多肽的製作方法

2023-05-25 12:09:36

專利名稱：多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及多肽，更具體地，具有纖維素降解活性的多肽，其有助於生物量的有益應用。本發明也涉及通過基因工程對產生上述多肽有用的基因。
背景技術：
纖維素用(C6H10O5)n表示。含有纖維素並作為主要成分的物質有，以樹木為例，如松樹、香柏、山毛櫸和白楊；以莖和韌皮為例，如大麻、紙灌木、稻杆、蔗渣和穀殼；種子絨毛如棉花；舊紙張例如報紙、雜誌和起皺的厚紙板廢紙；其他的纖維廢物；還有纖維素粉和類似物。近來，辦公室的舊紙張開始增多。
纖維素分子的結構是D-吡喃葡萄糖通過β-1，4鍵相連並且沒有側鏈。因此，纖維素由葡萄糖組成，其可作為用於酒精發酵的原材料。如果能將纖維素降解為葡萄糖，從舊紙張或纖維廢物中，製造用作燃料或類似物的酒精就將成為可能。
已經將通過酸方法或酶方法將纖維素水解為葡萄糖作為降解(糖化)纖維素的方法。在酸方法中，將纖維素與鹽酸或硫酸接觸，劇烈降解纖維團塊。因為難於適當判定該水解狀態，在強酸存在的情況下，此產生的葡萄糖可繼續反應。因此，該酸方法具有難以高產量回收葡萄糖或類似的問題。所以，現在還沒有實際應用該酸方法。相反地，應用纖維素水解酶的酶方法具有高度反應選擇性，並且就環境保護而言是有優勢的。因此該酶方法已成為水解方法的主要方法。多種方法已有報導[Wood，B.E.，等人，生物技術進展(BiothechnologyProgress)，13223-237(1997)；美國專利號5，508，183；ZhaoXin，等人，酶微生物技術(Enzyme Microbial Technology)，1562-65(1993)，等等]。
纖維素水解酶，例如有內切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.74)和纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)。內切葡聚糖酶的推薦名稱是纖維素酶，並且該系統名稱是1，4-(1，3，1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶。
經常將含有內切葡聚糖酶、β-D-葡糖苷酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶、維維水解酶和類似物的混合物用於水解纖維素。這些酶協同作用於纖維素，將其降解成葡萄糖。已知有多種關於該作用方式的學說。Murao等人，已經推薦以下模型。首先，通過內切葡聚糖酶作用，將斷裂導入纖維素的非-結晶區域。在破壞該晶體時，纖維二糖水解酶作用於該裂隙。通過內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的作用產生寡糖。通過β-D-葡糖苷酶的作用將寡糖降解，產生葡萄糖[Sawao Murao等人，「纖維素酶(Cellulase)」，pp.102-104，Kodansha(May10，1987)]大多數情況下，纖維素不以單纖維素鏈的形式存在。形成許多纖維素鏈通過氫鍵結合的結構。在此結構中，有其中許多纖維素鏈密集積聚的結晶區域和其中纖維素鏈散置的非-結晶區域。在酶方法的水解反應中，限速步驟是在結晶區域分離和分散許多纖維素鏈的步驟。相應地，在高溫下進行酶降解反應具有以下好處(1)因為纖維素晶體易於破壞，該反應高效進行；(2)各種細菌汙染的危險性很小；並且(3)在需要加熱的工業過程中，在酶反應之前毋需冷卻。
已知取自激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)的β-D-葡糖苷酶、取自熱球菌SP.的β-D-葡糖苷酶、內切葡聚糖酶和取自海棲熱袍菌(Thermotoga Maritima)、取自那不勒斯棲熱袍菌(ThermotogaNeapolitana)及其類似菌的內切葡聚糖酶和β-D-葡糖苷酶為取自極嗜熱生物的纖維素水解酶。[Bauer等人，現代生物技術評論(CurrentOpinion In Biotechnology)，9141-145]。描述取自極嗜熱生物的β-D-葡糖苷酶基因克隆，例如，見美國專利號5,744,345。描述取自極嗜熱生物的內葡聚糖酶基因克隆，例如，見WO97/44361。
已經從嗜熱菌、棲熱袍菌sp.EJSS-B.1分離出纖維二糖水解酶[Ruttersmith，等人，生物化學雜誌(Biochemical Journal)，277887-890(1991)]。因為該酶的纖維二糖的抑制常數(Ki)是低的(0.2mM)，所以該酶易於產生抑制作用。應用4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷作為底物的特異活性的是3.6U/mg。而且，因為該細菌需在高溫厭氧狀況下進行培養，大量地工業生產該酶是困難的。再者，該酶不能通過基因工程產生，因為還未克隆編碼該酶的基因。
發明目的本發明的該主要目的是提供對纖維二糖具有高抑制常數和具有熱抵抗性的纖維二糖水解酶，以及低成本生產上述纖維二糖水解酶的方法。發明概述已經測定出全部堀越熱球菌OT3(Pyrococcus Horikoshii OT3)基因組DNA的核苷酸序列[Kawarabayasi，等人，DNA研究(DNAResearch)，555-76(1998)；Kawarabayasi，等人，DNA研究，5147-155(1998)]。已經公布一些蛋白質在胺基酸序列中，與由各自開放閱讀框架獲得的蛋白質具有同源性。(http//www.bio.nite.go.jp/ot3db_index.html)。根據與編碼在此目錄中已知纖維素水解酶的核酸同源性的比較，已經預言在堀越熱球菌OT3基因組中編碼例如α-澱粉酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶和內切葡聚糖酶多肽的開放閱讀框架的存在。但是還未預言與編碼已知的纖維二糖水解酶的核酸具有同源性的開放閱讀框架的存在。
經過深入細緻的研究，本發明者發現在堀越熱球菌OT3基因組中存在編碼具有纖維二糖水解酶酶活性的多肽的開放閱讀框架(PH1171)。意想不到地是，證實儘管其與多種內切葡聚糖酶包括取自古細菌AEPIIIa的內葡聚糖酶具有同源性，具有通過該開放閱讀框架編碼的胺基酸序列的多肽具有纖維二糖水解酶活性。而且本發明者已經建立通過基因工程產生該多肽的方法。因此，本發明已經成功完成。
