作為免疫調節因子的可溶性vOX2蛋白的製作方法

2023-05-25 09:04:41

專利名稱：：作為免疫調節因子的可溶性vOX2蛋白的製作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫調節分子，特別是由卡波西肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)編碼的可溶性vOX2蛋白衍生物。
背景技術：
：哺乳動物免疫系統的生理功能是使宿主防禦微生物的感染。該防禦由先天免疫的早期反應和適應性免疫的延遲應答介導。活化免疫系統最早的抗病毒組分是炎性應答，其特徵在於由受損傷細胞(包括內皮細胞)釋放趨化中介體，以將白細胞(主要是免疫系統中最為豐富的細胞組分——嗜中性粒細胞)由外周血募集至炎性反應的位點。嗜中性粒細胞在吞噬作用過程中通過消化微生物和受感染細胞來清除它們，從而在先天免疫應答中發揮關鍵作用。該過程伴隨著吞噬體內的效應物"呼吸爆發(respiratoryburst)"的發生，其包括氧化代謝的突然提高，導致產生有毒性的活性氧中間體代謝物(ROI;如02'、'OH、H202)。雖然ROI的產生是為了在細胞內清除病原體，但是它們不可避免地會穿過細胞膜擴散到炎症位點，它們能夠在所述炎症位點損傷組織，從而增加了免疫發病。炎性應答中最重要的促炎細胞間中介體為趨化因子、白介素8(IL-8)和巨噬細胞化學引誘物蛋白-1(MCP-1)等。越來越多的證據顯示，IL-8和MCP-1分別是急性(嗜中性粒細胞)和慢性(巨噬細胞/單核細胞)炎症的主要中介體(Akahoshi等，1994，Frangogiannis等，2002,Hatano等，1999，Smith等，1997，Villiger等，1992)。CXC-趨化因子IL-8是白細胞的促生存(pro-survival)信號；許多報導顯示，包括單核細胞、T淋巴細胞、嗜中性粒細胞、成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞的各種細胞快速地表達IL-8mRNA併合成IL-8蛋白。然而，其主要由單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞合成，並主要募集嗜中性粒細胞(綜述於(Baggiolini，2001,Mukaida等，1998))。MCP-1是與細胞的運動和刺激有關的促炎趨化因子，主要作用於淋巴細胞、單核細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞(Mukaida等，1998)。該趨化因子作為對不同刺激如IL-1、肺瘤壞死因子(TNF)和免疫球蛋白(Ig)G的應答而表達於多種細胞類型，包括單核細胞、平滑肌細胞以;^Ajk管內皮細胞(HUVEC)(Rollins等,19卯，Sica等，1990，Yang等，2004)。TNF-a和IgG複合體也是產生ROI的已知刺激因子(Satriano等，1993)。病毒與其宿主一起進化，它們也進而進化出了逃避免疫應答的策略。卡波西肉瘤相關皰滲病毒(KSHV)是最新鑑定出的感染人類的皰滲病毒(Chang等，1994)，它是卡波西肉瘤(KS)的病因，並可能是原發性滲出性淋巴瘤和多中心性卡斯爾曼病的病因(綜述參閱(Sarid等,1999))。在包含約卯個KSHV開放讀碼框(ORF)的基因組中，至少16個確定為可調節宿主免疫應答的蛋白質(Russo等，1996)。可以認為炎性應答是增強病毒感染和散布的免疫調節的關鍵靶標。事實上，KSHV編碼三種CXC趨化因子調節因子(Boshoff等，1997)。在KSHV的裂解周期中合成的另一種蛋白質由名為K14的開放讀碼框所編碼(Jenner等，2001)。這種蛋白質顯示出與哺乳動物OX2蛋白(也叫做CD200)的同源性，後者屬於膜相關糖蛋白的Ig超家族，表達在許多類型細胞的表面上，包括內皮細胞、B細胞、T細胞、神經細胞和扁桃體嚢泡(tonsilfollicle)(Morris&Beech,1987,Wright等，2001)。細胞內OX2的作用相信是調節髓樣細胞活性的一員，可能作為輔助信號(Wright等，2000)。在小鼠和大鼠中OX2表達的升高提高了腎臟和皮膚同種異體移植物的存活(Gorczynski等，1998,Gorczynski等,1999)，提示OX2傳遞耐受信號(綜述於(Gorczynski,2001))。OX2的信號傳遞可能通過與OX2配體(受體)的結合來實現，該配體(受體)的表達局限於髓樣細胞(Gorczynski等，2000,Wright等，2003)。由於這種同源性，該病毒蛋白通常稱作vOX2。然而，這只是方侵，的叫法。這兩種蛋白在胺基酸水平只有約40%的序列同一性，所以不能假定該病毒蛋白會模擬細胞蛋白的任何活性。而且，該病毒蛋白還與神經細胞粘附分子(NCAM)、Thy-l以及L1具有同源性，所以vOX2也被稱作vNCAM和v-adh。
發明內容迄今為止對於vOX2功能的研究結果是互相矛盾的。Chung等(2002)的報導稱，表達為可溶性GST融合蛋白的vOX2蛋白能刺激原代單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，並誘導它們產生炎性細胞因子。在該研究中，表達於B淋巴細胞表面的vOX2也顯示能夠刺激單核細胞產生炎性細胞因子。作者提出，該促炎活性可以使淋巴細胞募集到KSHV感染位點，這提供了更多用於病毒感染的細胞，因此促進將病毒散布到被感染宿主的系統各處。相反，Foster-Cuevas等(2004)得出結論，膜表達的vOX2下調了巨噬細胞的活化。他們提出，Chung的結果可能是由於其可溶性重組蛋白的錯誤摺疊所致，但是這不能解釋兩個研究中用細胞表面表達的蛋白質得到的矛盾結果。因此，vOX2的生物活性至今仍然未知。本發明人已經發現，可溶性vOX2能夠在先天免疫系統中發揮抗炎效應。因此，在最普通的形式中，本發明提供可溶性vOX2作為抗炎劑的用途。在第一個方面中，本發明提供了可溶性vOX2用於抑制炎性免疫應答的用途，包括使免疫系統細胞群與可溶性vOX2接觸。在體外、離體或體內進行的所有這些用途都包括在本發明的範圍內。所述細胞群通常包括先天免疫系統的細胞，尤其是吞噬細胞，例如嗜中性粒細胞、單核細胞和/或巨噬細胞，任選地與免疫系統的多種其它細胞組合，包括T淋巴細胞(包括CD4+和CD8+T淋巴細胞)和B-淋巴細胞。不希望限於任何具體理論地，認為可溶性vOX2對吞噬細胞如單核細胞(如巨噬細胞)和嗜中性粒細胞發揮抗炎效應。例如，它可以特異性地降低經幹擾素Y處理的巨噬細胞樣細胞系U937中的MCP-1和IL-8產生，並且還能抑制嗜中性粒細胞的氧化爆發。因此，該方法可以包括測定對炎性免疫應答的抑制程度的步驟。這可以通過測量炎性細胞因子或趨化因子的產生尤其是巨噬細胞中的產生(例如MCP-1和/或IL-8)和/或活性氧中間體(如02或OH基團或11202)的產生來實現。當然，在體內實施該方法時，可以使用任何適當的炎症症狀來監測vOX2蛋白的效果，例如炎性細胞的組織浸潤、腫脹、發紅等。