酯醯甘油結合基序也被發現在隨後公布的歐洲油菜DGAT序列(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏號AF155224，SEQ ID NO8；AF164434，SEQ ID NO9)中。在其它克隆的醯基轉移酶(例如，GPATs、LPATs、二羥基丙酮磷酸醯基轉移酶)中曾報導過在一個高度疏水性的區塊IV中有一個保守不變的脯氨酸可能參與醯基輔酶A的結合(Lewin等，1999)。在TAG1序列中，位於胺基酸殘基221-229位的疏水區塊含有一個位於胺基酸殘基224位保守不變的脯氨酸，該脯氨酸可能是上述基序的組成部分。
TAG1顯示出和來源於許多種類的醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶的部分序列相似性(Chang等，1997)。不過，該相似性很大程度上局限於C-末端，而且低於(30％左右)TAG1和哺乳動物DGAT的相似性。
TAG1蛋白具有多個疏水性功能區(圖5b)，而且通過PC Gene程序分析預測出該蛋白有5個可能的跨膜區段(178-195、233-253、363-388、433-476、486-507位胺基酸殘基)。在哺乳動物的DGAT中，觀察到一個推定的酪氨酸磷酸化基序(Cases等，1998)，但在TAG1中沒有發現明顯的酪氨酸磷酸化位點。不過，通過直觀檢查揭示了一段共有序列(X-L200-X-K202-X-X-S205-X-X-X-V209；SEQ IDNO10)，該序列被鑑定為一個SnRK蛋白激酶家族成員的典型目標基序，其中的205位絲氨酸殘基是磷酸化作用的目標殘基。SnRK1(SNF-1相關蛋白激酶-1)蛋白是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白越來越多的被證實參與植物體內的碳代謝的全局調控(Halford和Hardie，1998)。該共有的SnRK1目標基序同樣也在隨後公布的歐洲油菜DGAT序列中發現(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏號AF155224；AF164434)。有趣的是，類似的SnRK1目標基序也可以在分別來源於椰子(Knutzon等，1995)和meadowfoam(Lassenr等，1995)的溶血磷脂酸醯基轉移酶(LPATs)中被鑑定出來。TAG1基因在Arabidopsis中廣泛表達通過進行Northern印跡分析以研究TAG1基因的表達特徵。從不同的組織，包括根、葉、花、發育中的長角果、幼苗和發芽的種子中提取總RNA。TAG1轉錄產物最高的穩態水平積累是在從發芽和幼苗中提取的RNA中得到的(圖6a)。在根、葉和花組織中也檢測到TAG1轉錄產物，但含量水平都較低。令人驚奇的是，在發育中的長角果中TAG1基因的表達水平與其它的營養組織相當，但比發芽和幼苗的表達水平要低。這種表達特徵總體上與認為DGAT存在於所有能夠進行TAG生物合成的植物組織中的觀念並不矛盾(Kwanyuan和Wilson，1986)。已經觀察到在很多植物種類，包括大豆和紅花中，發芽的種子活躍的合成TAGs(Ichihara和Noda，1981；Kwanyuan和Wilson，1986；Wilson和Kwanyuan，1986)。在根中存在的相對高水平的表達也與根質體能夠合成大量的三酯醯甘油的事實相一致(Sparace等，1992)。
對經過一些包括BgIII、EcoRI和HindIII在內的限制性內切酶消化的基因組DNA進行Southern印跡雜交(Southern，1975)。TAG1基因沒有內部的BgIII和HindIII位點，有一個內部EcoRI位點存在。我們的Southern分析結果顯示出TAG1很有可能在Arabidopsis中是一個單拷貝基因(圖6b)。在AS11突變體的TAG1基因中發現一個插入突變將基因組序列(保藏號AC003058；SEQ ID NO3)和TAG1 cDNA[SEQ ID NO1]序列進行對比，會發現TAG1基因含有16個外顯子和15個內含子，跨越了一個長約3.4kb的區域(圖7a)。將含有AS11的TAG1等位基因的DNA進行PCR擴增和完全測序。AS11的TAG1等位基因具有一個位於內含子2中間區域的147bp長度的插入序列。該插入序列是一個片斷的複製，該片段由來自12bp的內含子1的3｀末端、整個外顯子2序列(81bp)和54bp的內含子2的5｀末端組成(圖7a)。
為了消除PCR偽跡的存在，共使用了兩套引物以進行進一步的PCR擴增。引物A和B(見實驗方法，引物策略)分別位於外顯子1和3，他們擴增一個DNA片段，從AS11中擴增的該片段(圖7b，泳道2)比從野生型中擴增的(圖7b，泳道1)長150bp。第二對引物，C和B(實驗方法)，一個可在外顯子2和插入序列中找到，另一個位於外顯子3，它們從AS11中產生兩個擴增片段(圖7b，泳道4)，而從野生型中只產生一個擴增片段(圖7b，泳道3)。因此，這些結果證實了發明人通過序列分析鑑定得到的插入突變，反映了AS11基因組中TAG1基因上突變的確切本質。AS11 TAG1轉錄產物具有一個位於開放讀碼框架內的81bp插入序列Northern印跡分析顯示TAG1基因在AS11突變株和野生型擬南芥中的表達特徵沒有差別。為了在轉錄水平上研究突變的作用，進行反轉錄PCR(RT-PCR)以從突變體AS11發芽幼苗中提取的RNA中擴增TAG1的轉錄產物。序列分析揭示了在AS11的轉錄產物中具有一個81bp的插入序列，該序列完全由外顯子2組成。重複狀態的外顯子2進行了正確的剪切。因此，轉錄產物的改變並沒有打亂讀碼框架。不過，在AS11轉錄產物中所述額外的外顯子2序列將會導致產生一個改變了的DGAT蛋白，該蛋白具有27個胺基酸殘基的插入131SHAGLFNLCVVVLIANVSRLIIENLMK157[SEQ ID NO11]。發明人的數據顯示該插入導致了在種子發育過程中DGAT活性降低了40-70％(Katavic等，1995)。AS11中導致DGAT活性降低的81bp插入序列在RT-PCR產物的比較中可以看出(圖7b比較泳道5(WT)和泳道6(AS11))。在AS11突變體中觀察到的DNA畸變是未預期的，因為乙基甲磺酸鹽(EMS)一般產生點突變。儘管我們不能排除該AS11突變體是自發突變事件的結果的可能性，不過EMS誘導的缺失和插入在其它系統中也有報導(Mogami等，1986；Okagaki等，1991)。