轉運蛋白及其應用的製作方法

2023-05-25 13:03:01

專利名稱：轉運蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉運蛋白，具體涉及基於VP22的轉運蛋白、VP22的同源物或其片段，還涉及包括轉運蛋白的分子和組合物，並涉及高效遞送這類蛋白質和任何結合的分子至靶細胞群的方法。
1型單純皰疹病毒(HSV-1)UL49基因的產物，結構蛋白VP22(4)，是HSV殼的主要成分，處於病毒殼體外和包膜內的毒粒的區室，由至少10個或更多個病毒多肽構成(參見綜述(6))。VP22的分子量為32k，具有較強的鹼性，並通過感染細胞內的磷酸化和核苷酸化(1、4、8、9、11)而被修飾。
儘管和已被完全鑑定的轉錄調節蛋白VP16一起是毒粒內主要殼蛋白之一，但對於VP22在病毒複製循環中的作用知道得很少。尚不知它是否是必需的病毒蛋白，但在類似於VP16的方式中，VP22有可能在感染期間起兩個作用一首先在病毒基因表達中作為功能蛋白，其次在病毒裝配中作為毒粒的結構成分。至於前者，一些跡象表明VP22能與HSV-1 DNA專一性地結合(2、8、10)。
我們最近闡述了VP16和VP22之間存在穩定的和專一性的相互作用，它與裝配和轉錄激活中VP16的作用機制有聯繫。在那些研究中，我們發現當VP22自身在細胞中時，它具有獨特的行為模式。在本文所述的工作中，我們擴展了這些研究以詳細探討細胞的定位作用，業已發現VP22表現出極為獨特的性能，因為它從最初表達它、而且它在其中表現胞質定位作用的細胞有效地轉運至單細胞層內的毗鄰細胞，它在毗鄰細胞中被攝取入細胞核。我們試驗過的一些蛋白質中的其它任何蛋白質例如VP16均未觀測到這種行為模式；而且據我們所知，這些性能和活性是前所未有的。
當將VP22或VP16引入單細胞層大約30小時之後觀測到VP22的這種意外的性能，雖然平均而言可在約2-5％的細胞內檢測到VP16(是這種試驗中常見的)，但VP22幾乎可在單細胞層的每個細胞中被檢測到。我們還發現VP22胞間轉運的專一性，並業已證實了在該蛋白質的C端含有決定子。這是由於，缺失C端34個胺基酸的變體雖然在初始表達細胞內的胞質定位中被表達，但未被轉運至毗鄰的細胞。
蛋白質分泌或外排通常是通過專一途徑發生的，要求已被完全鑑定的信號序列，分選入輸出途徑中包括的區室和小泡，可參見綜述(12)。VP22沒有慣常的任意信號序列，而且它的轉運途徑和機制相當獨特，從未被鑑定過。對於VP22中需要的決定子和細胞內生理需要的進一步研究應有助於闡明所涉及的途徑。因此，VP22或者更具體地指VP22轉運中涉及的決定子，可被轉移到其它蛋白質，以能在靶細胞群內轉運和有效表達或攝取。可容易地設想該性質的廣泛效用和應用。
因此，本發明基於上述發現，即有可能將編碼轉運蛋白的核酸引入靶細胞群的第一部分，和任選地用編碼與轉運蛋白結合的蛋白質(例如融合配偶體)的核酸，來表達核酸，任選地從組織專一性啟動子產生蛋白質；然後該轉運蛋白連同相關任意蛋白質從細胞中輸出，而被不直接產生蛋白質的靶細胞群的第二部分攝取。通常發現該蛋白質被靶細胞群的第二部分高效地攝取，並傾向於定位在靶細胞群的第二部分的核內。於是，將初始引入作用和後續的轉運結合可使轉運蛋白和任何相關蛋白質被高效遞送至靶細胞群。