可溶性vOX2所表現出的抗炎特性使其適用於治療炎性疾病或其它病症，其中不適宜的或不需要的免疫應答造成患者的症狀和/或疾病發病，包括自身免疫病、變態反應和移植排斥。這樣的病症包括類風溼性關節炎、銀屑病、炎性腸病、多發性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性和變應性皮膚病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心臟病)和炎性神經症候群。本說明書中所述的治療方法可包括將可溶性vOX2遞送至炎症位點的任何合適方法。例如，可以將可溶性vOX2蛋白直接施用於有此需要的患者。或者可將編碼可溶性vOX2的核酸施用於患者，從而該蛋白通過該患者自身的細胞進行合成和分泌。又或者，可以將能夠表達和分泌可溶性vOX2的細胞施用於患者。因此，本發明提供用於醫療方法中的可溶性vOX2蛋白、編碼可溶性vOX2的核酸或能夠表達和分泌可溶性vOX2的細胞。本發明還提供用於製備預防或治療炎性疾病的藥物中的可溶性vOX2蛋白、編碼可溶性vOX2的核酸或能夠表達和分泌可溶性vOX2的細胞。本發明還提供預防或治療炎性疾病的方法，包括對有此需要的患者施用有效量的可溶性vOX2蛋白、編碼可溶性vOX2的核酸或能夠表達和分泌可溶性vOX2的細胞。本發明還提供藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的可溶性vOX2蛋白、編碼可溶性vOX2的核酸或能夠表達和分泌可溶性vOX2的細胞。本發明所述的方法中使用的vOX2蛋白一般通過重組表達和分泌獲得，優選來自真核細胞。該vOX2蛋白可以是多價的。也就是說，其在二價的、三價的、四價的或更高價的複合體中包含兩個或多個vOX2部分。不希望限於任何特定理論地，多價的vOX2可能比一價vOX2更有效地交聯靶細胞表面上的受體，因此能夠比一價蛋白更有效地發揮抗炎活性。單個vOX2部分可以以共價或非共價方式在vOX2複合體中結合。這種結合可以是直接的(即在vOX2部分之間)或間接的(通過與vOX2部分相連的異源組分)。例如，vOX2部分可以彼此化學交聯。或者，vOX2部分可以表達為在單個多肽鏈中包含兩個(或更多)vOX2部分的融合蛋白，其任選地由適當的多肽接頭分開。或者，vOX2部分可以與異源(即非vOX2的)組分連接，所述異源組分彼此相互作用從而引起結合。因此，該複合體可以包含分別與第一和第二異源組分相連的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二異源組分彼此結合。所述第一和第二異源組分可以是相同的或不同的，並可通過共價或非共價相互作用彼此結合。優選地，每個vOX2部分與其各自的異源組分一起表達為融合蛋白。異源組分的實例包括轉錄因子的寡聚化結構域，如通過疏水相互作用彼此結合的亮氨酸拉鏈基序。然而，特別優選的異源組分實例為抗體Fc區。天然構象的vOX2-Fc融合蛋白通常是包含兩條多肽鏈的二聚體，其中每條鏈由一個Fc部分和一個vOX2部分組成，所述多肽鏈通過Fc部分之間的二硫鍵共價結合。所述異源組分可以能夠調節vOX2分子的藥代動力學特性。例如，它可以能夠調節生物利用率、溶解度、穩定性、體內半衰期等。與單獨的效應分子相比，包含與抗體Fc區(也叫免疫粘附素)連接的效應分子的融合蛋白通常具有增強的溶解度、穩定性和半衰期。(雖然通常期望提高vOX2部分的這些特性，但應該理解，有時需要降低這些特性中的一些或全部。可以相應地選擇適當的異源組分。)也可能期望將vOX2部分與異源組分連接，所述異源組分以期望的方式調節其藥代動力學特性,但不介導vOX2部分結合進多價複合體中。在另一方面中，本發明提供可溶性抗炎劑，其包含至少兩個vOX2部分的複合體。如上所述，該複合體可以包含分別與第一和第二異源組分相連的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二異源組分相互結合。當所述異源組分是蛋白質或肽時，其優選與其各自的vOX2部分一起表達為融合蛋白。因此，本發明提供編碼這樣的融合蛋白的核酸，該融合蛋白優選能夠被宿主細胞分泌。還提供包含這些核酸的表達栽體以及包含這些表達栽體的宿主細胞。當所述異源組分相同(即相互結合的相同異源組分)時，通常有可能通過僅從一種這樣的核酸構建體表達蛋白產物，從而形成多價複合物。當所述異源組分不同(即一個異源組分與另一個不同類型的異源組分結合)時，則必須從編碼每種類型融合蛋白的核酸表達蛋白產物。因此，本發明提供組合物，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸編碼含有第一vOX2部分和第一異源組分的融合蛋白，所述第二核酸編碼含有第二vOX2部分和第二異源組分的融合蛋白，其中在表達為蛋白質時，所述第一和第二異源組分相互結合。所述融合蛋白通常能夠被適當的宿主細胞分泌。所述第一和第二核酸可以在分開的表達載體或同一表達載體上。本發明還提供包含所述第一和第二核酸的宿主細胞。在優選的實施方案中，所述異源組分為抗體Fc區。因此，本發明提供可溶性vOX2-Fc融合蛋白。本發明還提供核酸，其編碼能夠由適當的宿主細胞分泌的可溶性vOX2-Fc融合蛋白。因此，所述核酸通常編碼融合蛋白N端的信號肽，從而使該融合蛋白能夠被表達它的宿主細胞分泌。本發明還提供包含編碼可溶性vOX2-Fc融合蛋白的核酸的表達載體。所述載體一般包含與編碼融合蛋白的序列有效連接的適當的轉錄和翻譯調節序列，從而使宿主細胞進行轉錄和翻譯所述蛋白質。本發明還提供含有上述表達載體的宿主細胞。所述宿主細胞優選為真核宿主細胞，如哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。在某些實施方案中，優選哺乳動物細胞(如CHO細胞或人細胞)。本發明還提供藥物組合物，其含有與可藥用載體組合的本發明第二方面中所述融合蛋白、核酸、表達載體或宿主細胞。圖1:vOX2-Fc的產生和純化。A.在穩定轉染的CHO細胞中產生vOX2-Fc。對收穫的經改造CHO細胞的上清液進行Western印跡分析，使用抗人IgG-HRP抗體進行分析，並使用ECL印跡試劑(Amersham)顯影。泳道l，未經轉染的正常CHO細胞；泳道2，用重組pDR2AEFla質粒衍生物轉染的CHO細胞，其表達無關的Fc-融合蛋白，KSHV補體對照蛋白(KCP:Fc);泳道3，穩定轉染了pvOX2-Fc的CHO細胞系(CHO-15"69)。分子大小標記的位置標於印跡的左側。B.蛋白純化和精製(polishing):對經親和純化及"精製"的重組vOX2-Fc進行Western印跡分析。泳道l,未經轉染的正常CHO細胞；泳道2，純化自穩定轉染了pvOX2-Fc的CHO細胞系(CHO-15"69)的重組vOX2-Fc。通過親和層析(HiTrapA蛋白柱)和大小排阻層析(Superdex200)進行蛋白純化。使用抗人IgG-HRP抗體對經純化的vOX2-Fc蛋白進行Western印跡分析，並用ECL印跡試劑顯影(Amersham)。圖2:通過重組的vOX-2:Fc蛋白抑制U937單核細胞中炎性趨化因子的產生。A.MCP-1的水平。B.IL-8的水平。