本發明提供如下內容(1)具有SEQ ID NO1胺基酸序列，或具有在SEQ ID NO1胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基缺失、加入、插入和/或替換所得胺基酸序列的多肽，並且其具有纖維二糖水解酶活性；(2)上述(1)中的多肽，其具有熱穩定性纖維二糖水解酶活性；(3)編碼上述(1)或(2)中的多肽的核酸；(4)上述(3)中的核酸，其具有SEQ ID NO2核苷酸序列；(5)編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，其能在嚴格的條件下與上述(3)中的核酸序列雜交；
(6)上述(5)中的核酸，其編碼具有熱穩定性纖維二糖水解酶活性的多肽；(7)含有上述(3)至(6)中任一項的核酸的重組DNA；(8)用上述(7)中的重組DNA轉化的轉化體；(9)產生上述(1)中多肽的方法，該方法包括培養上述(8)中的轉化體和從培養物中收集具有纖維二糖水解酶活性的多肽；(10)降解通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，該方法包括使上述(1)中的多肽作用於通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物，以釋放纖維二糖；(11)具有纖維二糖水解酶活性和對纖維二糖的抑制常數Ki大於或等於10mM的多肽；和(12)上述(11)中的多肽，其在95℃ 5小時的處理後，能保持20％或更多的纖維二糖水解酶活性。
附圖簡述

圖1圖示本發明之多肽的CMC-降解活性與反應pH的關係。
圖2圖示本發明之多肽的CMC-降解活性與反應溫度的關係。
圖3圖示反應混合物中NaCL濃度對本發明之多肽的CMC-降解活性的影響。
圖4圖示當該多肽在95℃加熱10分鐘時，該處理pH與本發明之多肽的CMC-降解活性的關係。
圖5圖示當該多肽在95℃加熱時，該處理時間與本發明之多肽的CMC-降解活性的關係。
圖6圖示本發明之多肽的pNPC-降解活性與本發明之多肽用量的關係。
圖7圖示多種試劑對本發明之多肽的pNPC-降解活性的影響。
發明詳述1.本發明之多肽本發明之多肽的特徵是具有SEQ ID NO1胺基酸序列，或具有在SEQ ID NO1胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基缺失、加入、插入和/或替換所得胺基酸序列，並且具有纖維二糖水解酶活性。
在此處應用，纖維二糖水解酶活性是指水解由β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖組成的多糖或寡糖、由β-1，4鍵相連的D-葡萄糖的二糖中的糖苷鍵以產生纖維二糖的活性，但是不水解在纖維素中的糖苷鍵。通過已知的方法，舉例說明用於檢測纖維二糖水解酶活性的方法，其中應用磷酸膨脹纖維素作為底物進行酶反應，並且通過薄層矽膠層析證實在反應中纖維二糖的存在。
本發明之多肽具有纖維二糖水解酶活性。該多肽可具有其它糖苷酶活性，例如內切葡聚糖酶活性和β-D-糖苷酶活性。
在一實施例中，具有熱穩定性纖維二糖水解酶活性是本發明之多肽的特徵。
本文中所用「熱抵抗性」是指多肽具有酶活性，在一段需要降解纖維素的時間內，從生物量生產酒精的工業進程中，其在高溫情況下進行溫育時不發生不可逆變性。本文所用不可逆變性是指永久和完全的酶活性的喪失。下文中，具有熱抵抗性的纖維二糖水解酶活性是指熱穩定性纖維二糖水解酶活性。儘管未特意對本發明加以限定，在75℃ 20分鐘、95℃ 10分鐘或95℃ 5小時的處理後，具有SEQ ID NO1胺基酸序列的該多肽保持80％或更多的纖維二糖水解酶活性。而且，在如90℃或更高，或100℃或更高的高溫條件下，該多肽仍表現出纖維二糖水解酶。在95℃ 5小時的處理後，具有熱穩定性纖維二糖水解酶活性的本發明之多肽，保持優選地20％或更多的、更優選地40％或更多的、最優選地80％或更多的纖維二糖水解酶活性。
作為本發明該多肽實施例的具有SEQ ID NO1胺基酸序列的多肽，具有從，例如磷酸膨脹纖維素或纖維寡糖中產生纖維二糖的活性。該多肽熱穩定性纖維二糖水解酶活性的最佳pH為5到6.5。在65℃到113℃該多肽表現熱穩定性纖維二糖水解酶活性。該多肽具有高熱抵抗性。在底物存在時，在pH6、95℃下，加熱5小時後，其保持大約90％的活性。在另外加熱24小時後，大約80％的該活性得以保持。在無底物時，在95℃、pH5-7將該多肽加熱10分鐘時，該活性未曾降低。應用4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷作為底物，在98℃、pH6.0下20分鐘的反應中，當進行該提純的多肽的纖維二糖水解酶活性測定時，該比活性為17.0U/mg。
該多肽可作用於羧甲基纖維素(CMC)或纖維寡糖。也可以將糖還原端的量作為指數，檢測該多肽的纖維二糖水解酶活性，其還原端是以CMC或纖維寡糖作為底物產生的。該多肽也作用於發色團底物，例如對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷，或作用於螢光底物，例如，4-甲基繖形基-β-D-纖維二糖苷。因此通過檢測反應中產生的發色團或螢光物質的量，可方便地檢測該多肽的纖維二糖水解酶活性。
在0.5-1.0M NaCl存在的情況下，該多肽表現最大熱穩定性纖維二糖水解酶活性。無NaCl存在，該多肽表現在0.5M NaCl存在情況下的大約80％的表現活性。在2.5M NaCl存在的情況下，該多肽表現在0.5M NaCl存在情況下的大約60％的表現活性。因此，NaCl濃度對熱穩定性纖維二糖水解酶活性的影響是很小的。
在一實施方案中，反應產物，例如，纖維二糖或葡萄糖對本發明之多肽的纖維二糖水解酶活性的抑制作用是很小的。該多肽對纖維二糖的抑制常數(Ki)優選大於或等於10mM，更優選大於或等於30mM，最優選大於或等於100mM。例如，含有SEQ ID NO1胺基酸序列的本發明之多肽對纖維二糖的抑制常數為212mM。在本發明之前，未知有對纖維二糖具有如此高抑制常數的多肽。幾乎沒有發現葡萄糖對該活性的抑制。而且，與未存在這些試劑時相比，0.5mM Fe3+、Cu2+或Zn2+抑制大約90％的該活性，或1mM Co3+、Ca2+、Mg2+或乙二胺四乙酸抑制大約50％的該活性。幾乎未發現10mM二硫蘇糖醇對該活性的抑制作用。
只要其表現纖維二糖水解酶活性，本發明之多肽包括具有在SEQID NO1胺基酸序列中一個或多個胺基酸殘基的缺失、添加、插入和/或替換得來的胺基酸序列的多肽。
在自然發生的蛋白質中可產生突變，例如，在胺基酸序列中胺基酸的缺失、插入、添加或替換。由於編碼該蛋白質DNA的多態性或突變，或由於在體內或合成後提純時蛋白質的修飾，可產生這些突變。但是，已知如果這些突變的部分表現對該蛋白質的活性或結構的保留不重要的話，這些突變蛋白質可表現與那些無突變的蛋白質實質相等的生理或生物活性。
對蛋白質而言，將突變人工地引入蛋白質的胺基酸序列中是可行的。在此情況下，可能產生更多的突變。例如，已知用絲氨酸替換人白介素-2(IL-2)胺基酸序列中的半胱氨酸殘基得到的多肽保留白介素-2的活性(科學(Science)，2241431(1984))。