擬南芥屬突變體AS11中TAG1基因插入影響種子三酯醯甘油積累，但不影響種子中固醇酯的積累由於TAG1也表現出和一些物種的醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶(ACATs)有一定程度的序列同源性(Chang等，1997)，發明人比較了野生型擬南芥和AS11突變體種子中的三酯醯甘油和固醇酯的積累。AS11中三酯醯甘油含量和TAG/DAG比例有所減少(即籽油中DAGs比例提高)，與之對照，WT和AS11種子中的固醇酯比例卻相似，分別佔總脂類提取物的0.8％和1％(表1)。如果TAG1損傷影響了ACAT一樣活性，可以預期種子中固醇酯含量應該下降，但並未觀察到。這些結果顯示了TAG1沒有涉及固醇-酯同化作用，因而不是一種醯基輔酶A固醇醯基轉移酶。TAG1基因在酵母中的表達TAG1 cDNA在酵母中的過量表達與單純質粒(pYES2)對照的轉化體相比，會導致微粒體DGAT活性升高3.5-4倍(圖8)，這個結果證實了TAG1基因產物的功能是作為DGAT。當把14C18∶1-輔酶A加入到酵母溶菌產物中，固醇酯在體外也會被標記上(數據未列出)，但是pYES2半乳糖誘導的對照和pYES2 TAG半乳糖誘導的轉化體溶菌產物中產生的14C標記的固醇酯沒有顯著的差異。這個結果證實了TAG1產物不編碼醯基輔酶A固醇醯基轉移酶(如ACAT)。通過用DGAT cDNA轉化擬南芥AS11突變系實現對其的互補如實驗方法中所描述的，將克隆的全長DGAT cDNA用作PCR擴增的模板，以DGATXbal(DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)為引物以在該序列兩端各提供一個新的限制位點。通過Xbal/Kpnl的消化切除掉一個1.6kb的片段，然後連接到pSE129載體(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中的相應位點上。pSE129A是一個來源於植物轉化載體pRD400的載體(Detla等，1992)。pSE129A載體含有克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位點上的種子特異性的napin啟動子和nos終止子(圖9)。因此，在DGAT-pSE129A結構中，擬南芥屬DGAT cDNA是位於napin啟動子控制之下。該結構的完整性通過序列分析確定。
如實驗方法中所描述的，含有napinDGAT cDNA的pSE129A被導入到根癌農桿菌(A.tumefaciens)中，用於轉化擬南芥突變體AS11和進行後代分析。分離到若干的T2轉基因系，這些轉基因系彌補了AS11中的脂肪酸突變表型(減少的20∶1以及升高的多不飽和C18s)，恢復野生型的脂肪酸特徵(圖10)。該發現證實了AS11中損傷的本質而且將AS11脂類表型和該突變體聯繫起來。DGAT cDNA在野生型擬南芥中的過量表達如實驗方法中所描述的，將克隆的全長DGAT cDNA用作PCR擴增的模板，以DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQ ID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)作為引物用於在該序列兩端各提供一個新的限制位點。通過Xbal/Kpnl的消化切除掉一個1.6kb的片段，然後連接到pSE129載體(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中的相應位點上。pSE129A是一個來源於植物轉化載體pRD400的載體(Detla等，1992)。pSE129A載體含有種子特異性的napin啟動子和克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位點上的nos終止子(圖9)。因此，在DGAT-pSE129A結構中，擬南芥屬DGAT cDNA是位於napin啟動子控制之下。該結構的完整性通過序列分析確定。
如實驗方法中所描述的，含有napinDGAT cDNA的pSE129A被導入到根癌農桿菌中，用於轉化擬南芥突變體AS11和進行後代分析。分離到若干T2轉基因系，這些轉基因系顯示出油含量的升高(圖11)，100粒種子的平均重量增加(圖12)，以及在上述兩個特性之間強烈的線性相關(圖13)。
在脂肪醯基組成方面，含有過量表達的DGAT cDNA的野生型系顯示出總飽和度的下降、單不飽和脂肪酸和18∶1/[18∶2+18∶3]指數的增加，如下表2所示。這樣的改變是朝向「更為健康」的油類特徵方向，而且可以直接用於canola或其它十字花科含油種子以及其他可食用油類作物中，以產生類似的油類組成改善。
表2擬南芥未轉化野生型對照(WT Con)和3個napin啟動子控制下DGAT cDNA轉化(napinDGAT)得到的T2轉基因系(2｀、9和11)的籽油脂肪酸組成

a包括16∶0、18∶0、20∶0、24∶0b包括18∶1、20∶1、22∶1、24∶1c([Wt％18∶1]+[Wt％18∶2+Wt％18∶3])×100實驗方法植物材料擬南芥哥倫比亞生態型(Arabidosis thaliana ecotypeColumbia)和突變體AS11是在前述的條件(Katavic等，1995)下進行種植培育的。如Katavic等所述(1995)；(ATCC NOPTA-1013)，擬南芥突變體系AS11是相對於野生型擬南芥哥倫比亞生態型而產生和表徵的。DNA操作DNA製備、質粒擴增和分離是按照標準方法和步驟進行的(Sambrook等，1989)。測序是在一臺Applied Biosystem公司的型號為373A的DNA測序系統上使用Taq DyeDeoxyTM終止循環測序試劑盒(Applied Biosystems，Inc.)進行的。核苷酸和推導出的胺基酸序列通過BLAST程序與資料庫中的現有序列進行比較(Altschul等，1990)。Southern和Northern分析在不同發育階段的不同組織的總RNA通過使用Lindstrom和Vodkin(1991)的方法進行提取。RNA樣品用甲醛變性然後在1.2％的甲醛-瓊脂糖凝膠上進行分離。