在通過Luminex測定對培養液進行細胞因子定量之前，在存在或不存在重組IFN-Y(5ng)和vOX-2:Fc(10ng/ml)的情況下以1x106的密度培養U937細胞48小時。圖3:通過重組的vOX-2:Fc蛋白抑制人原代外周血嗜中性粒細胞中的氧化爆發而不是吞入(engulfment)。A.氧化爆發。B.吞入。通過市售的Bursttest和Phagotest測定(OPREGENPharma;BDBiosciences)以流式細胞術測量全血中這些吞噬活性的組分，對粒細胞設立門控(gating),並獲得5000個事件。在進行測定之前，將肝素化的全血與重組vOX2-Fc(10嗎/ml)或純化的人IgG(10嗎/ml)—起孵育(卯分鐘，37。C，5%C02),或者保持不處理。在收集時，對每個血樣進行白細胞分類計數，這使得測定在大腸桿菌嗜中性粒細胞的比例為6:1時進行，並且將每個受試者的數據對平均螢光強度(MFI)進行歸一化。顯示了三個獨立實驗中11個健康受試者的13個全血樣品研究的累積數據。圖4:通過重組vOX-2:Fc在體內抑制角叉藻聚糖誘導的急性炎性應答。通過將海藻提取物角叉藻聚糖施用於每個動物的一隻後爪來誘導BALB/c小鼠足墊的產生急性炎症。在施用角叉藻聚糖前30分鐘，4組小鼠接受腹膜內(IP)注射的重組vOX2-Fc(80pg/小鼠；翻組)、純化的人IgG(80嗎/小鼠；A組)、地塞米松(500嗎/小鼠；參組)或PBS(令組)，然後在施用角叉藻聚糖後6、12和24小時後再進行一次。通過測量足墊的厚度來評估炎症程度，計算為接種角叉藻聚糖的後足墊與同一動物未經接種的後足墊之間的厚度差異。數據合併自三個獨立的單盲實驗，代表每組的平均值+/-SE(PBS和vOX2-Fc處理每組為24隻小鼠，8隻小鼠接受純化的人IgG，16隻用地塞米松處理)。組之間的比較數據顯示於表中。圖5和圖6:vOX2-Fc對DBA小鼠中膠原誘導的關節炎的發生和嚴重性的影響。在每幅圖中，圖A顯示每組10隻小鼠的平均關節炎評分。圖B顯示每個組中關節炎的百分比發生率。圖5顯示最多至第37天時的疾病發生。圖6顯示最多至第42天時相同實驗的結果。圖7:本研究中施用的vOX2-Fc融合蛋白的胺基酸序列。vOX2序列顯示為正常字體並有下劃線。這代表Russo等提交的全長序列中的78-307位胺基酸。序列AADPI(正常字體，無下劃線)是接頭區。免疫球蛋白YlFc序列顯示為斜體。免疫球蛋白的鉸鏈區(PKSCDKPHTCP)顯示為斜體並有下劃線。發明詳述vOX2vOX2是由KSHV病毒中命名為K14的開放讀碼框編碼的蛋白質(Je證r等,2001)。取自Russo等(PNAS93:14862(1996))的vOX2蛋白示例性序列如下i訓TF度PGRRVVEGGVISSYFLIGAPGRTAIKTEEGVSALQN78LPPTVLPVAGTGSWRPWCAPPWTTPSASRGSMSSLFISLPWVAFIWIALLGAVGGAKVQGPMRGSAALTCAIT,DIVSTOWQKRQLPGPVMVATYSHSYGVWQTQYRHKANITCPGLWNSTLVIHNLAVDDEGCYLCIFNSFGGRQVSCTACLEVTSPPTGHVQVNSTEDADTVTC歐GRPPraVTWAAPWNNASSTQEQFTDSDGI;丁VAWRTVRIjPRGraTTPSE3D7TMGICIjITWGNESISIPASIQGPIAHDLPAAOGTIAGVMTLVGLFGIFALHHCRRKQGGASPTSDtiMDPIjSTQ該病毒蛋白是膜結合蛋白，包含N端胞外結構域、跨膜結構域(具有下劃線的)以及C端胞內結構域。所述開放讀碼框含有兩個可能的起始甲硫氨酸，在1位和78位胺基酸處。通常認為78位甲硫氨酸最有可能被用作體內的起始密碼子。vOX2在體內的功能是有爭議的。然而，本發明人現已發現，可溶性vOX2顯示出抗炎特性，並因此可以在體內和體外用於抑制炎性應答。本發明方法中使用的可溶性vOX2蛋白可以是多價的。也就是說，它們可包含兩個或更多vOX2部分。多價vOX2可能比一價vOX2更有效地與靶細胞表面上的受體交聯。vOX2部分可共價地或非共價地相互結合，儘管出於穩定性並且可能地還有活性方面的原因而優選共價結合。兩個vOX2部分可以共表達為融合蛋白。為了產生融合蛋白，構建了在一個連續開放讀碼框中包含每個部分的編碼序列的核酸表達載體，從而這兩個部分可以翻譯為同一條多肽鏈的一部分。通常，在兩個結構之間包括柔性的肽接頭，以允許這兩個組分自由地相互作用而沒有空間位阻。技術人員完全能夠設計出適當的接頭。常規地，這樣的接頭長度在12至20個M酸之間，並且小的和親水的胺基酸g(例如甘氨酸和絲氨酸)的比例很高，以提供所需的柔性，而不破壞該分子的水溶性。或者，可以改造vOX2部分以提高其相互間的親和力。這可以通過多種方式實現。例如，可以引入半胱氨酸以使這兩個部分相互間形成二硫鍵。又或者，可以通過將每個vOX2部分與異源組分連接來促進兩個vOX2部分之間的相互作用，其中所述兩個異源組分能夠相互結合。當該異源組分為多肽時，其可以與所述vOX2部分表達為融合蛋白。優選的異源組分是包含抗體Fc序列、優選為一個或多個抗體Fc結構域(例如IgG、IgM的CH2、CH3和/或CH4結構域(適當時)等)的多肽。優選地，還包括通常位於CH1和CH2結構域之間的鉸鏈序列。鉸鏈區含有半胱氨酸殘基，其在完整天然抗體的重鏈之間形成二硫鍵。因此，如果本文所述的vOX2-Fc分子中存在鉸鏈區，則將形成類似的鍵以穩定鏈之間的相互作用。人IgGl是優選的融合配偶體。技術人員清楚可用於增強或穩定vOX2部分之間相互作用的替代性異源組分。它們包括亮氨酸拉鏈多肽，其通過疏7K相互作用二聚化。儘管優選重組方法，但是vOX2部分也可以通過化學手段共價連接。適於使多肽分子彼此綴合或交聯的雙功能和多功能化學接頭分子對技術人員來說是眾所周知的。無論是多價或一價，本文所述可溶性vOX2蛋白中每個vOX2部分優選地包含vOX2蛋白的胞外結構域(即78位至309位胺基酸的序列，根據需要包括或不包括信號肽)或者其足以表現出抗炎效應的片段。抗炎效應指使用實施例中所述的任一測定進行評估時U937細胞的IL-8或MCP-1產生、嗜中性粒細胞的氧化爆發、角叉藻聚糖模型中的炎症或^f吏用DBA小鼠的膠原誘導關節炎模型中疾病發生或嚴重性中一種或多種的統計學顯著性降低。優選地，所述vOX2部分包含上文顯示ECD序列中的至少50個^J^酸，並可包含上文顯示ECD序列中的至少100、150或200個胺基酸。然而，技術人員會理解，可以對該M酸序列進行某些改變而基本上保留該可溶性蛋白的抗炎活性。因此，所述vOX2蛋白或部分可包含至少50、100、150或200個氛基酸的序列，該序列與上述序列在相關重疊上具有至少80%的同一性，優選地與該序列具有至少850/。的序列同一性，更優選至少卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，只要其表現出所需的抗炎活性。特別地，vOX2序列中的保守性替換(與參考序列比較)尤其可以較好耐受，而不顯著影響功能。保守性替換可以定義為胺基酸類別之內的替換和/或在BLOSUM62矩陣中為正分值的替換。