因此，本發明的一方面在於提供這種蛋白質它可從表達它的細胞內輸出，並能被其它細胞例如不直接產生該蛋白質的細胞攝取。該轉運蛋白優選與需要遞送至靶細胞群的一種或多種其它蛋白質結合。
進一步的實驗證實，當VP22作為提取物被加入胞外介質時它就被輸入細胞。這說明，要發生觀測到的胞間轉運，無需在至少部分細胞群中表達VP22。
在另一方面，VP22轉運蛋白例如可通過共價鍵與相關分子偶聯，或與相關分子結合，並以該形式應用；這與應用表達載體產生蛋白質和/或相關分子恰好相反。具體地說，這可使非肽基分子如核酸、藥物或標誌物(蛋白質除外或作為蛋白質的替代物)與轉運蛋白結合併被細胞群攝取，而無需在至少部分細胞群內表達VP22及相關分子，其中需要將VP22和/或相關分子遞送至這些細胞群。
在一個優選的實施方案中，本發明提供如下轉運蛋白(ⅰ)VP22或其活性部分；(ⅱ)VP22的片段或同源物，包括提供轉運性能的一種或多種決定子；或者，(ⅲ)得自VP22的C端34個胺基酸的片段；該轉運蛋白任選與需要轉運至靶細胞群的一個或多個其它分子結合。
在本發明中，「活性部分」表示比全長VP22短的肽，但它保留被產生它的細胞分泌和被其它分子攝取的性能。
本發明的進一步方面是提供包括一種或多種上述轉運蛋白的組合物，該蛋白質任選與需要遞送至細胞群的一個或多個分子結合。
本發明的又一方面在於提供將所需分子轉運入細胞群的方法，是通過將細胞暴露於所需分子和上述轉運蛋白而實施的。
因此在該方面，本發明提供的方法避免初始需要用編碼轉運蛋白和任選所需分子的核酸轉染細胞群。這樣，也可以轉運非肽基、不能在細胞內表達的分子，因為可將所需分子和轉運蛋白加入細胞周圍的介質中。
在一些實施方案中，可使所需分子與轉運蛋白共價偶聯，並將這些實體暴露於靶細胞群。也可將所需分子與轉運蛋白非共價鍵結合，例如利用脂質基載體摻合如核酸的所需分子和轉運蛋白。
因此在另一方面，本發明提供製備含有待轉運至靶細胞群的所需分子的組合物的方法，該方法包括共價鍵或非共價鍵地結合所需分子與轉運蛋白。
本發明的進一步方面在於，提供編碼轉運蛋白和(任選)相關分子的核酸。例如，在其中轉運蛋白作為融合構建物表達的實施方案中，提供的核酸編碼轉運蛋白及其融合配偶體。
本發明的進一步方面在於提供這種表達載體它結合編碼轉運蛋白或其活性部分或其片段的核酸，和任選的編碼相關分子的核酸。
本發明的進一步方面在於提供用上述表達載體轉染的宿主細胞。
本發明的進一步方面在於提供轉運所需蛋白質或肽至靶細胞群的方法，該方法包括(ⅰ)用編碼轉運蛋白的核酸並任選地用編碼與轉運蛋白結合的蛋白質的核酸轉染、感染或其它方式引入靶細胞群的第一部分；(ⅱ)表達該核酸而產生蛋白質，隨後從細胞輸出該轉運蛋白，連同與之結合的其它任何蛋白質，由不直接產生該蛋白質的靶細胞群的第二部分攝取。
應懂得，可通過用重組病毒感染而實現靶細胞群第一部分的轉染。
本發明的進一步方面在於提供將所需分子轉運入細胞群的方法，該方法包括(ⅰ)將所需分子與轉運蛋白偶聯形成複合體；和(ⅱ)使細胞暴露於複合體中使細胞攝取該複合體。
在該方法中，將可以是非肽基的所需分子例如通過共價作用或摻合作用與轉運蛋白結合。
本發明的進一步方面在於提供上述轉運蛋白和載體以用於轉運分子的方法中。其中的方法指研究方法和治療方法。本發明特別適用於引導試劑至需要高效導向的細胞群的方法中，例如在基因治療方法中；癌的治療，例如可通過遞送腫瘤抑制劑至細胞。對圖的簡要描述