總RNA的上樣量約為5μg，每個泳道的RNA量通過rRNA帶的溴化乙錠染色強度進行校正。根據Sambrook等(1989)的方法，分離基因組DNA，並用限制性內切酶進行消化以及進行Southern印跡分析。TAG1 DNA探針根據製造商(BRL)的說明通過隨機起始用32P進行標記。PCR策略用於擴增TAG1基因的引物如下DGAT1(AGACACGAATCCCATTCCCACCGA；SEQ ID NO14)、DGAT2(AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG；SEQ ID NO15)、DGAT3(ATGGTCGCTCCCACATTGTGT；SEQ ID NO16)、DGAT4(CATACAATCCCCATGACATTTATCA；SEQ IDNO17)。DGAT1和DGAT2擴增TAG1基因的5｀部分，DGAT3和DGAT4擴增TAG1基因的3｀部分。AS11的基因組DNA用作PCR擴增突變體AS11等位基因的模板，使用的溫度條件如下94℃ 3分鐘；94℃ 30秒、62℃ 45秒、72℃ 1分鐘進行40個循環；72℃ 15分鐘。為了進一步證實該突變，將引物A(CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG；[SEQ IDNO18])和引物B(GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG；[SEQ ID NO19])以及引物C(TAAACAGTAGACTCATCATCG；[SEQ ID NO20]和引物B分別組成引物對，用於擴增含有該突變的內部片段。引物DGAT1和DGAT4用於進行的cDNA PCR擴增是以擬南芥長角果cDNA文庫為模板進行的。引物A和B也是用於RT-PCR擴增包含插入片段的cDNA片段。TAG1多拷貝載體的構建和轉化以及DGAT在酵母中表達的表徵按照Hadjeb和Berkowitz的描述(Hadjeb和Berkowitz，1996)將TAG1 cDNA克隆到pBluescript SK中。該cDNA是用Kpnl/Xal從所述載體中切出來的，然後克隆到酵母表達載體pYes2(Invitrogen)的相應位點上。通過測序進行確認該結構。在GAL1啟動子控制下，具有TAG1的結構的轉錄釋放出一個約1.9kb的片段。由於該TAG1片段有自己的起始ATG啟動子，因此所表達的產物不是一種融合蛋白。使用一個SLC缺失菌株(YMN5[slcΔ2LEU2 ura3])(由M.M Nagiec和R.C.Dickson捐贈，University of Kentucky，Lexington，KY；Nagiec等，1993)作為酵母表達系統的宿主。我們推斷在這個突變體中，內源DAG代謝庫水平應該比野生型酵母的低，因而這就允許我們在對轉化體裂解液進行體外DGAT分析時，可以在外源提供的14C-DAG存在的條件下，通過過度表達TAG1以使其活性最大化。酵母的轉化是根據Elble(1992)的方法進行的。僅含有載體(pYES2)的YMN5轉化體被用作對照。將單菌落在20毫升SD培養基(合成葡萄糖培養基，加入葡萄糖、不含尿嘧啶，如Ausubel等所描述，1995，Vol.2 p.13.1.3)中於28℃條件下在搖床(270rpm)上培養過夜。將細胞從過夜培養物中沉澱然後重懸於50毫升表達誘導培養基(含有半乳糖不含尿嘧啶的SD培養基)中。細胞在上述表達誘導培養基中於28℃、270rpm搖床轉速條件下繼續培養4-6小時，然後收穫。半乳糖誘導的酵母轉化體通過離心收集(5000rpm、5分鐘)，然後重懸於pH為7.4、含有1mM EDTA和1mM DTT的100mMHepes-NaOH溶液中。細胞裂解液通過使用如Ausubel等(1995)所描述的酸洗玻璃珠方法製備。酵母裂解液中的蛋白質使用Bradford(1976)分析法測定，將每一份裂解液中的蛋白質水平標準化然後按下文所述測定等分試樣(250μg蛋白質)的DGAT活性。脂類底物和DGAT分析14C標記的甘油二油酸酯[1-14C油酸](Sp.活性55mCi/mmol)購自American Radiolabeled Chemicals(St.Louis，MO)。按照Taylor等的方法(1991)，如Taylor等所述(1991)將14C標記的sn-1，2-甘油二油酸酯異構體通過在鋪滿硼酸鹽的板上的薄層層析進行純化，然後在含有0.2％吐溫-20的Hepes緩衝液中進行乳化。20∶1-輔酶A、輔酶ASH、ATP和其他生化試劑均購自Sigma公司。
DGAT分析在pH7.4、搖床轉速100rpm、30℃的水浴條件下進行30-60分鐘。分析混合物(0.5毫升終體積)含有裂解液蛋白質(250μg)、90mM Hepes-NaOH、0.5mM ATP、0.5mM CoASH、1mM MgCl2、200μM sn-1，2-甘油二油酸酯(sp.活性2nC/nmol)於0.02％吐溫20中，其中18μM20∶1-輔酶A作為醯基供體。14C標記的TAGs按照Taylor等的方法(1991)，通過薄層層析分離，然後定量。AS11和WT中脂類和固醇酯的進一步分析按照Taylor等(1991；1992)和Katavic等(1995)的方法進行WT和AS11突變體中總脂類的提取物(TLEs)和脂類分類分析。相對籽油含量按照Ruter的方法(1989)通過magic angle(幻角？)樣品自旋1H-NMR進行測定。將完整的野生型和AS11突變體種子的200粒種子的樣品在運行條件設定為360MHz的Bruker AM寬內徑光譜分析儀(Bruker Analytische Masstechnik GHBH，Silberstreifen D-76287，Rheinstetten4/Karlstuhe，Germany)中進行分析。為了減小各向異性的線擴展，將種子樣品在鋯轉子上與磁場呈54.7度方向按照1kHz為單位進行旋轉。將由於液體狀油類產生的共振綜合反應相加，將AS11種子得到的數值以相對於野生型對照種子樣品反應的方式進行記錄，將後者設為1.00。