根據一種分類，胺基酸類別為酸性的、鹼性的、不帶電極性的和非極性的，其中酸性胺基酸為Asp和Glu;鹼性胺基酸為Arg、Lys和His;不帶電的極性胺基酸為Asn、Gln、Ser、Thr和Tyr;非極性胺基酸為Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Trp和Cys。根據另一種分類，胺基酸類別為小的親水性的、酸/醯胺/親水性的、鹼性的、小的疏水性的以及芳族的，其中小的親水性胺基酸為Ser、Thr、Pro、Ala和Gly;酸/醯胺/親水性胺基酸為Asn、Asp、Glu和Gln;鹼性胺基酸為His、Arg和Lys;小的疏水性胺基酸為Met、Ile、Leu和Val;芳族胺基酸為Phe、Tyr和Trp。在BLOSUM62矩陣中為正評分的替換如下tableseeoriginaldocumentpage17與參考序列的胺基酸序列同一性百分比(％)定義為在進行序列比對並在必要時引入缺口以實現最高序列同一性百分比之後，候選序列中與參考序列中胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比，任何保守性替換都不認為構成序列同一性。可以通過WU-BLAST-2(Altschul等,MethodsinEnzymology，266:460-480(1996))確定同一性百分比的數值。WU-BLAST-2使用若干檢索參數，其中大多數設置為默認值。將可調整的參數設置為以下值重疊跨度=1,重疊分數(overlapfraction)=0.125，詞閾值(wordthreshold)(T)=11。用WU-BLAST-2確定的匹配的相同殘基數除以參考序列的殘基總數(忽略通過WU-BLAST-2在參考序列中引入的使比對評分最大化的缺口)，再乘以100,從而確定Q/。胺基酸序列同一性值。胺基酸相似性百分比(％)以與同一性相同的方式進行定義，只是計算BLOSUM62矩陣中為正評分的殘基。因此，不相同但具有相似特性(例如由保守性替換得到的)的殘基也計算在內。類似地，與參考核酸的核酸序列同一性百分比(％)定義為候選序列中與參考核酸序列中核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。本文使用的同一性值可以由WU-BLAST-2中設置為默認參數的BLASTN模塊產生，其中重疊跨度和重疊分數分別設置為l和0.125。在本說明書中所述的可溶性vOX2蛋白優選表達自真核細胞，如酵母細胞、昆蟲細胞(例如Sf9細胞)以及哺乳動物細胞(例如CHO(中國倉鼠卵巢)細胞)。優選地，所述蛋白正確摺疊並因此能與CD200受體(CD200R)結合。適當的測定描述於Foster-Cuevas等(2004)及其引用的參考文獻。優選地，vOX2蛋白製備物中至少20%的vOX2部分能夠與CD200受體結合；更優選地，vOX2蛋白製備物中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的vOX2部分能夠與CD200受體結合。使用CD200受體的親和純化技術可用於在可溶性vOX2蛋白製備物中實現理想的結合活性水平。可溶性vOX2蛋白的治療用途本發明人已顯示，可溶性vOX2具有抗炎特性，尤其是能夠下調免疫系統先天部分(如嗜中性粒細胞和巨噬細胞)介導的反應。該蛋白可特異性地降低經幹擾素y處理的巨噬細胞樣細胞系U937中的MCP-1和IL-8產生，還能抑制嗜中性粒細胞的氧化爆發。它也能降低鼠模型中由角叉藻聚糖誘導的炎症，重要的是，其顯著影響DBA小鼠中由^^、誘導的關節炎的發生和嚴重性。這一結果特別令人驚訝。因此，可溶性vOX2可用於治療炎症、炎性疾病或其它疾病，在這些疾病中涉及先天免疫系統的不恰當或不希望的免疫應答是該疾病症狀和/或疾病發病的原因。這樣的疾病包括自身免疫病、變態反應和移植排斥。因此，例如，可溶性vOX2可用於治療類風溼性關節炎、4艮屑病、炎性腸病、多發性硬化、哞喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性和變應性皮膚病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心臟病)和炎性神經症候群。可將可溶性vOX2蛋白以藥物組合物直接施用於受試者。或者，可以對受試者施用編碼可溶性vOX2蛋白的核酸，從而由受試者自身的細胞表達並分泌可溶性vOX2蛋白。所述核酸通常是一種或多種表達載體的一部分，可以作為^t酸施用或在遞送載體如病毒載體(例如腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒)中施用。或者，可以對受試者施用經改造以分泌可溶性vOX2蛋白的細胞。優選地，所述細胞與受試者是同源的或組織相容的。例如，細胞可取自受試者，經一種或多種適當的載體轉染後，再施用於該受試者。作為補充或替代，所述分泌細胞可^V膠嚢，例如在生物惰性聚合物中，以防止移植細胞與宿主免疫系統之間發生相互作用。技術人員將能夠設計用於治療用途(以及用於本說明書中所述的其它用途)的適當的核酸表達載體。所述載體將一般含有適當的調節序列，包括啟動子序列、終止子片段、增強子序列、標記基因和其它序列，這取決於待施用的可溶性vOX2蛋白的具體形式(見上文)。該載體可旨在整合進宿主細胞基因組，或可作為附加體獨立於宿主基因組而存在和複製。通過本發明方法進行處理的優選受試者是哺乳動物。優選的受試者是靈長類(包括人)、嚙齒類(包括小鼠和大鼠)，以及其它常見的實驗動物、家畜和農業動物，包括但不僅限於兔、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊等。本文所述的複合體、多肽、核酸和細胞可以配製成藥物組合物。除了上述物質之一之外，這些組合物可包含可藥用賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或其它本領域技術人員所熟知的材料。這些材料應該是無毒的，並且不應幹擾所述活性成分的效力。所述載體或其它材料的確切性質可取決於給藥途徑，例如口服、靜脈內、皮膚或皮下、經鼻、肌內和腹膜內途徑。用於口服給藥的藥物組合物可以為片劑、膠嚢劑、粉劑或液體的形式。片劑可包括固體載體如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液體栽體，如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。可以包括生理鹽水、葡萄糖或其它糖溶液或者二元醇諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。就靜脈內、皮膚或皮下注射或者患病位點注射而言，活性成分將為可用於腸胃外的水溶液形式，其不含熱原，並具有適當的pH、等滲性和穩定性。本領域相關技術人員能夠熟練地製備適當的溶液，使用例如等滲載體(如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液)。需要時，可以包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其它添加劑。