而且，已知某些蛋白質具有對它們的活性非絕對必要的肽區域。例如，這些肽區域可以是細胞外分泌的蛋白質中的信號肽或蛋白酶前體中發現的前序列。在翻譯後或轉化為活性蛋白質時，將多數此類區域去除。此蛋白質具有與未去除該區域的蛋白質不同的一級結構，但是最終表現相等的功能。該SEQ ID NO1胺基酸序列是將SEQ ID NO5胺基酸序列的N-端28個胺基酸殘基的信號域去除後得到的序列。具有SEQ ID NO6核苷酸序列的核酸，編碼具有SEQ ID NO5胺基酸序列的多肽。當培養具有含此核酸載體的大腸埃希氏桿菌時，將該信號肽從該表達多肽中去除，並且產生具有SEQ ID NO1胺基酸序列的多肽。
當通過基因工程生產蛋白質時，可將與靶蛋白質活性無關的肽鏈添加在該蛋白質的氨基端或羧基端。例如，為了增加靶蛋白質的表達水平，可以製備融合蛋白質，其中將在所用宿主中高表達的蛋白質的部分氨基端區域添加在該氨基端區域。可選擇地，為促進該表達蛋白質的提純，在該靶蛋白質的氨基或羧基端可添加對特定物質具有親和力的肽。如果其對靶蛋白質的活性沒有有害影響的話，可保持該添加的多肽的添加。如果需要的話，通過適宜的處理，為能夠將其從靶蛋白質中去除，可對其進行操作，比如，應用蛋白酶的限制性酶切。
這樣，只要其具有纖維二糖水解酶活性，具有在此處所示胺基酸序列(SEQ ID NO1)中一個或多個胺基酸殘基缺失、插入、添加和/或替換後得到的胺基酸序列的多肽包括在本發明之內。優選地，該多肽具有熱穩定性纖維二糖水解酶活性和對纖維二糖的高抑制常數。
例如通過，(1)從產生本發明之多肽的微生物的培養物中提純，或(2)從含有編碼本發明之多肽的核酸的轉化體的培養物中提純，能夠產生本發明之多肽。
(1)從產生本發明之多肽的微生物的培養物中提純例如，堀越熱球菌OT3(JCM9974)是產生本發明之多肽的微生物，其可以在日津(物理和化學研究所)買到。
在適宜該微生物生長的條件下培養該微生物。優選地，應用增加興趣多肽表達水平的培養條件。根據用於提純蛋白質的傳統方法，提純在細胞中或培養物中產生的興趣多肽。
可將傳統用於培養超嗜熱菌的方法用於上述的細菌株的培養。將細菌株可利用的營養成分加入培養基中。例如，澱粉可用作碳源，胰腖、蛋白腖和酵母提取物可作為氮源。可將金屬鹽，例如，鎂鹽、鈉鹽或鐵鹽加入培養基中作為微量元素。而且，例如，將人工海水用於培養基的製備可以是有益的。需要不含固體緩衝劑的乾淨培養基。應用此培養基，通過檢測培養物的濁度，可隨時進行細胞生長的檢測。
該培養可以是直立式或旋轉式培養。例如，可應用如在應用和環境微生物(Applied and Environmental Microbiology)552086-2088(1992)中描述的透析培養方法。一般地，該培養溫度優選95℃。培養大約16小時後，明顯數量的多肽常常在培養物中積聚。為使多肽的生產能力最大化，依據該細胞或所用培養基的成分來判定該培養狀態是優選的。
為獲取多肽，首先製備無細胞提取物。例如，通過離心、濾過或類似方法，從培養物中收集細胞，然後破壞細胞，可製備無細胞提取物。可從超聲處理、應用磁珠破裂、用裂解酶處理、應用表面活性劑和類似物處理的方法中，選擇提取該目標酶的高效的細胞破裂方法。如果該多肽分泌至培養物中，通過硫酸銨鹽析、超濾或類似的方法使該多肽濃縮。該濃縮的多肽用作無細胞提取物。傳統的提純蛋白質的方法可用於將多肽從獲得的無細胞培養物中分離。例如，可將硫酸銨鹽析、離子交換層析、疏水層析、凝膠濾過層析及類似的方法結合應用。
(2)從含有編碼本發明之多肽核酸的重組DNA轉化的轉化體培養物中進行的提純典型的編碼本發明之多肽的核酸序列如SEQ ID NO2中所示。從SEQ ID NO2核苷酸序列推算的本發明之多肽的胺基酸序列見於SEQ ID NO1中。這樣，關於本發明獲得的多肽典型的胺基酸序列見於SEQ ID NO1中。
該轉化的宿主不局限於某一種，例如可以是，大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母和絲狀真菌。
例如，應用含有pECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21、在T7啟動子下遊連接SEQ ID NO6的質粒可獲得本發明之多肽。從SEQ ID NO6核苷酸序列推算的本發明之多肽的胺基酸序列見於SEQ ID NO5中。將用pECEL211轉化的大腸埃希氏桿菌JM109命名為大腸埃希氏桿菌JM109/pECEL211，並於1998年12月11日將其保藏在通商產業省工業技術院生命工學人體技術研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，保藏號為FERM P-17075，1999年11月15日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-6939。
在傳統培養條件下，如，37℃下在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基(10g/l胰腖、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、pH7.2)中，通過培養具有pECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)直至對數生長期，向其加入終濃度0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷，並且在15℃下再行培養，可在培養細胞中表達該多肽。
在培養後，通過離心收集細胞，應用超聲破壞細胞並通過離心收集上清液，可將該上清液用作無細胞提取物。可將該無細胞提取物用於酶反應。通過應用已知的方法，例如，離子交換層析、凝膠濾過、疏水層析、硫酸銨鹽析，可以從該無細胞培養物中提純本發明之多肽。自然地，也可以將部分提純的產物用於酶反應。因為具有pECEL211的大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)表達的本發明之多肽是高度熱穩定性的，該培養細胞和/或該無細胞提取物，可以在，例如，在95℃加熱10分鐘以便提純。
或者，通過例如具有pNCEL101的枯草芽孢桿菌DB104可獲取本發明之多肽，該質粒中SEQ ID NO2 DNA與枯草芽孢桿菌蛋白酶啟動子下遊相連。具體地，通過在傳統條件下，如在含有10μg/ml卡那黴素的LB培養基中37℃過夜，培養具有pNCEL101的枯草芽孢桿菌DB104，可在培養物中積聚本發明之多肽。通過上述應用大腸埃希氏桿菌作為宿主用於生產的已知方法，可在培養物中提純本發明之多肽。