將固醇酯類通過Silica H板上的薄層層析從TLEs中分離出來，該層析用正己烷∶二乙醚∶甲酸(80∶20∶2，v/v/v)展開。將固醇酯從silica H上用氯仿∶甲醇(2∶1，v/v)洗脫後，通過皂化作用和隨後3N甲醇鹽酸對得到的脂肪酸的甲基化作用對固醇酯進行定量。該脂肪酸甲酯(FAMEs)通過前述的GC(Taylor等，1991)進行分析。通過皂化作用釋放游離固醇也通過GC在一個30m DB-5柱子上進行分析，GC溫度控制程序為起始溫度180℃，以10℃/分鐘速度將溫度提高到300℃，然後在此溫度下維持15分鐘。固醇酯含量以％TLE形式報導，即，計算從固醇酯中釋放的FAMEs佔從總脂類提取物(TLE)通過轉甲基作用釋放的FAMEs的比例。含有用於在野生型擬南芥中過量表達的和對擬南芥AS11突變株進行互補的野生型DGAT基因的植物轉化載體的構建兩個引物Gen1(GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG；[SEQ ID NO21])和Gen2(AAGAAGGATCCATCCCCAAAACGGGACCACCAA；[SEQ ID NO22])是根據TAG1基因上遊和下遊的序列進行合成的。這兩個引物用於PCR擴增一個來源於野生型擬南芥的5.1kb的基因組片段。該PCR片段用BamHI進行純化和消化，然後插入到質粒pRD400(Datla等，1992)上的相應位點，以產生植物轉化載體DGATg-pRD400。
用於種子特異性表達的DGAT cDNA植物轉化載體的構建將克隆得到的全長DGAT cDNA用作PCR擴增的模板，以DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQ ID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)作為引物用於在該序列兩端各提供一個新的限制位點。PCR參數特徵如下94℃ 1分鐘；94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘進行30個循環；72℃ 1分鐘；和72℃ 5分鐘。接著將得到的PCR產物連接到PCR-2.1載體(InVitrogen)中。通過Xbal/Kpnl的消化切下一個1.6kb的片段，將該片段連接到pSE129載體(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中相應的位點上。pSE129A是一個來源於植物轉化載體pRD400的載體(Dalta等，1992)。pSE129A載體含有克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位點上的種子特異性的napin啟動子和nos終止子(圖9)。因此，在DGAT-pSE129A結構中，擬南芥屬DGAT cDNA是位於napin啟動子控制之下。該結構的完整性通過序列分析確定。用植物DGAT載體結構轉化農桿菌屬通過如下步驟製備用於電穿孔的農桿菌屬細胞株，GV3101(pMP90)將農桿菌屬培養物在2YT培養基中培養24到48小時，當600nm的吸光度達到0.5-0.7時，將細胞在冰上冷卻然後通過離心(5000×g，4℃下在GSA轉子中離心10分鐘)使之沉澱。將沉澱物分別用1、0.5和0.02體積的10％無菌的冷甘油洗滌，然後重懸於0.01體積的10％冷甘油中。接著將得到的可用於電穿孔細胞在液氮中冷凍然後保存於-70℃條件下。按照製造商的說明將農桿菌屬細胞用20～50ng轉化DNA(DGATg-pRD400或DGAT-pSE129A)通過電穿孔法進行轉化，鋪平板於選擇性培養基(LB加入50μg/ml卡那黴素)上，然後在28℃條件下培養過夜。將單轉化細胞在加入50μg/ml卡那黴素和25μg/ml慶大黴素的5ml LB中培養過夜(28℃，225rpm)。DNA提取和純化用Qiaprep Spin Miniprep試劑盒進行(Qiagen)。該結構的忠實度通過在植物轉化前的DNA測序進行覆核。擬南芥的轉化轉化操作的方案根據Clough和Bent的方案(1998)進行修改而得到。擬南芥哥倫比亞生態型和突變體AS11(Katavic等，1995)的種子生長在22℃，螢光照明(120μE·m-2·s-1)，照明方案為16小時光照/8小時黑暗。典型的，4到6株植株生長在一個10cm2的小罐內的潮溼的Terra-lite Redi-earth中(W.R.Grace Co.Canada Ltd.Ajax，ON，Canada)。為了防止罐中的土壤混合物掉入培養介質中，將土壤堆成一個平臺後把種子撒播於其上部，然後用一個尼龍窗紗覆蓋在罐子上，用橡皮筋紮緊。當植物的第一朵花開放時，將植株在農桿菌懸浮液進行真空滲入。
為了使農桿菌生長，將5ml用含有50μg/ml卡那黴素和25μg/ml慶大黴素的LB培養基製成的細菌懸浮液於28℃條件下培養過夜。在滲入操作前一天，將上述「種子培養物」分到4個含有250ml LB培養基並補充有50μg/ml卡那黴素和25μg/ml慶大黴素的培養瓶中。將這些培養物在28℃條件下培養過夜。第二天早上，檢測過600nm的吸光度(約為1.0)後，通過離心(5000×g，室溫條件下在GSA轉子中離心10分鐘)收集細胞，然後用滲入培養基(5％蔗糖；0.005％Silwet-77的水溶液)重懸細胞沉澱使其在600nm的光學密度達到0.8。將農桿菌懸浮液轉移到燒杯中，再將小罐中的植株倒置放到燒杯中使花和莖浸入到懸浮液中。然後將燒杯放置到一個大的玻璃鐘罩內，用真空泵抽真空，直到在莖的表面出現氣泡而且整個溶液開始輕微冒泡為止，然後將真空迅速解除。[注所需要的壓力和時間會隨實驗室條件而變化，但好的滲透結果象均勻變黑、被水滲透的組織，是明顯可見的。]將小罐從燒杯上移開，側放在塑料盤中並用塑料圓蓋覆蓋以維持溼度。第二天，按照Katavic等(1995)的描述，除去植物上的圓蓋，直立放置並於生長室內在連續光照條件下生長約4個星期。當長角果實成熟並變幹後，收集種子並挑選陽性轉化體。推測的轉化體(轉基因植株)的選擇和轉基因植株的分析對每一種結構都收集大量的種子。將種子浸入含有20％漂白粉和0.01％Triton X-100的溶液20分鐘進行表面消毒，然後用無菌水清洗3次。將消毒後的種子在室溫條件下通過重懸於0.1％無菌phytagar中(每500-1000個種子大約用1ml phytagar)進行種板，然後將含有2,000-4,000顆種子的一個體積接種到150×15mm的卡那黴素選擇平板上。將平板在寒冷無光處培養2天，然後在一個人工控制的環境下(22℃條件下，以16小時光照/8小時黑暗的方式進行螢光照射120μE·m-2·s-1)生長7-10天。