圖1示出表達VP22的COS-1細胞的免疫螢光。用VP22表達載體轉染生長於蓋玻片上的COS-1細胞。轉染40小時後，細胞於室溫下100％甲醇中被固定15分鐘，並與抗VP22單克隆抗體P43培養，接著與FITC-綴合次級抗體培養。然後用共焦顯微鏡檢術(confocal microscopy)分析這些細胞。(a)VP22表達細胞顯示的典型核定位。(b)存在於約5-10％表達細胞中VP22表達的胞質模式。(c)當表達量增加時觀測到的VP22定位模式。(d)VP22表達導致蛋白質被定位於單細胞層內每個細胞中。
圖2示出VP22在Vero細胞中的轉運。按對圖1那樣進行轉染和檢測，只是該實驗是在Vero細胞中進行的。該畫面示出處於中心細胞胞質內VP22的焦點和在周圍細胞中(它被定位於細胞核內)呈密度梯度。
圖3示出VP22表達的轉染時間過程，表明VP22在細胞之間被轉運。COS-1細胞被轉染並在轉染後14、20、26和38小時被固定。示出的共焦圖像表示在20hr時間點時放大20倍(a欄)和38hr時放大100倍(b欄)。
圖4示出VP22的蛋白質編碼序列，它是HSV-1 UL49基因的產物，該顯示△267突變體的截斷點；圖5(a)和(b)示出當含全長VP22和△267 VP22的提取物被加入胞外介質後進行的免疫螢光分析結果；和圖5(c)示出全長VP22和△267 VP22細胞提取物的蛋白質印跡；圖6示出應用於介質時VP22或其修飾物的輸入。
圖7a示出用β-gal的抗體染色後一個顯微注射細胞的視野的典型圖。
圖7b示出細胞的相同視野，其中VP22不但可見於顯微注射的細胞中，而且可見於周圍許多細胞中。
圖8a示出由T-抗原陽性COS細胞標記的混合細胞的典型視野。T-抗原抗體未檢測到周圍的BHK細胞；圖8b示出VP22陽性細胞，即見到中央COS細胞加上周圍的非轉染BHK細胞；圖9a示出將表達全長VP22的COS-1細胞對於VP22和DNA進行染色，並分析有絲分裂不同階段的細胞。為染色DNA，將碘化丙錠(propidium iodide)加到甘油固定物上，最終濃度為3μg/ml。示出代表前期、前中期和後期的細胞。
圖9b示出與末端標記的40bp寡核苷酸(T24)一起培養的增加量的GST和GST-VP22融合蛋白；採用凝膠移位分析法分析所得複合體。將VP22專一性複合體標記為1～3；和圖10示出用HSV-1[gH-ve]感染的Vero細胞。a表示對β-半乳糖苷酶染色而感染24小時後的視野。b示出對VP22染色後的相同視野。c示出對β-半乳糖苷酶染色而感染66小時後的視野。d示出對VP22染色後的相同視野。
原料和方法細胞和病毒。
HeLa(人上皮癌細胞)，COS-1細胞(由SV40 T-抗原轉化的猴腎成纖維細胞)，Vero細胞(猴腎成纖維細胞)和BHK(幼倉鼠細胞)均生長於含10％新生小牛血清的Dulbecco改進的極限必需介質中。
質粒。
受hCMV IE啟動子控制的真核表達載體pGE 109含VP22開放讀框，以前曾被描述過(4)。簡言之，該表達構建物是這樣製備的利用聚合酶鏈反應，以含BgⅢ或BamHⅠ限制酶切位點的接頭擴增VP22開放讀框，以便於後續在hCMV增強子/啟動子區控制下引入載體。
抗體。