如上所述，當在常溫(例如37℃)下應用編碼該多肽的核酸表達本發明之多肽時，產生的表達產物保持活性、熱抵抗性及類似性質。也就是說，即使在與原有生產細胞的生長溫度明顯不同的溫度下表達本發明之多肽，本發明之多肽能表現出其固有的更加規則的結構。
2.本發明的核酸本發明的核酸是編碼上述本發明之多肽的核酸。具體地，例證是(1)編碼一種多肽的核酸，該多肽具有SEQ ID NO1胺基酸序列，或具有在SEQ ID NO1胺基酸序列中缺失、添加、插入和/或替換一個或多個胺基酸殘基所得到的胺基酸序列，並且該多肽具有纖維二糖水解酶活性；(2)具有SEQ ID NO2核苷酸序列的核酸；(3)編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，在嚴格條件下能與上述(1)或(2)中的核酸雜交的核酸。
本文中所指的核酸意為單鏈或雙鏈DNA或RNA。
如果上述(2)中所述的核酸是RNA的話，其表示的核苷酸序列是SEQ ID NO2核苷酸序列，其中用U替換T。
例如，可以通過以下方法獲取本發明的核酸。
如上所述，為得到本發明之多肽，可以從堀越熱球菌OT3(JCM9974，日津)中分離上述(2)的含有SEQ ID NO2核苷酸序列的核酸。
而且，以編碼本發明提供之多肽的核酸的核苷酸序列為基礎，可獲取編碼具有與本發明之多肽相似的纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸。具體地，可通過應用編碼本發明之多肽的核酸或該核酸的一部分作為探針進行雜交，或應用引物進行基因擴增方法如PCR，來篩選編碼具有細胞生物水解活性之多肽的DNA。通過這樣的方法，可獲得上述(1)和(3)中的核酸。
通過上述方法，可獲取僅含有部分興趣核酸的核酸片段。在這種情況下，通過下面的方法可獲得完整的興趣核酸。測定所得核酸片段的核苷酸序列以確認該片段為興趣核酸的一部分。應用該核酸片段或其部分作為探針進行雜交。或者，應用以該核酸片段的核苷酸序列為基礎而合成的引物進行PCR。
「嚴格條件下的雜交」是指能夠例如，在以下條件下進行雜交。固定有核酸的膜與探針在含有0.5％SDS、0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可400和0.01％變性鮭精核酸的6×SSC(1×SSC、0.15M NaCl、0.015檸檬酸鈉，pH7.0)中，50℃下溫育12-20小時。溫育後，在含有0.5％SDS的2×SSC中，37℃下洗滌該膜，其間，使SSC濃度降至0.1×，溫度升至50℃直至所固定的核酸信號能夠與背景區分開來，然後檢測該探針。如上所述測定由所得的新核酸編碼的蛋白質的活性，從而確認該核酸是否為目標核酸。
另外，向該核酸插入合適的表達載體或類似物以構建含有本發明之核酸的重組DNA。然後產生含有該重組DNA的轉化體。該轉化體可用於工業生產該多肽。
如上所述，本發明也包括不同於此處所發現之核苷酸序列的核苷酸序列，只要其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
已知每一胺基酸由1-6個定義基因中的胺基酸的密碼子(3聯體鹼基)來確定。這樣，根據其胺基酸序列，許多核酸可編碼一特定的胺基酸序列。自然條件下的核酸並不穩定。常常在核苷酸序列中產生突變。核酸中產生的突變可能不會改變所編碼的胺基酸序列(此命名為沉默突變)。在這種情況下，編碼相同胺基酸的不同核酸得以產生。這樣，不能否認在含有編碼一特定胺基酸序列的獨立核酸的有機體傳代過程中，可產生編碼相同胺基酸序列的多種核酸。還有，應用基因工程的多種方法不難人工產生編碼相同胺基酸序列的多種核酸。
例如，如果原來編碼靶蛋白質的核酸中所用的密碼子，在通過基因工程(的方法)產生該蛋白質的所用宿主中使用率很低的話，該蛋白質表達水平可能很低。在這種情況下，為了增加靶蛋白質的表達水平而不改變該編碼的胺基酸序列，人工地將該密碼子轉換成在宿主中常用的密碼子(例如，JP-B7-102146)。如上所述，當然能人工製備多種編碼一特定胺基酸序列的多種核酸。它們也可以在自然條件下產生。
3.應用本發明之多肽降解通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合體的方法可將本發明之多肽用於從通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物釋放纖維二糖。在本發明中對通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合體中葡萄糖的聚合化程度沒有特別限定。該聚合物包括纖維三糖和纖維素。用SEQ ID NO1表示的本發明之多肽是高度熱穩定性的。其可更有效地降解纖維素，部分由於通過加熱與底物的結構變化相協同的效應。
具體地，通過例如，使具有SEQ ID NO1胺基酸序列的多肽與底物98℃下在50mM MES-NaOH緩衝劑中(pH6.0)的反應，可釋放纖維二糖。自然地，根據底物的類型(纖維素、纖維四糖、等等)，該反應條件可以變化。可將本發明之多肽加入自由狀態的底物懸浮液中。但是，如果該多肽與固定在適宜載體上的底物反應的話，反應後該多肽容易復原。
而且，通過共同應用熱穩定的內葡聚糖酶、外-1，4-β-D-糖苷酶、β-D-糖苷酶與本發明之多肽，高效地降解纖維素為D-葡萄糖是可能的。
實施例下面的實施例還詳細地說明本發明，但無意於限定其範圍。
在本文描述的操作中，包括質粒DNAs的製備和限制性酶切在內的基礎操作按T.Maniatis等人(eds)，分子克隆實驗室手冊第二版(1989)冷泉港實驗室中所述進行。除非另外說明，大腸埃希氏桿菌JM109或HB101用作利用大腸埃希氏桿菌構建質粒的宿主，並且在37℃富氧情況下，應用含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基(1％胰腖、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.0)或通過向LB培養基中加入濃度為1.5％的瓊脂並固化該產生的混合物而製備的LB平板進行培養。
實施例1含有堀越熱球菌OT3基因組中開放閱讀框架PH1171的重組DNA的構建。
(1)含有開放閱讀框架PH1171的DNA的製備。
依據堀越熱球菌OT3基因組的核苷酸序列合成含有SEQ ID NO3的核苷酸序列的寡核苷酸1171FN和含有SEQ ID NO4的核苷酸序列的寡核苷酸1171RA，以便通過PCR，以堀越熱球菌OT3基因組DNA作為模板獲取含有開放閱讀框架PH1171的約1.6-Kb的擴增DNA片段。
在95℃JCM目錄(Riken)所述的培養基中培養堀越熱球菌OT3JCM9974(購自Riken)16小時。從培養的細胞中提純基因組DNA。