無論待施用於個體的活性劑(例如本發明的細胞、多肽、核酸分子、其他藥用劑)的性質如何，都優選以足以顯示對個體的益處的"預防有效量"或"治療有效量，，(在有可能出現的情況下，儘管是預防也可以認為是治療)施用。實際的給藥量以及給藥的速率和時程將取決於受治個體的性質和嚴重性。治療的處方(例如劑量的確定等)在全科醫師和其它醫生的責任範圍內，通常考慮待治療的疾病、個體患者的狀況、遞送位點、給藥方法以及開業醫師已知的其它因素。上述技術和方案的實例可見於Remington'sPharmaceuticalSciences,20thEdition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins。或者，通過使用耙向系統如抗體或細胞特異性配體，可以使用靶向治療將活性劑更為特異地遞送至某些細胞類型。可能由於多種原因而需要靶向治療，例如，所用試劑具有不可接受的毒性，或者否則將需要過高的劑量，或者否則將不能進入乾細胞。組合物可以單獨施用，或者同時或連續地與其它治療組合施用，取決於待治療的狀況。材料和方法克隆vOX2-Fc融合蛋白將KSHVvOX2蛋白作為融合蛋白的氨基端結構域與人IgGiFc區的C端片段一起框內表達。基於我們自己的研究(數據未顯示)和先前公開的分析(Chung等，2002,Neipel等，1997,Russo等，1996),選擇兩個可能的甲硫氨酸殘基(殘基1或殘基78)中的第二個作為起始密碼子。通過PCR擴增ORFK14,並TA克隆進pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)。所述基因擴增自BC-1KSHV感染的原發性滲出性淋巴瘤細胞系(Cesarman等，1995),使用以下PCR引物有義，5'—GCTCTAGATCTCTAGCCTCTTCATTTCATTAC-3'反義5'"*TATGCGGCCGCGGCCGCGGSAAGGTCATGGGC—3'。這些擴增引物包括限制性位點(？V^I和X6fll),使得可以將該基因亞克隆進表達載體。對K14插入片段的兩條鏈進行測序，證實PCR沒有引入錯誤，並將該基因亞克隆進pDR2AEFla表達載體(參閱(Spiller等，2003))而產生pvOX2-Fc。亞克隆包括使用AT6flI和iVWI將K14插入片段從pCR2.1-TOPO上消化下來，並連接到經I和I消化的pDR2AEFla中。在K14插入位點對pvOX2-Fc質粒進行測序，以確保連接已產生了病毒與IgGi基因的框內融合。得到的vOX2-Fc融合蛋白的胺基酸序列示於圖7。細胞和細胞培養在37。C、5%C02T,在補充了10%熱滅活胎牛血清(FBS)、L-穀氨醯胺(2mM)、青黴素-鏈黴素(1%)、非必需胺基酸(O.lmM)的RPMI1640培養基(BioWhittaker)中培養人成單核細胞系U937。為了使U937細胞分化為巨噬細胞樣表型，將其在重組幹擾素(ifn)-y(5ng/ml;R&DSystems)存在下培養48小時。獲得知情同意書後，從健康的成人志願者收集肝素化的靜脈血。使用SysmexSE,9500血液分析儀(SysmexCorp.,Japan)進行白細胞計數和分類計數。在一些測定中，通過葡聚糖沉降和紅細胞低滲裂解、隨後通過Ficoll(Sigma)進行差異密度梯度離心來從全血中分離多形核細胞。為了得到產生vOX2-Fc蛋白的細胞系，將pvOX2-Fc轉染進CHO細胞。在含有潮黴素B(500ng/ml)的培養基中獲得穩定細胞系，並分別使用抗人IgG-FITC(Sigma)或抗人IgG-HRP抗體通過免疫螢光和Westen印跡篩選出產生重組蛋白的穩定細胞系。將vOX2-Fc蛋白質產生最多的細胞系命名為CHO-15"69。蛋白產生和純化收集CHO-15，，69細胞上清液，並使用AKTA蛋白純化系統(Amersham)在A蛋白柱(HiTrap,Amersham)上對vOX2國Fc進4亍親和純化。為了去除截短的vOX:Fc和Fc蛋白片段，接著通過在Superdex200大小排阻柱(Amersham)上進行凝膠過濾來"精製"該蛋白。通過以下方法評估蛋白純度聚丙烯醯胺凝膠電泳並利用考馬斯亮藍R250(Bio-RadLaboratories)或SyproRuby(Analgene)染色來分析凝膠，4吏用抗人IgG-HRP和抗牛Ig-HRP(Sigma)進行western印跡檢測。切下所有的蛋白條帶並通過質譜(MS)或基質輔助雷射解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質i普進行鑑定。在一些實驗中，利用同樣的方案純化人IgG純化用作陰性對照。氧化爆發測定利用基於流式細胞術的商品化Bursttest測定(OPREGENPharma;BDBiosciences,Oxford,UK)，在全血外周多形核單核細胞中測量吞噬過程的氧化爆發組分。該測定允許定量測定白細胞的活性，而無需預先純化細胞。Bursttest測定依賴於作為微粒刺激物的未標記的經調理大腸桿菌(五."/Z)以及作為氧化活性螢光底物的二氫羅丹明(DHR)123。簡言之，將肝素化的全血與重組vOX2-Fc(10[ig/ml)或純化的人IgG(10嗎/ml)—起孵育(卯分鐘，37。C，5%C02)，再與經調理的大腸桿菌細胞(6個細胞/白細胞)一起孵育(7分鐘，37°C,5%C02)。無刺激物的樣品作為陰性(背景)對照。然後加入DHR123並孵育細胞(10分鐘，37。C，5%C02)。加入裂解緩衝液終止反應，該緩衝液部分固定白細胞並裂解紅細胞。最後，為了排除細菌或血小板的聚集假象，在臨進行流式細胞術分析之前將細胞DNA染色。利用流式細胞儀(FACSCalibur，BDBiosciences)對細胞進行分析，獲得5000個粒細胞事件以得到產生反應性氧基團的細胞百分比和數目，以及以平均螢光強度衡量的其酶活性程度。吞謹測定利用基於流式細胞術的商品化Phagotest試劑盒(OPREGENPharma;BDBiosciences),在全血外周多形核單核細胞中測量吞噬作用的吞入方面。與Bursttest類似，該測定系統允許定量測定白細胞的吞入活性，而無需預先純化。簡言之，將肝素化的全血與重組vOX2-Fc(10嗎/ml)或純化的人IgG(10ng/ml)—起孵育(90分鐘，37°C，5%C02)，再與經調理的FITC標記大腸桿菌細胞(6個細胞/白細胞)一起孵育(IO分鐘，37。C，5%C02)。通過4X:孵育並加入淬滅溶液來終止攝取。該溶液使細菌表面結合的FITC螢光淬滅而內化顆粒的螢光不變，從而允許利用流式細胞術分辨附著的和內化的細菌。洗滌步驟後，通過低滲裂解去除紅細胞。最後，如Bursttest測定中所述，將細胞DNA染色。利用流式細胞術(FACSCalibur,BDBiosciences)對細胞進4亍分析，並獲得5000個粒細胞事件。MCP-1和IL-8蛋白的測量在存在或不存在重組vOX2-Fc蛋白(10jig/ml)時，不處理或用rIFN誦y(5ng/ml)處理U937細胞(1x106/ml),並孵育48小時(37。C，5%C02)。然後，收集該培養液，並通過Luminex測定法定量細胞因子和趨化因子的濃度。