選擇培養基含有MSG培養基、0.8％phytagar、3％蔗糖、50μg/ml卡那黴素和50μg/ml特美汀。將培養皿和蓋子用MircroporeTM醫用橡皮膏(3M，Canada，London，ON，Canada)密封。7-10天後，具有綠色葉子和培養基內生長良好根系的藥物抗性植株被鑑定為轉化體，並且在3-5片葉期，將挑選出的轉化體移植到裝滿高溼度泥土混合物的淺箱中。轉化體生長到成熟階段後，從個體植株中收集成熟的種子(如Katavic等的描述的T2代)進行進一步分析。從轉化體分離DNA和轉化體的分析按照Dellaporta等(1983)方法從個體T1植株中分離基因組DNA。用前述的用於擴增DGAT cDNA或DGAT基因的成對引物進行PCR擴增反應，用於確定該cDNA或基因在T1轉化體內的存在進行Southern分析(Southern，1975)以挑選含有單拷貝插入片段的轉化體。用限制性內切酶(DGAT cDNA用Bgl II，DGAT基因用Eco RI)消化DNA樣品，在1％的瓊脂糖凝膠上電泳分離，然後根據Sambrook等(1989)的方法用尼龍濾膜(Hybond-N+，Amersham)進行Southern印跡。將用隨機引物DNA標記試劑盒(Gibco BRL)得到的α-[32P]dCTP(NEN/DuPont)標記的DGAT cDNA片段用作探針。根據Church和Gilbert(1984)的方法在60℃條件下進行雜交反應。然後用濾膜對於Kodak X-OMAT-AR底片進行日光。
保藏物信息下面的生物材料被保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.)。所有這些保藏物從所示的日期開始，按照布達佩斯條約的條款代表了申請人/受讓人(National Research Council ofCanada)的利益，並被給予了如下所示的保藏號。保藏材料 保藏日期 保藏號擬南芥DGAT基因1999年11月29日 PTA-988擬南芥DGAT cDNA 1999年11月29日 PTA-989擬南芥AS11種子1999年12月3日 PTA-1013保藏物收據稍後在本說明中顯示。序列表自由原文下面所提供的序列表含有關於SEQ ID NOs12到20的自由原文項目。序列表所用的自由原文重複如下SEQ ID NO12 DGATXbal引物SEQ ID NO13 DGATXhol引物SEQ ID NO14 引物DGAT1SEQ ID NO15 引物DGAT2SEQ ID NO16 引物DGAT3SEQ ID NO17 引物DGAT4SEQ ID NO18 引物ASEQ ID NO19 引物BSEQ ID NO20 引物CSEQ ID NO21 引物Gen1SEQ ID NO22 引物Gen2。
為了方便審閱在下面提供了所有列出序列的總結SEQ ID NO1-(pDGAT；含有經過分離和純化的脫氧核糖核酸cDNA；ATCC No PTA-989)，Genbank/EMBL保藏號AJ238008。
SEQ ID NO2-推測的擬南芥DGAT(AtTAG1)蛋白質的胺基酸序列。
SEQ ID NO3-(p基因組DGAT；含有經過分離和純化的基因組脫氧核糖核酸(基因組DNA)ATCC No PTA-989)SEQ ID NO4-MDGAT，小鼠DGAT[Genbank/EMBL保藏號AF078752(Cases等，1998)]。
SEQ ID NO5-HARGP1，人ARGP1蛋白[Genbank/EMBL保藏號AF059202；Oelkers等，1998]。
SEQ ID NO6-擬南芥表達的序列標記(EST)[保藏號AA042298]。
SEQ ID NO7-在SEQ ID NO2、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9中發現的二酯醯甘油/佛波醇酯結合基序(414HKWMVRHIYFP424)。
SEQ ID NO8-歐洲油菜DGAT胺基酸序列，Genbank/EMBL保藏號AF155224。
SEQ ID NO9-歐洲油菜DGAT胺基酸序列，Genbank/EMBL保藏號AF164434。
SEQ ID NO10-在SEQ ID NO2、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9中發現的SnRK1蛋白激酶家族成員典型的目標基序X-L200-X-K202-X-X-S205-X-X-X-V209。
SEQ ID NO11-在擬南芥AS11突變體中發現的SEQ ID NO2中27個胺基酸的插入重複。
131SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK157SEQ ID NO12-CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA(引物DGATXbal的核苷酸序列)。
SEQ ID NO13-GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA(引物DGATXhol的核苷酸序列)。
SEQ ID NO14-AGACACGAATCCCATTCCCACCGA(引物DGAT1的核苷酸序列)。
SEQ ID NO15-AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG(引物DGAT2的核苷酸序列)。
SEQ ID NO16-ATGGTCGCTCCCACATTGTGT(引物DGAT3的核苷酸序列)。
SEQ ID NO17-CATACAATCCCCATGACATTTATCA(引物DGAT4的核苷酸序列)。
SEQ ID NO18-CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG(引物A的核苷酸序列)。
SEQ ID NO19-GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG(引物B的核苷酸序列)。
SEQ ID NO20-TAAACAGTAGACTCATCATCG(引物C的核苷酸序列)。
SEQ ID NO21-GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG(引物Gen1的核苷酸序列)。