為了獲取含有開放閱讀框架PH1171的DNA，以寡核苷酸1171FN和1171RA作為引物對，上述基因組DNA作為模板進行PCR。依據TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)所附的實驗方法進行該PCR，方法如下94℃ 0.5分鐘進行25個循環、50℃ 2分鐘和94℃ 1.5分鐘。將該PCR產物進行瓊脂糖膠電泳。將約1.6kb的擴增DNA片段提取和純化。對所得DNA的核苷酸序列進行分析表明，該DNA含有開放閱讀框架PH1171。
(2)重組DNA pECEL101的構建用限制酶StuI和AvaI(均來自Takara Shuzo)酶切上述(1)中獲取的約1.6kb的擴增的DNA片段，用T4 DNA聚合酶(TakaraShuzo)切平末端並進行瓊脂糖膠電泳。然後將大約1.5kb的擴增的DNA片段提取和純化。另一方面，用限制酶BamHI(Takara Shuzo)酶切pET21a(Novagen)，用鹼性磷酸酶(Takara Shuzo)將其去磷酸化並用T4 DNA聚合酶切平末端。應用DNA連接酶(Takara Shuzo)將該平端DNA片段連接。該連接混合物用於轉化大腸埃希桿菌JM109。篩選幾個轉化體，並且純化含在各自轉化體中的質粒DNAs。製備質粒DNAs的限制酶圖譜，以篩選其中開放閱讀框架PH1171在載體中與T7啟動子具有相同插入方向的質粒DNA。將所選的質粒DNA命名為pECEL101。
(3)重組DNA pECEL211的構建按下面的方法製備由上述(1)中所得約1.6-kb的擴增DNA片段和pET21d(Novagen)組成的重組DNA。
上述(1)中所得約1.6kb的擴增DNA片段用AvaI酶切，用T4 DNA聚合酶切平末端並用限制酶NcoI(Takara Shuzo)酶切以使PH1171的第一個密碼子操作性地置於pET21d中T7啟動子的下遊。另一方面，pET21d用BamHI酶切，T4 DNA聚合酶切平末端，NcoI酶切並用鹼性磷酸酶去磷酸化。
應用DNA連接酶連接上述方法處理的該兩DNA片段。該連接混合物用於轉化大腸埃希氏桿菌JM109。篩選幾個轉化體，並進行培養。純化各自轉化體中含有的質粒DNAs。製備質粒DNAs的限制酶圖譜，以篩選PH1171插入的質粒DNA。將所選的質粒DNA命名為pECEL211。含pECEL211的大腸埃希氏桿菌JM109命名為大腸埃希氏桿菌JM109/pECEL211，保藏於通商產業省工業技術院生命工學和人體技術研究所，保藏號為FERM BP-6939。
實施例2本發明之多肽的生產。
(1)多肽的表達將實施例1(3)製備的pECEL211或作為載體對照的pET21d用於轉化大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)(Novagen)。將每一產生的轉化體分別接種於5ml含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，並且在37℃富氧情況下過夜培養。在1％的濃度下，將該培養物接種到相同的新鮮的培養基中，並且在37℃富氧情況下培養。當濁度達到OD600＝0.4-0.7時，加入異丙基-β-D-硫吡喃半乳糖苷(IPTG，TakaraShuzo)使之終濃度為1mM。在15℃下再過夜培養該細胞。培養後，通過離心收集細胞，將其懸浮於0.5ml 100mM檸檬酸鈉緩衝劑(pH5.0)中並用超聲破碎。通過離心收集上清，將其用作無細胞提取物。
用纖維素水解酶比如內切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶降解纖維素時，新產生葡萄糖殘基的還原端。然後，根據Park和Johnson的方法測量單位反應時間內中還原端的增加量，該方法使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物，以便證實大腸埃希氏桿菌提取物中是否存在具有新生成葡萄糖殘基還原端的纖維素之水解活性的多肽。
通過將CMC(Sigma)以1％的濃度溶解於100mM的檸檬酸鈉(pH5.0)來製備CMC溶液。將50μl CMC溶液和50μl用100mM的檸檬酸鈉(pH5.0)稀釋的無細胞提取物混合一起，上覆礦物油。在98℃下溫育60分鐘後，離心收集水層。將10μl反應混合物、90μl水、100μl碳酸氰化物溶液和100μl 0.05％氰化鐵鉀水溶液混合一起，沸水中反應15分鐘。碳酸氰化物溶液的製備方法是將5.3g碳酸鈉和0.65g氰化鉀溶於1升水中。該反應混合物於500μl鐵鋁溶液混合。該鐵鋁溶液的製備方法是將1.5g鐵鋁和1g十二烷基磺醯鈉(SDS)溶於1升0.15N的硫酸中。產生的混合物在室溫下平衡15分鐘。然後在690nm測量吸收度。測定還原端的含量，根據已知濃度的葡萄糖標準曲線求出相應的葡萄糖濃度。
一單位(U)的CMC-降解活性定義為在上述反應體系中一分鐘內提高相當於1μmol葡萄糖的還原能量的活性。
按照上述方法測定的相應的無細胞提取物的CMC-降解活性如表1所示。表1表示在98℃下上述製備的無細胞提取物的CMC-降解活性。表1

如表1所示，在轉化有pECEL211的大腸埃希氏桿菌的無細胞提取物中明顯檢測到了CMC-降解活性，而轉化有pET21d的大腸埃希氏桿菌的無細胞提取物中未檢測到CMC-降解活性。這樣，自堀越熱球菌OT3中的開放閱讀框架PH1171表達的多肽具有新產生葡萄糖殘基還原端之纖維素水解活性。
(2)所表達多肽的纖維素水解活性的鑑別在測定前，如下製備表達多肽溶液。
將含有pECEL211的大腸埃希氏桿菌(DE3)接種到10ml含有50μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中，37℃培養過夜。將培養物接種到1升同樣的培養基中，37℃培養2.5小時。冰上冷卻培養管。向其內加入IPTG至終濃度0.1mM。在20℃下培養細胞過夜。通過離心收集細胞，將其懸浮於50ml 20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)並超聲。離心所得上清經95℃處理10分鐘，再離心得到上清。這樣得到的上清用作以下實驗中的表達多肽溶液。
如下鑑定表達多肽的纖維素水解活性。具體地，可使該表達多肽溶液與多種底物作用。然後在薄層層析上鑑定產物。
首先將磷酸膨脹纖維素作為底物。如下製備磷酸膨脹纖維素。
將2g Avicel SF(Asahi Kasei)緩慢加入50ML 85％的冰冷磷酸中。將該混合物在冰上攪拌並間或進行超聲以溶解Avicel SF。將該溶液倒入1.5升冰水中。通過離心收集纖維素凝膠。為去除磷酸將纖維素凝膠在水中衝洗6次，將其懸浮於40ml 0.1M檸檬酸鈉緩衝液中，並在隨後的實驗中用作磷酸膨脹纖維素。