體內研究測試急性炎症的鼠模型以評估重組vOX2-Fc蛋白的體內抗炎效應。在該模型中，如前述通過將海藻提取物角叉藻聚糖施用於每隻動物的一個後爪中來誘發BALB/c小鼠(JacksonLaboratories)足墊的急性炎症(Leung等，2001)。在每個實驗中，四組BALB/c小鼠在施用角叉藻聚糖之前30分鐘接受腹膜內(IP)注射重組vOX2-Fc(80ng/小鼠)、純化的人IgG(80pg/小鼠)、地塞米松(500嗎/小鼠)或^酸緩沖鹽水(PBS)。通過測量足墊厚度來確定炎症程度，計算為接種角叉藻聚糖的後足墊與同一動物未接種的後足墊之間的厚度差異。在施用角叉藻聚糖後6、12和24小時後進行這些測量。進行了三次獨立的單盲實驗。統計分析通過無參數MannWhitney檢驗來測定Bursttest、Phagotest和細胞因子測定中各處理組之間的差異。如果P￡0.05,則認為這些差異顯著。對於體內研究，通過GLM重複測量進行數據分析，之後使用Tukey作為四個治療組之間的多重比較檢驗(SPSS)。為了分析每個時間點(6、12、24小時)各組之間的差異，進行了MannWhitney檢驗。如果P^0.05，則認為差異顯著。結果重組vOX-2:Fc蛋白的克隆、合成和純化將全長KSHVORFK14基因克隆進pDR2AEFla真核表達載體中，其中vOX2蛋白作為與人IgGiFcC端結構域的融合蛋白產生。將vOX2表達為與該Ig^結構域的融合蛋白的優勢包括(i)提供了用於蛋白純化的親和標籤，和(ii)可將重組蛋白的半衰期提高多達10倍(Harris等，2002)。然後，在細胞系CHO-15"69中產生重組vOX-2:Fc蛋白(圖1A),並利用A蛋白親和以及大小排阻層析從培養液中進行純化(圖1B)。選擇大小排阻層析是因為僅通過A蛋白親和層析會純化出重組vOX2-Fc的多個條帶(圖1B)。通過MS或MALDI-TOFMS將這些條帶的身份確定為vOX2-Fc二聚體、單體和截短形式，以及Fc自身(數據未顯示)。在大小排阻層析後，獲得了重組vOX2-Fc的單條帶(圖1B)。通過vOX-2:Fc蛋白在體外抑制髓樣細胞的炎性應答為了確定vOX-2:Fc蛋白是否調節髓樣細胞的炎性應答，評估與該重組蛋白接觸的巨噬細胞樣U937細胞的細胞因子產生鐠。不處理細胞，或者在存在或不存在vOX-2:Fc蛋白時用rIFN-y處理U937細胞，並測定炎性細胞因子的產生。vOX2-Fc處理顯著降低了MCP-1(約30%)(圖2A)和IL-8(約50%)(圖2B)的產生。這種效果是特異性的，因為其它炎性細胞因子包括嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)、MIP-la、MIPip、RANTES、IL-ip、IL-6和TNFa的產生未受影響(數據未顯示)。對vOX-2:Fc調節髓樣細胞活性的進一步研究表明，該蛋白顯著下調(至少25%)原代人嗜中性粒細胞的氧化爆發活性(圖3A)。這種抑制對於吞噬作用的這一方面是特異性的，因為這些細胞的吞入活性未受影響(圖3B)。通過重組vOX-2:Fc體內抑制急性炎性應答因為重組vOX2-Fc蛋白在體外具有抗炎活性，所以測定了其在這方面的體內潛能。因此，為了檢查vOX2-Fc對於實驗性急性炎症發生的影響，用重組vOX2-Fc蛋白(80嗎)處理BALB/c小鼠，其在通過角叉藻聚糖接種足塾誘發急性炎症前30分鐘經腹膜內施用。在6、12和24小時後測定足墊的炎症程度(參閱"方法")。用純化的人IgG(80嗎)、地塞米松(500嗎)或PBS代替vOX2-Fc注射三組對照組小鼠中的每一組(圖4)。總體而言，根據GLM重複測量分析以及之後的Tukey檢驗，如同測量足墊厚度所確定的，重組vOX2-Fc處理顯著抑制了急性炎性應答，PBS與vOX2-Fc，P〈0.0001;IgG與vOX2-Fc，PO.005;地塞米松與vOX2-Fc，PO.OOl。與預計一樣，PBS和IgG處理組的炎性應答t間沒有顯著差異。為了分4斤每個時間點(6、12和24小時)vOX2-Fc組之間的承制性影響，進行了無參數MannWhitney檢驗(表l)。這些分析表明，在研究持續時間中(24小時)與PBS處理組相比，以及在至少12小時中與人IgG處理相比，重組vOX2-Fc蛋白顯著抑制實驗性誘發的急性炎症。對足墊的組織病理學分析支持了這些分析。因此，該數據顯示與未處理小鼠相比，急性炎症嚴重性和炎性細胞募集至炎症位點的統計學顯著性降低。tableseeoriginaldocumentpage26表1.對小鼠足墊角叉藻聚糖處理所誘發炎症的抑制進行統計分析。利用MannWhitney無參數分析對vOX2-Fc處理組的測量與對照組測量進行比較。實驗方法參見圖4的圖例。抑制DBA小鼠中膠原誘導的關節炎在盲研究中檢查vOX2-Fc對DBA小鼠中膠原誘導的關節炎的影響。使用另外兩種Fc融合蛋白作為對照。它們是補體調節蛋白KCP的Fc融合物，以及缺乏補體調節活性的KCP蛋白三賴氨酸突變體(KCPmut)的Fc融合物。在第0天，用II型膠原和弗氏完全佐劑免疫小鼠，並在第21天用鹽水中的II型膠原進行攻擊。預計疾病第一種體徵在第27天發生。預計至第35天發生廣泛的疾病。各組小鼠(每組10隻)在第-1和第0天接受PBS中100pg的相應Fc融合蛋白。每組在第3天以及之後每隔兩天直至第27天(包括第27天)接受PBS中的50嗎蛋白。另一個對照組的小鼠只接受PBS。至第37天時的結果示於圖5。數據表示為相關時間點上每組的平均分。至第42天時的結果(除了KSP:Fc對照以外)顯示於圖6。該數據表明，vOX2-Fc顯著抑制該模型中關節炎的發生和嚴重性。討論KSHV是最近描述的人類致癌病毒(Chang等，1994)。它是卡波西肉瘤(KS)的致病因素，該病是影響AIDS患者和老年地中海人的複雜腫瘤，並且是非洲最常見的腫瘤。KS的發病機制相當複雜，並且最近的證據指出KSHV誘導受感染的上皮細胞轉錄再編程至淋巴表型，從而促進淋巴管發生，並因此促進腫瘤發生(Hong等，2004,Wang等，2004)。負責這種轉錄再組織的病毒基因尚未最後確定，但是可能包括G蛋白偶聯受體(Bais等，2003)。儘管如此，近20。/。的KSHV基因組包括具有免疫調節活性的基因。它們包括被確定為抑制MHCI表面表達(Coscoy&Ganem，2000)、調節T細胞免疫突觸(Coscoy&Ganem，2001)、抑制補體活化(Spiller等，2003)、中斷幹擾素信號級聯(Zhu等,2002)、趨化因子信號(Boshoff等，1997)以及B細胞受體信號(Choi等,2000)的基因。推定的免疫調節KSHV基因之一(ORFK14)的vOX2的產物的功能是有爭議的，歸結為巨噬細胞活化(Chung等，2002)和抑制(Foster-C譜as等，2004)活性。為了評估vOX2在本研究中的功能，將其表達為具有人Ig仏可結晶片段(Fc)結構域C端的N端融合蛋白。我們通過測量其在原代細胞或細胞系中對吞噬細胞吞入、氧化爆發和促炎細胞因子釋放的影響來評估vOX2-Fc的體外抗炎特性，並發現其降低嗜中性粒細胞中的氧化爆發活性並下調促炎趨化因子IL-8和MCP-1的產生。