SEQ ID NO22-AAGAAGGATCCATCCCCAAAACGGGACCACCAA(引物Gen2的核苷酸序列)。
SEQ ID NO23-AS11突變體DGAT cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO24-AS11突變體DGAT基因組DNA核苷酸序列。
SEQ ID NO25-由SEQ ID NO23推導出的胺基酸序列。
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上述參考文獻的內容在此引入作為參考。
序列表110National Research Council of CanadaZou，JitaoTaylor，David CWei，YangdouJako，Colette C120來源於植物的二酯醯甘油轉醯基酶13043922pt140PCT/CA1411999-12-1615060/112，8121511998-12-1716025170PatentIn Ver.2.121012111904212DNA213Arabidopsis thaliana214擬南芥4001atttcttagc ttcttccttc aatccgctct ttccctctcc attagattct gtttcctctt 60tcaatttctt ctgcatgctt ctcgattctc tctgacgcct cttttctccc gacgctgttt 120cgtcaaacgc ttttcgaaat ggcgattttg gattctgctg gcgttactac ggtgacggag 180aacggtggcg gagagttcgt cgatcttgat aggcttcgtc gacggaaatc gagatcggat 240tcttctaacg gacttcttct ctctggttcc gataataatt ctccttcgga tgatgttgga 300gctcccgccg acgttaggga tcggattgat tccgttgtta acgatgacgc tcagggaaca 360gccaatttgg ccggagataa taacggtggt ggcgataata acggtggtgg aagaggcggc 420ggagaaggaa gaggaaacgc cgatgctacg tttacgtatc gaccgtcggt tccagctcat 480cggagggcga gagagagtcc acttagctcc gacgcaatct tcaaacagag ccatgccgga 540ttattcaacc tctgtgtagt agttcttatt gctgtaaaca gtagactcat catcgaaaat 600cttatgaagt atggttggtt gatcagaacg gatttctggt ttagttcaag atcgctgcga 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1620cgatttctta gcttcttcct tcaatccgct ctttccctct ccattagatt ctgtttcctc 1680tttcaatttc ttctgcatgc ttctcgattc tctctgacgc ctcttttctc ccgacgctgt 1740ttcgtcaaac gcttttcgaa atggcgattt tggattctgc tggcgttact acggtgacgg 1800agaacggtgg cggagagttc gtcgatcttg ataggcttcg tcgacggaaa tcgagatcgg 1860attcttctaa cggacttctt ctctctggtt ccgataataa ttctccttcg gatgatgttg 1920gagctcccgc cgacgttagg gatcggattg attccgttgt taacgatgac gctcagggaa 1980cagccaattt ggccggagat aataacggtg gtggcgataa taacggtggt ggaagaggcg 2040gcggagaagg aagaggaaac gccgatgcta cgtttacgta tcgaccgtcg gttccagctc 2100atcggagggc gagagagagt ccacttagct ccgacgcaat cttcaaacag gtttaaaatc 2160tcagaaatct tcgaatttgg tgtttgcttg ttgttttata tggaattgag tttggtgatt 2220gttttgcatt gcagagccat gccggattat tcaacctctg tgtagtagtt cttattgctg 2280taaacagtag actcatcatc gaaaatctta tgaaggtttg ctgttacttg tttctccttt 2340taggaattga attgcttgaa aatttatcat tgcattgcag agccatgccg gattattcaa 2400cctctgtgta gtagttctta ttgctgtaaa cagtagactc atcatcgaaa atcttatgaa 2460ggtttgctgt 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85 90 95Gly Arg Gly Asn Ala Asp Ala Thr Phe Thr Tyr Arg Pro Ser Val Pro100 105 110Ala His Arg Arg Ala Arg Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ile Phe115 120 125Lys Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile130 135 140Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Ser His Ala145 150 155 160Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile Ala Val Asn Ser Arg165 170 175Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp Leu Ile Arg Thr Asp180 185 190Phe Trp Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp Trp Pro Leu Phe Met Cys195 200 205Cys Ile Ser Leu Ser Ile Phe Pro Leu Ala Ala Phe Thr Val Glu Lys210 215 220Leu Val Leu Gln Lys Tyr Ile Ser Glu Pro Val Val Ile Phe Leu His225 230 235 240Ile Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro Val Tyr Val Thr Leu245 250 255Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr Leu Met Leu Leu Thr260 265 270Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala His Thr Ser Tyr Asp275 280 285Ile Arg Ser Leu Ala Asn Ala Ala Asp Lys Ala Asn Pro Glu Val Ser290 295 300Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe Met Val Ala Pro Thr305 310 315 320Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Ala Cys Ile Arg Lys Gly325 330 335Trp Val Ala Arg Gln Phe Ala Lys Leu Val Ile Phe Thr Gly Phe Met340 345 350Gly Phe Ile Ile Glu Gln Tyr Ile Asn Pro Ile Val Arg Asn Ser Lys355 360 365His Pro Leu Lys Gly Asp Leu Leu Tyr Ala Ile Glu Arg Val Leu Lys370 375 380Leu Ser Val Pro Asn Leu Tyr Val Trp Leu Cys Met Phe Tyr Cys Phe385 390 395 400Phe His Leu Trp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Leu Leu Cys Phe Gly Asp405 410 415Arg Glu Phe Tyr Lys Asp Trp Trp Asn Ala Lys Ser Val Gly Asp Tyr420 425 430Trp Arg Met Trp Asn Met Pro Val His Lys Trp Met Val Arg His Ile435 440 445Tyr Phe Pro Cys Leu Arg Ser Lys Ile Pro Lys Thr Leu Ala Ile Ile450 455 460Ile Ala Phe Leu Val Ser Ala Val Phe His Glu Leu Cys Ile Ala Val465 470 475 480Pro Cys Arg Leu Phe Lys Leu Trp Ala Phe Leu Gly Ile Met Phe Gln485 490 495Val Pro Leu Val Phe Ile Thr Asn Tyr Leu Gln Glu Arg Phe Gly Ser500 505 510Thr Val Gly Asn Met Ile Phe Trp Phe Ile Phe Cys Ile Phe Gly Gln515 520 525Pro Met Cys Val Leu Leu Tyr Tyr His Asp Leu Met Asn Arg Lys Gly530 535 540Ser Met Ser54權利要求
1.經過分離和純化的脫氧核糖核酸(DNA)，其特徵在於該DNA包括SEQ ID NO1序列或SEQ ID NO1序列的一部分、或與SEQ ID NO1基本同源的序列。
2.經過分離和純化的脫氧核糖核酸(DNA)，其特徵在於該DNA包括SEQ ID NO3序列或SEQ ID NO3序列的一部分、或與SEQ ID NO3基本同源的序列。
3.一個轉化植物細胞的載體，其特徵在於該載體含有SEQ IDNO1序列或SEQ ID NO1序列的一部分、或與SEQ ID NO1基本同源的序列的脫氧核糖核酸序列。
4.一個轉化植物細胞的載體，其特徵在於該載體含有SEQ IDNO3序列或SEQ ID NO3序列的一部分、或與SEQ ID NO3基本同源的序列的脫氧核糖核酸序列。
5.一個轉化植物細胞的載體，其特徵在於該載體含有SEQ IDNO23的脫氧核糖核酸序列，SEQ ID NO23是經過改變以含有一個81bp插入序列的SEQ ID NO1，因此推導出的所編碼蛋白質的胺基酸序列含有SEQ ID NO25的重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或者被保守性替換所取代。
6.一個根據權利要求3或權利要求5的載體，其特徵在於該序列以有義方向存在於該載體中。
7.一個根據權利要求3的載體，其特徵在於該序列以反義方向存在於該載體中。
8.質粒pDGAT cDNA(ATCC PTA-989)。
9.質粒pDGAT基因(ATCC PTA-988)。
10.具有特定基因組的植物，其特徵在於該基因組含有導入的核苷酸序列，該序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的一部分，或與SEQ ID NO1基本同源的序列。
11.具有特定基因組的植物種子，其特徵在於該基因組含有一個導入的核苷酸序列，該序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的一部分，或與SEQ ID NO1基本同源的序列。