將75μl該表達多肽溶液加入75μl的磷酸膨脹纖維素中。該混合物在98℃反應8小時。60μl的乙腈加入等量的該反應混合物中並混合。在低壓力下，將通過離心獲取的上清蒸發變幹。將該殘餘物溶解於10μl的水中。取2μl該溶液用於矽膠薄層層析。應用矽膠60F254(Merck)作為薄層板並且將乙醇∶丁醇∶水＝5∶5∶1作為顯影溶劑來進行兩次顯影。在顯影后將地衣酚-硫酸試劑噴至該薄層板上並且應用熱板將該板加熱以觀察斑點。通過在22.8ml硫酸中溶解400mg地衣酚(Sigma)，並加入水使之總量達200ml來製備地衣酚-硫酸試劑。
結果，證實生成了纖維二糖。
其次，將多種寡糖作為底物。
通過將纖維二糖(Sigma)、纖維三糖、纖維四糖或纖維五糖(後三者購自Seikagaku公司)溶解於0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中使之濃度為1％(W/V)來製備寡糖溶液。將25μl的每一寡糖溶液加到25μl的10-、50-或250-倍用MES緩衝液稀釋的該表達多肽的稀釋液中。該混合物在98℃反應20分鐘。用MES緩衝液替換該稀釋的表達多肽溶液或該寡糖溶液加到混合物中，在同樣的時間進行反應以作為對照。如上述的將磷酸膨脹纖維素用作底物的情況，將在反應後通過離心獲得的1μl上清液進行矽膠-薄層層析。以纖維二糖、纖維三糖或纖維四糖作底物時，進行兩次顯影。以纖維五糖作底物時，進行三次顯影。
不添加該表達多肽溶液，檢測作為反應底物的纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的斑點。當不向反應中加入底物時，未檢測到斑點。當加入該表達多肽溶液和其中一種底物進行反應時，除纖維二糖外，每一寡糖產生比完整底物的RF值大的斑點物質。該物質的數量依據所添加的表達多肽的量而增加。
如上所述應用寡糖作為底物，進行反應，只是該表達多肽溶液稀釋率為10，並且反應時間為2小時。如上所述在矽膠薄層層析上分析通過離心該反應混合物獲取的上清液。
結果，除纖維二糖外的底物幾乎完全消耗。纖維三糖、纖維四糖產生纖維二糖。纖維五糖產生纖維三糖和纖維二糖。對每一作為底物的寡糖來說，主要的降解產物為纖維二糖。
這些結果證實，堀越熱球菌OT3基因組中的開放閱讀框架PH1171表達的多肽具有纖維二糖水解酶活性。
實施例3本發明多肽的纖維二糖水解酶活性的物理和化學特性在此實施例中應用實施例2-(2)中製備的本發明的多肽溶液。以下列活性測定纖維二糖水解酶活性1)依據Park和Johnson方法，通過檢測應用CMC作為底物產生的纖維二糖的量作為還原糖的量，測定的CMC-降解活性；2)通過檢測應用pNPC作為底物產生的纖維二糖的量作為對硝基苯酚的量，測定的對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(pNPC)-降解活性；3)通過檢測應用4-MUC作為底物產生的纖維二糖的量作為4-甲基繖形酮(4-MU)的量，測定的4-甲基繖形酮基-β-D-纖維二糖苷(pNPC)-降解活性。
(1)對反應pH的依賴(關係)製備如下緩衝劑。pH為2.8、3.8、4.9或6.0的0.2M的檸檬酸鈉緩衝劑、pH為4.6、5.5或6.5的MES-NaOH緩衝劑、pH為5.6、6.6或7.7的0.2M的Tris-HCl緩衝劑和pH為7.7、8.7或9.8的0.2M的甘氨酸-NaOH緩衝劑。在80℃檢測pH。
將50μl本發明之多肽50倍的水稀釋液、25μl的2％CMC水溶液和25μl一種上述的緩衝劑混合一起。該混合物在98℃反應20分鐘。依據Park和Johnson方法，檢測通過離心該反應混合物獲取的上清液中所含的還原糖的量，並且計算該CMC-降解活性。
結果如圖1所示。圖1闡述反應pH和CMC-降解活性之間的關係。該橫軸代表pH，縱軸代表CMC-降解活性(相對值，％)。空心圓(○)、實心圓(●)、空心方塊(□)和實心方塊(■)分別代表檸檬酸鈉緩衝劑、MES-NaOH緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑和甘氨酸-NaOH緩衝劑的結果。
本發明的多肽在pH4.9-6.5表現最大活性。
(2)對反應溫度的依賴(關係)將50μl在0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl用0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)稀釋的本發明多肽的稀釋液中。該混合物在37、65、98、108或113℃反應20分鐘。依據Park和Johnson方法，通過檢測產生的還原糖的量來測定的CMC-降解活性。
結果見圖2。圖2闡述反應溫度和本發明之多肽的CMC-降解活性之間的關係。該橫軸代表反應溫度(℃)，縱軸代表CMC-降解活性(相對值，％)。
在108℃本發明之多肽表現最大的CMC-降解活性，在90℃時表現大約80％最大活性和在80℃時表現大約60％最大活性。
(3)鹽濃度效應用水或1、2、3、4或5M NaCl將本發明之多肽溶液稀釋50倍。將50μl在0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl一種本發明之多肽溶液的稀釋液中。該混合物在98℃反應20分鐘。依據Park和Johnson方法，通過檢測產生的還原糖的量來測定CMC-降解活性。
結果見圖3。圖3闡述NaCl濃度和本發明之多肽的CMC-降解活性之間的關係。該橫軸代表NaCl濃度(M)，縱軸代表CMC-降解活性(相對值，％)。
在0.5-0.6M NaCl存在時，本發明之多肽表現最大CMC-降解活性。
(4)pH穩定性將25μl本發明之多肽的溶液和25μl在實施例3-(1)中製備的緩衝劑一起混合。該混合物在95℃加熱10分鐘。將50μl在0.1MMES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl該加熱的混合物的50倍水稀釋液中。該混合物在98℃反應20分鐘。依據Park和Johnson方法，檢測通過離心該反應混合物獲取的上清液中所含的還原糖的量，並且計算該CMC-降解活性。
結果見圖4。圖4闡述該多肽在95℃加熱10分鐘時，pH和其保留的CMC-降解活性之間的關係。該橫軸代表加熱時的pH，縱軸代表保留的CMC-降解活性(U/ml)。空心圓(○)、實心圓(●)、空心方塊(□)和實心方塊(■)分別代表檸檬酸鈉緩衝劑、MES-NaOH緩衝劑、Tris-HCl緩衝劑和甘氨酸-NaOH緩衝劑的結果。
在pH5-7時，本發明之多肽的CMC-降解活性表現最大穩定性。
(5)熱穩定性將CMC溶解於0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中以製備1％的CMC溶液(pH6.0)。將50μl MES緩衝劑加入到本發明之多肽的溶液中。在95℃加熱0、1、5或24小時。將50μl 1％的CMC溶液加入通過離心該加熱的混合物獲取的上清液與MES緩衝劑的50-、200-或500-倍的稀釋液中。該混合物在98℃反應20分鐘。依據Park和Johnson方法，通過檢測在該反應混合物中所含的還原糖的量來測定的CMC-降解活性。