這些實驗用到抗VP16單克隆抗體LP1和抗VP22單克隆抗體p43。p43抗體是通過單純皰疹病毒的毒粒蛋白製劑對小鼠免疫接種而產生的。對VP22有反應活性的多克隆抗體(AGV30)是通過用由與VP22開放讀框連接的穀胱甘肽S-轉移酶構成的融合蛋白對兔子免疫接種而產生的。該融合蛋白是這樣生成的通過得自pGE109的BglⅡ-BamHⅠ片段符合讀框插入可商購的(Pharmacia)細菌表達載體pGEX2T的BamHⅠ位點而產生載體pGST-VP22。往對數期培養物中加入IPTG(0.1mM)而引入含pGST-VP22的大腸桿菌(E.coli)株HB101，再過3小時後收集細胞。沉澱後，使細胞重懸浮於含0.5％NP-40的磷酸鹽緩衝鹽水，用Branson Ultra-sonic細胞勻漿器進行超聲處理，接著於4℃下在12000rpm時離心淨化20分鐘。然後通過在穀胱甘肽瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)上親和層析，在PBS 0.5％NP40中洗滌未結合的蛋白質，再用含5mM穀胱甘肽的10mM Tris-Hcl緩衝液(pH8.0)洗脫來純化GST-VP22融合蛋白。對3隻兔子中的每隻每隔4周注射一次(每次約50μg)該融合蛋白的佐劑溶液，並於總計17周後採集血清。
SDS-PAGE和蛋白質印跡。
通過用雙丙烯醯胺交聯的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離蛋白質。乾燥含放射性標記的樣品的凝膠並暴露於X光片。用於蛋白質印跡分析的凝膠被轉至硝酸纖維素濾器與合適的抗體反應。應用辣根過氧化物酶連接的次級偶聯物，以3,3′-二氨基聯苯胺四鹽酸二水合物(DAB)或以增強的化學螢光顯影可見到活性帶。
轉染和免疫螢光。
轉染前那天將細胞置於6孔盤(6×35mm)，每孔配有一個蓋玻片，密度為每孔2×105個細胞。用pUC19 DNA將500ng表達質粒配成2μg而進行DNA轉染，利用磷酸鈣沉澱法，其中以BES[N,N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸]緩中鹽水代替以前描述的HEPES緩衝鹽水作出修改(3,5)。轉染40小時後於室溫下在100％甲醇中固定細胞達15分鐘，然後用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。轉染時，將蓋玻片上的細胞在室溫下與PBS/10％小牛血清培養15分鐘而封阻細胞。往此同一溶液(p43在1∶100的稀釋度下)中加入初級抗體並於室溫下培養20分鐘。用PBS充分洗滌後，將次級抗體(FITC偶聯的抗小鼠IgM和/或Texas Red(德克薩斯紅)偶聯的抗兔IgG)加入PBS/10％小牛血清並培養10分鐘。再用PBS充分洗滌，然後使蓋玻片在甘油中固定，應用Biorad MRC600共焦顯微鏡在雙通道中檢驗。利用普通光學顯微鏡拍下相差照片。
結果VP22定位於兩個不同的模式中。
是這樣研究VP22的細胞定位的先應用抗VP22單克隆P43進行VP22表達細胞的免疫螢光分析，接著通過共焦顯微鏡檢術分析。依上述方法轉染COS細胞，然後使細胞在甲醇中固定30～40小時並加工處理以檢測VP22。初始結果表明，在大部分含VP22的細胞中，蛋白質存在於獨特的核模式中，往往表現出在核邊緣富集。圖1a表示VP22的核模式的典型實例。但在一些細胞中，VP22呈完全不同的胞質的纖維狀模式(圖1b)。此時，檢測到的蛋白質在胞質內呈網絡狀或籠形模式並被排除在細胞核外。這種分布不均一性雖然其自身並非異常，但對於本研究的其它HSV殼蛋白(VP16)未觀察到該不均一性，它呈現的模式因細胞不同而略有不同，主要包括擴散胞質模式，少量存在於細胞核內。