12.一種遺傳轉化植物，其特徵在於該植物基因組被權利要求3或權利要求4或權利要求5的載體所轉化。
13.一種遺傳轉化植物種子，其特徵在於該植物種子的基因組被根據權利要求3或權利要求4或權利要求5的載體所轉化。
14.根據權利要求11或權利要求13的植物種子，其特徵在於與基因組未作修飾植物的統計學顯著性數量種子的平均水平相比顯示出改變的籽油含量，兩者生長在相同時期、相同生長條件下，具有相同的基因型。
15.根據權利要求11或權利要求13的植物種子，其特徵在於與基因組未作修飾植物的統計學顯著性數量種子的平均水平相比在籽油中顯示出改變的二酯醯甘油含量，兩者生長在相同時期、相同生長條件下，具有相同基因型。
16.根據權利要求11或13的植物種子，其特徵在於與基因組未作修飾植物的統計學顯著性數量的種子的平均水平相比顯示出具有改變的脂肪醯基組成的籽油，兩者生長在相同時期、相同生長條件下，具有相同的基因型。
17.根據權利要求10或12的植物，其特徵在於與統計學顯著性數量的基因組未作修飾植物平均水平相比顯示出增加的生物量，兩者生長在相同時期、相同生長條件下，具有相同的基因型。
18.根據權利要求11或13的種子，其特徵在於與基因組未作修飾植物的統計學顯著性數量種子的平均水平相比顯示出增加的生物量，兩者生長在相同時期、相同生長條件下，具有相同的基因型。
19.一種通過將核酸序列導入特定植物的基因組而得到相應轉基因植物的方法，其特徵在於導入該基因組的核酸序列包括SEQ IDNO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一部分，或一個與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或它們的一部分基本同源的序列，或一個與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQID NO23]的SEQ ID NO1基本同源的序列，因此，推導出的編碼蛋白質的胺基酸序列含有SEQ ID NO25的重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或被保守替換所取代。
20.根據權利要求19的一種方法，其特徵在於該植物是十字花科的成員。
21.根據權利要求19的一種方法，其特徵在於該植物選自擬南芥、琉璃苣(Borago種)、canola、蓖麻(Ricinus comm unis)、可可豆(Theobroma cacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium種)、海甘藍、萼距花種、亞麻(Linum種)、Lesquerella和Limnanthes種、linola、旱金蓮(Tropaeolum種)、月見草、橄欖樹(Olea種)、棕櫚樹(Elaeis種)、花生(Arachis種)、油菜籽、紅花(Carthamus種)、大豆(Glycine和Soja種)、向日葵(Helianthus種)、菸草(Nicotiana種)、Vernonia種、小麥(Triticum種)、大麥(Hordeum spp)、水稻(Oryza種)、燕麥(Avena種)、高梁(Sorghum種)、黑麥(Secale種)或其它禾本科成員。
22.一個植物DNA序列或其部分，其特徵在於該序列至少與SEQID NO1或SEQ ID NO3的部分基本同源，還在於該序列已經利用由SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ ID NO23]的SEQ ID NO1得到的序列信息被分離、表徵或設計，因此，推導出的編碼蛋白質的胺基酸序列含有SEQ ID NO25的重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或被保守替換所取代。
23.一種通過以有義或反義方向將核酸結構導入植物轉化載體，利用該載體轉化植物或植物種子的基因組，然後種植該植物或植物種子，從植物種子中提取籽油以改變植物種子的籽油中油含量、醯基組成或二酯醯甘油/三酯醯甘油比例的方法，其特徵在於該核酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO3，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一個部分，或一個與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ ID NO23]的SEQ ID NO1基本同源的序列，因此，推導出的編碼蛋白質的胺基酸序列含有SEQ ID NO25的重複序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下劃線的胺基酸的間隔和同一性是相同的或被保守替換所取代。
全文摘要
本發明涉及植物二酯醯甘油醯基轉移酶(DGAT)基因及相關基因產品的分離、純化、表徵和利用。例如,本發明提供了DGAT cDNA[SEQ ID No:1](pDGATcDNA;ATCC No.PTA－989)和一種來源於十字花科植物(特別是擬南芥)的二酯醯甘油醯基轉移酶基因[SEQ ID No:3](pDGATgene;ATCC No.PTA－988)。本發明包括經過分離和純化的DGAT DNA,優選的是所述序列和同源染色體,以及涉及使用該基因調節籽油含量、籽油中二酯醯甘油/三酯醯甘油部分的比例、脂肪酸合成、籽油醯基組成、種子體積/重量比和進入其他種子組份的碳代謝流量的方法和涉及被該基因轉染的植物或組織。本發明也涉及含有特定基因組的轉基因植物、植物組織和植物種子,該特定基因組含有本發明引入的DNA序列,以及生產該植物和植物種子的方法。本發明也涉及含有一個81bp插入序列[SEQ ID No:23]的[SEQ ID No:1]序列,以及該序列在改變籽油含量、三酯醯甘油的醯基組成、種子大小或其他種子組份的碳代謝流量方面的用途。
文檔編號C12N15/54GK1352690SQ99816248
公開日2002年6月5日 申請日期1999年12月16日 優先權日1998年12月17日
發明者J·鄒, D·C·泰勒, Y·魏, C·C·雅科 申請人:加拿大國家研究局 被以下專利引用 (4),