結果見圖5。圖5闡述熱處理-時間和在加熱後該保留活性之間的關係。該橫軸代表熱處理-時間(小時)，縱軸代表加熱後的保留活性(％)。
在95℃加熱24小時後，本發明之多肽保留約90％的CMC-降解活性。
(6)對合成底物的降解活性將50μl 0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)中的10mM pNPC加入到50μl本發明之多肽溶液或其2-、5-、10-或20-倍用0.1M MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)稀釋的稀釋液中。該混合物在98℃反應20分鐘。依據釋放的對硝基苯酚(pNP)的量，檢測通過離心獲取的上清液的405nm的吸收率，以測定pNPC-降解活性。
結果見圖6。圖6闡述本發明之多肽溶液的稀釋率和每一稀釋液pNPC-降解活性之間的關係。該橫軸代表該稀釋率的倒數，縱軸代表pNPC-降解活性(mU/ml)。
該pNPC-降解活性依據本發明多肽溶液濃度(的增加)而增加。
(7)葡萄糖和纖維二糖的抑制作用含有0、10、20、50、100或200mM葡萄糖或0、5、10、25或50mM纖維二糖、0.4、0.8、1.2或1.6mM pNPC和本發明多肽溶液的50mM MES-NaOH緩衝劑(pH6.0)在98℃反應20分鐘，並且檢測405nm吸收率。對應葡萄糖或纖維二糖的濃度(橫軸)標記405nm吸收率(縱軸)的倒數。測定通過連接各自的pNPC濃度的點獲取的線的交叉點。通過倒轉交叉點在橫軸上的值的正或負號來測定抑制常數Ki。
因為葡萄糖對本發明多肽的pNPC-降解活性的抑制作用很小，因此不可能計算Ki。另一方面，纖維二糖的Ki為212mM。
(8)多種試劑的作用含有0、0.5、1、2或10mM CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、二硫蘇糖醇(DTT)或乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM對硝基苯基-β-D-纖維二糖苷(pNPC，Sigma)和本發明多肽溶液的50mMMES-NaOH緩衝劑在98℃反應20分鐘，並且檢測405nm吸收率。應用對硝基苯酚(pNP)濃度和在405nm吸收率之間關係的標準曲線來計算pNPC-降解活性。將本發明之多肽的一個單位(U)的pNPC降解活性定義為，一分鐘內，在上述的反應混合物中釋放1μmmolpNP的量。
結果見圖7。圖7闡述多種試劑pNPC-降解活性之間的關係。該橫軸代表該試劑的濃度，縱軸代表pNPC-降解活性(相對值，％)。在圖7中，空心圓(○)、實心圓(●)空心方塊(□)、實心方塊(■)、空心三角(△)、實心三角(▲)、空心菱形(◇)和實心菱形(◆)分別代表CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、DTT或EDTA。
DTT不抑制本發明多肽的pNPC-降解活性。濃度為0.5mM的Cu2+、Fe3+或Zn2+抑制(該多肽)大約90％的活性。濃度為1mM的Co2+、Ca2+、Mg2+或EDTA抑制(該多肽)大約50％的活性。
(9)本發明之多肽的提純除了熱處理為75℃ 20分鐘外，如實施例2-(2)所述的方法製備表達多肽溶液。
應用HiTrap Q柱(pharmacia)對通過離心所加熱的上清而獲取的上清液進行陰離子交換層析。將該樣品加到兩個系列連接的5mlHiTrap Q柱上。20分鐘內用自50mM MES-NaOH緩衝液(pH6.0)至含有200mM NaCl的同一緩衝液的線性梯度液洗脫，流速2ml/分鐘。將50μl 6mM 4-MUC溶液(溶於100mM MES-NaOH緩衝液(pH6.0))加到50μl相應組分的系列稀釋液之一中。該混合物在98℃反應20分鐘。以355nm為激發波長，460nm為發射波長測量螢光。根據釋放的4-MU的量來計算4-MUC降解活性。
應用HiTrap苯瓊脂糖6快速柱(低分子量)(Pharmacia)對經該陰離子交換柱層析的活性組分進行疏水柱層析。將飽和的硫酸銨加到經該陰離子交換柱層析的活性組分中至20％的飽和度。將該混合物加到已用20％的硫酸銨平衡的疏水柱上(1ml體積)。15分鐘內應用自含20％飽和度的硫酸銨的MES緩衝液至無硫酸銨的MES緩衝液的線性梯度液洗脫，流速1ml/分鐘。在用約0％飽和硫酸銨洗脫的組分中檢測4-MUC降解活性。
(10)比活性的測定將2ml經疏水柱層析的活性組分通過超濾脫鹽、凍幹，然後在氣相HCl存在的情況下135℃水解3小時。使水解物溶於100μl水。用胺基酸分析儀(L-8500 Hitachi)對50μl該溶液進行分析發現所分析的樣本含有3.61μg蛋白質。對具有60MU 4-MUC降解活性的相應多肽進行胺基酸分析。這樣，測得比活性為17.0U/mg。這樣獲得的提純多肽在物理和化學性質上與實施例3中所測的(性質)類似。
(11)N-端胺基酸序列分析按照常規方法對實施例3中製備的提純多肽進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳後，在含10mM DTT的100mM琥珀酸鹽緩衝液(pH5.8)中衝洗該凝膠，然後在含1mM 4-MUC的100mM琥珀酸鹽緩衝液(pH5.8)中，60℃反應一小時。340nm紫外線照射該凝膠，觀察螢光帶。
按照半乾印跡法將凝膠中的蛋白質轉移到聚偏乙烯雙氟化物(PVDF)膜上。該膜用考馬斯亮藍(CBB)染色。切下一部分PVDF膜。此部分對應於具有4-MUC降解活性的帶並已用CBB染色。用肽測序儀分析N-端胺基酸序列。
N-端六個胺基酸殘基的序列為Glu-Asn-Thr-Thr-Tyr-Gln。如前所證明，在大腸埃希氏桿菌中表達的本發明之多肽N-端28個胺基酸殘基已得以去除。
實施例4應用枯草芽孢桿菌生產本發明的多肽(1)構建枯草芽孢桿菌表達載體構建如WO 97/21823所述的質粒pNAPS1，用HindIII(TakaraShuzo)酶切並進行瓊脂膠電泳。按照傳統方法，從瓊脂膠中提取和純化大約4.5Kb的含有源於枯草芽孢桿菌的複製起點、枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動子和編碼枯草芽孢桿菌蛋白酶分泌信號之序列的DNA片段。用HindIII酶切pUC119(Takara Shuzo)並且用鹼性磷酸酶將其去磷酸化。用DNA連接酶將這些DNA片段連接。按照傳統的方法，進行大腸埃希氏桿菌的轉化、轉化體的培養和質粒的提取和純化。從這些獲取的質粒中，篩選其中插入該4.5Kb的DNA片段從而使pUC119中的lac啟動子和枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動子方向相反的質粒，並將其命名為pUC119-BV。