重要的是，還在模型中評估了vOX2-Fc的影響，在該模型中通過施用海藻提取物角叉藻聚糖誘導小鼠足墊的急性炎症。施用重組vOX2-Fc顯著抑制該炎症效應，提供了該重組蛋白抑制急性炎性應答(特別是中性粒細胞的流入量)的確定證據。我們的發現表明，重組vOX2-Fc蛋白將負免疫調節信號傳遞給吞噬細胞，從而抑制先天免疫應答。vOX2-Fc融合蛋白也能抑制鼠科模型中膠原誘導的關節炎的發生。vOX2-Fc蛋白抑制人外周血嗜中性粒細胞受到細菌細胞刺激後ROI的產生。ROI穩態對正常的細胞功能是關鍵性的，因為低水平的ROI對許多細胞信號轉導事件至關重要。在生理條件下，正常細胞代謝中產生的ROI水平與內源抗氧化劑水平之間存在平衡，所述內源抗氧化劑用於防止組織受到氧化損傷(McCord，1993)。vOX2-Fc抑制嗜中性粒細胞中的氧化爆發依賴於將vOX2-Fc與細胞預孵育至少2小時。這種對細胞與其它免疫調節劑預孵育的依賴性在之前已有報導(Chen等，2004，Lehn等，1989)。還應該注意，IgG複合物是ROI產生的已知刺激劑(Satriano等，1999)，其進一步支持了我們的IgG對照研究中vOX2-Fc的抑制活性不是由於該分子的Fc組分。已經將氧化脅迫與炎性反應相聯繫，甚至ROI水平的瞬時提高也是血管生物學的重要中介體，影響細胞生長、凋亡、遷移、炎症和分泌(綜述於(Fattman等，2003，Touyz&Schiffrin，2004))。而且，ROI的過量產生與許多疾病的發病機制相關，如心血管疾病、神經疾病、腎衰竭和肺疾病(綜述於(Bowler&Crapo,2002，Delanty&Dichter，1998，Fukai等，2002))。ROI也可以代表基因活化的第二信使系統(綜述於(Droge,2002))，其可能對組織損傷期間趨化因子如MCP-1和IL-8的產生具有重要性(DeForge等，1993，Satriano等，1993,Vlah叩oulos等，1999)。事實上，釋放趨化因子是vOX2-Fc負調控的另一種髓系功能。我們發現經IFN-Y處理而發生分化的單核細胞U937細胞產生MCP-1和IL-8(二者均具有促炎作用)的能力被顯著抑制(圖2)(Akahoshi等，1994,Baggiolini,2001,Endo等,1994，Frangogiaimis等,2002，Hatano等，1999,Poddar等，2001,Withanage等，2004,Yla-Herttuala等，1991)。因為促炎趨化因子和毒性氧代謝物增加了心血管、關節炎、腫瘤以及神經退行性疾病的發病，所以vOX2-Fc有助於開發針對這些疾病的新療法。儘管本發明已結合上文的實施方案進行了描述，然而當給出該公開內容後，許多等價的改良和改變對於本領域的技術人員是顯而易見的。因此，所公開的本發明實施方案應認為是示例性而非限制性的。可以對所述實施方案進行各種改變而不背離本發明的精神和範圍。本文所引用的所有參考文獻均明確地通過參考方式併入本文。參考文獻Akahoshi,T,,Enclo,H.fKondo,H.,KashiwazaJci,S.,Kasahara,T.,Mukaida,Harad$,A,&Matsushiraa,K,(1994).Essentialinvolvementof丄nterleukin—8inneutrophilrecruitmentinrabbitsw丄thacuteexperimentalarthritisinducedbylipopolysaccharideandinter工eukin一l.Irymp力oA:ineCy亡oti/ie13,113-6,Baggiolini,(2001),Chemokinesinpathologyandmed丄cine,JIntexTi船c250,91-104，Bais,C,rVanGeelen,A.,ErolesfP.,Mutlu,A.,Chiozzini,C.,Dias,S.,Silverstein,R，I,,Rafii,S,&Mesri,S，A,(20Q3),Kaposi'ssarcoruaassociatedherpesvirusGprotein-coupledreceptori咖ortalizeshumariendothelialcellsbyactivation。ftheVEGFreceptor-2/KDR.C5/3c:ejrCe"3,131-仏Boshoff,C,,Endo,Y.fCollins,P.D,,Takeuchi,Reeves,J.D,,Schweickart,V,L.,S丄ani,M.A，,Sasaki,T.,Williams,r,J"Gray,E5,Moore,P.S"Chang,&Weiss,R.A,(199",AngiogenicandHIV-inhibitoryfunctionsofKSHV-encodedchemokines[seecomments].Science278,290-4.Bowler,R,P,&Crapo,J,D,(2002>.Oxidativestressinairways''istherearoleforextracellularsuperoxidedisiuutaseAmJ"i^esplrCritCsreMed166,S38-43.Cesarman,E,fMoore,S.,Rao,P,HwInghirami,G*,Knowles,D,M.&Chang,(1995)*Invitroestablishmentandcharacterizationoftwoacquiredimmunodeficiencysyndrome—relatedlymphomacelllines(BC-landBC-2)containingKaposi'ssarcoina—associatedherpesvirus—like(KSHV)DNAsequences.Blood86,2708-14,Chang,Y*.fCesamanfE,,Pessin,MfS,,Lee,5\,Culpepper,J.,KnowlesrD.M,&Moore,P.S.《，4).Identificationofherpesvirus-likeDNAsequencesinAIDS-associatedKaposi'ssarcoma.Science266,1B65-9,Chen,J.W,rLin,F,Y,,Chen,H,,Wu,T,C.,Chen,Y,&."Lin,s，J,(2004).CarvedilolInhibitsTumorNecrosisFactor-{alpha}-InducedEndothelialTranscr丄pticmFactorActivation,AdhesionMoleculeExpression,andAdhesivenesstoH咖anMononuclearCeils.Artez"ioscJez"rTjJromdVaseChoi,J,K.,Lee,B,S,,Shim,S*Li,M.&Jung,J.