用BamHI酶切在實施例1中構建的pECEL101並進行瓊脂膠電泳。按照傳統的方法，從該瓊脂膠中，提取和純化開放閱讀框架PH1171中編碼從19位亮氨酸殘基到終末端密碼子部分片段的大約1.5Kb的DNA片段。用BamHI酶切上述方法獲得的pUC119-BV並進行瓊脂膠電泳。按照傳統方法，從瓊脂膠中提取和純化大約4.5Kb的含有源於枯草芽孢桿菌的複製起點和類似物的DNA片段。用DNA連接酶將這些DNA片段連接。按照傳統的方法，進行枯草芽孢桿菌DB104的轉化、轉化體的培養和質粒的提取和純化。
從這些獲取的質粒中，篩選其中插入與該載體中枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動子方向相同的開放閱讀框架PH1171的質粒，並將其命名為pNECEL101。質粒pNECEL101編碼在枯草芽孢桿菌中構成性表達的枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動子之下遊的融合多肽。在該融合多肽中，來源於該載體、包括由在N-端29個胺基酸殘基組成的枯草芽孢桿菌蛋白酶分泌性信號序列在內的31個胺基酸殘基的前導序列與始於19位亮氨酸殘基的PH1171相連。當該質粒分泌時，獲取與在該載體中的枯草芽孢桿菌蛋白酶基因啟動子相反的方向而插入開放閱讀框架PH1171的質粒和該載體自身連接得到的質粒，並將它們分別命名為pNCEL001和pNBV。這些質粒用作檢測表達的載體對照。
(2)本發明之多肽的表達在含有10μg/ml卡那黴素的LB培養基中溫育和在富氧情況下37℃過夜培養如上述方法獲得的用pNCEL101、pNCEL001或pNBV轉化的枯草芽孢桿菌DB104。如實施例2-(1)所述應用得到的培養物代替該無細胞提取物，檢測在培養物中的CMC-降解活性。
具體地，將50μl一種枯草芽孢桿菌轉化體培養物和50μl在100mM檸檬酸鈉緩衝劑中的1％CMC溶液一起混合，並且在該混合物上覆蓋礦物油。在98℃孵育60分鐘後，將該混合物離心並重新獲取上清液。按照如實施例2-(1)所述的Park和Johnson方法，檢測該反應混合物的還原能。應用pNCEL101轉化的枯草芽孢桿菌DB104的培養物的反應混合物，明顯地比應用自身-連接載體來源的質粒pNBV轉化的DB104的培養物的反應混合物(對照)，表現較高的還原能。依據還原能而計算的CMC-降解活性為0.63mU/ml培養物，該還原能通過減去對照組的值並轉化為相應的葡萄糖的量來測定。對以相反方向插入PH1171的質粒pNCEL001而言，只發現與pNBV相等的還原能。
實施例5應用本發明之多肽對紙張的降解將25mg的Kimwipe(Crecia)約1mm2的小片。將480μl 50mMMES-NaOH(pH6.0)和20μl同樣的緩衝劑或在實施例2-(1)中製備的pECEL211轉化的大腸埃希氏桿菌的無細胞提取物加入其中。該混合物在95℃反應66個小時。將100μl乙腈加入到50μl離心獲取的上清中。通過離心去掉不可溶的物質。在減壓下將該上清液蒸發致幹。將該殘留物再重新溶解於10μl 50％的乙腈水溶液中。將1μl的該溶液用於如實施例2-(1)中所述的矽膠薄層層析。
結果，只有在加入了用pECEL211轉化的大腸埃希氏桿菌的無細胞提取物的標本中，觀察到具有與纖維二糖相同RF值的點。
工業應用本發明提供具有纖維二糖水解酶活性的多肽。本發明之多肽具有高度耐熱性並且能高效降解纖維素。由於通過與來源於極度嗜熱菌的內切葡聚糖酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶和β-D-葡糖苷酶聯合應用，本發明之多肽能高效地從纖維素中生產葡萄糖，因此可方便地利用纖維素-類型的生物量。
序列表SEQ ID NO3命名為1171FN的寡核苷酸引物，設計用以擴增含有開放閱讀框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。
SEQ ID NO4命名為1171RA的寡核苷酸引物，設計用以擴增含有開放閱讀框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。
權利要求
1.一種具有SEQ ID NO1的胺基酸序列或具有通過在SEQ IDNO1胺基酸序列中缺失、加入、插入和/或替換一個或多個胺基酸殘基所得到的胺基酸序列的多肽，其具有纖維二糖水解酶活性。
2.權利要求1的多肽，其具有熱穩定性的纖維二糖水解酶活性。
3.一種編碼權利要求1或2之多肽的核酸。
4.權利要求3的核酸，其具有SEQ ID NO2的核苷酸序列。
5.一種編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的核酸，它在嚴格情況下能與權利要求3中的核酸雜交。
6.權利要求5的核酸，其編碼具有熱穩定的纖維二糖水解酶活性的多肽。
7.一種含有權利要求3-6中任一項的核酸的重組DNA。
8.一種用權利要求7的重組DNA轉化的轉化體。
9.一種生產權利要求1的多肽的方法，該方法包括培養權利要求8中的轉化體和從培養物中收集具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
10.一種降解通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，該方法包括使權利要求1或2中的多肽，作用於通過β-1，4鍵相連的D-吡喃葡萄糖聚合物，以釋放纖維二糖。
11.一種具有纖維二糖水解酶活性和對纖維二糖的抑制常數Ki大於或等於10mM的多肽。
12.權利要求11的多肽，其在95℃處理5小時後能保持20％或更多的纖維二糖水解酶活性。
全文摘要
具有SEQ ID NO:1所示胺基酸序列的多肽或應用缺失、添加、插入或替換中的至少一種方法,而缺失、添加、插入或替換一或多個胺基酸而得到具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
文檔編號C12P19/04GK1334868SQ99816216
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月14日 優先權日1998年12月24日
發明者高山正範, 梅田香穗子, 小山信人, 淺田起代蔵, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社 被以下專利引用 (2),