(2000),IdentificationofthenovelK15gecieattherightmostendoftheKaposi'ssarcoma-associatedherpesvirusgenome，JV"ijro274,436—46.Chung,H,,Means,R.E,,Choi,J,Lee,B,S，&Jung，J.U，(2002),Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirus0X2glycoproteinactivatesmyeloid-lineagecellstoinduceinflarrunatorycytokineproduction,JViro_Z76,4688-98.CoscoyfI*'&Ganem,D.(2000),Kaposi'ssarcoma-associatedherpesvirusencodestwoproteinsthatblockcellsurfacedisp丄ayofMHCclass工chainsbyenhancingtheirendocytosis.ProcMatlAcsdSc丄USA",8051-6,Coscoy,L.&Ganem,D.(2001〉.AviralproteinthatselectivelydownregulatesICAM-1andB7-2andmodulatesTcellcost丄mulation.JOli/]Invest107,1599—606，DeForge,!>."E.,Prestori,A.Takeuc^i,E,,Kemiey,J.,Boxer,A.&Remick,D.G,(1993).Regulationofintsrleukin8geneexpressionbyoxidantstress.<J5ioJC力柳268,25568-Delanty,&Dichter,M.A.(1998}.Oxidativeinjuryinthenervoussystem,ActaWeuroJScsjid98,145-53,DrogefW.(2002〉.Freeradicalsinthephysiologicalcontrolofcei!Lfunction,PhysiolSev82,47-95,Endo,H,,Akahoshi,T.,Nishimura,A.,Tonegawa,M.,Takag丄sh丄rK.,Kashiwazak丄,S.,Matsushima,K.&Kondo,H.(1994),Sxperi肺ntalaxttixitisinducedbycontinuousinfusionofIIj-8intorabbitJcneejoints.CUinSx_pI/nmurrca96,31-5,Fattman,C，L.,Schaefer,Ij,M.&Oury,T,仏(2003).Extracellularsuperoxidedis脆taseinbiologyand鵬dici:ne.FreeSsdicSioJ胸d35,236-56.Foster-CuevasrM.rWright,G.J.,Pufclavec,M.Brown,M.&Barclay,A.N，(2004)Humanherpesvirus8K14proteinmimicsCD200indown-regulatingmacrophageactivationthroughCD2O0receptor,JVirol78,7667-76.Frangogiannis,Smith,C,W.&Entman,M.L,(2002),Theinflammatoryresponseinmyocardialinfarction,Cajrc/iovascRes53,31-47.FuJcai,T.,Pols,R.J,,Landmesser,53,&Harrison,D.G.(2002),Extracellulax"supero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量的權利要求50至55中任一項所述的第一和第二核酸。59.藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的權利要求50至55中任一項的組合物。60.根據權利要求59的組合物或方法，其中所述炎性疾病為自身免疫病、變態反應或移植排斥。61.根據權利要求60的組合物或方法，其中所述炎性疾病為類風溼性關節炎、銀屑病、炎性腸病、多發性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性或變應性皮膚病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心臟病)或炎性神經症候群。62.試劑盒，其包含權利要求50至55中任一項所述的第一和第二核酸。63.根據權利要求62的試劑盒，其中每種核酸均與可藥用載體組合。64.根據權利要求62或權利要求63的試劑盒，其中所述第一和第二核酸位於各自的第一和第二表達載體上。65.宿主細胞，其包含權利要求38至42中任一項所述的核酸，或者包含權利要求50至55中任一項所述的第一和第二核酸。66.根據權利要求65的細胞，其用於醫學治療方法。67.根據權利要求65的細胞，其用於預防或治療炎性疾病。68.預防或治療炎性疾病的方法，包括對有此需要的患者施用有效量的根據權利要求65的細胞。69.藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的根據權利要求65的細胞。70.根據權利要求67或權利要求68的細胞或方法，其中所述炎性疾病為自身免疫病、變態反應或移植排斥。71.根據權利要求72的細胞或方法，其中所述炎性疾病為類風溼性關節炎、銀屑病、炎性腸病、多發性硬化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性和變應性皮膚病、炎性眼病、移植排斥、血管炎症(心臟病)或炎性神經症候群。72.可溶性抗炎劑，其包含至少兩個vOX2部分的複合體。73.根據權利要求72的可溶性抗炎劑，其中包含融合蛋白，所述融合蛋白包含任選地通過接頭分開的至少兩個vOX2部分。74.根據權利要求72的可溶性抗炎劑，其包含與各自的第一和第二異源組分相連的第一和第二vOX2部分，其中所述第一和第二異源組分彼此相連。75.根據權利要求74的可溶性抗炎劑，其中所述異源組分是與其各自vOX2部分的融合蛋白。76.根據權利要求74或權利要求75的可溶性抗炎劑，其中所述異源組分為抗體Fc區。77.根據權利要求74或權利要求75的可溶性抗炎劑，其中所述異源組分為轉錄因子的寡聚化結構域。78.根據權利要求77的可溶性抗炎劑，其中所述異源組分為亮氨酸拉鏈基序。79.編碼權利要求73或75至78中任一項所述融合蛋白的核酸。80.包含根據權利要求79的核酸的表達載體。81.宿主細胞，其包含根據權利要求79的核酸或根據權利要求80的表達載體。全文摘要本發明提供由卡波西肉瘤相關皰疹病毒(KSHV)編碼的可溶性vOX2蛋白衍生物，及其用於治療炎性疾病如自身免疫病、變態反應和移植排斥的用途。文檔編號A61K39/245GK101184505SQ200680018907公開日2008年5月21日申請日期2006年4月3日優先權日2005年4月1日發明者大衛·J·布萊克布恩,賽義德·阿卜杜勒拉欣·拉扎伊申請人:格拉斯哥大學大學行政評議會