進一步研究表明，VP22的胞質分布與核分布相互間不是無規的，即含胞質VP22的中心細胞周圍被含核VP22的細胞暈圈環繞，後者細胞區中明顯地富含該蛋白質，這些細胞毗鄰含胞質VP22的中心細胞(圖1c)。最後，單細胞層區(其中每個細胞中可檢測到VP22)也呈現這種分布，在少量細胞中觀察到胞質模式，在周圍細胞中觀察到核模式(圖1d)。
最初是在COS細胞內進行這些實驗的，它依靠SV40T-抗原複製本文所用的VP22表達質粒。儘管我們對於相同載體表達的其它蛋白質(例如前述VP16)未檢測到這種分布，但我們希望排除這種可能性即VP22分布模式與COS細胞的應用有關。於是用Vero細胞和HeLa細胞進行了同樣實驗，並得出完全相同的結果。圖2示出VP22在Vero細胞中的表達呈上述模式，其中含胞質VP22的中心細胞周圍被含核VP22的細胞環繞。此時，可見VP22呈遞降的密度梯度，從中心細胞至毗鄰細胞具有稠密的核VP22，而相距更遠的細胞核VP22密度更小。
這些意外結果指出，VP22從最初在其中合成並呈胞質形式的細胞中被轉運至毗鄰細胞，也被轉運至再一次轉移的細胞，其中它定位於細胞核。為了闡述VP22在細胞間的移動，研究了轉染的時間過程。轉染14小時後，可以在各個細胞中檢測到VP22表達。在20小時，可見到含VP22的細胞灶，其中含稠密的VP22的中心細胞周圍環繞數個含更低密度的VP22的細胞(圖3a，較低的放大倍數以利於看清點的分布)，而38小時後實際上每個細胞中都含該蛋白質(圖3b)。
作為VP22在細胞間被轉運的另一個證據，用VP22表達載體，和pRG50(一種VP16表達載體)轉染獨立的兩皿COS-1細胞。24小時後，每皿細胞用胰蛋白酶消化，再將兩組細胞群混合後固定於蓋玻片上。24小時後，可能檢測VP16表達細胞，其細胞核內也含有VP22，這表明從未暴露於VP22表達載體的細胞已攝取VP22蛋白。
胞間轉運需要VP22內的C端決定子。
為開始鑑定VP22內的需要，我們測試了含短鏈(3-4個胺基酸)的符合讀框的插入物的一組變體和缺殘基267至該蛋白末端(殘基301)的缺失突變體。插入突變體在位置60、159、192和267上含插入物。在插入突變體Ins60、Ins159或Ins267中，任何一個都不影響VP22定位的模式或者其進行胞間轉運的能力(數據未顯示，均與野生型相同)。然而在位置192上的插入具有顯著影響。該突變體表現的分布模式類似於從野生型見到的胞質分布；於是，未觀測到毗鄰細胞中的核染色，總體觀測到更少的陽性細胞，而且在VP22陽性細胞中模式全是胞質的(圖3c)。
對於缺乏C端34個殘基267-301的缺失突變體觀測到完全相同的表型(圖3d)。應注意在位置267上的插入突變體是正常的。分布模式顯示全為胞質VP22和267-301缺失突變體和插入突變體192沒有轉運至周圍細胞，這並非由於無效合成。當用蛋白質印跡比較總的合成時，觀測到相似量的w/t和突變型蛋白質。
為開始提出這種可能性，即胞間轉運性能可用於轉運其它肽或蛋白質，我們測試了VP22的一種變體(VP22ep)是否也能被轉運，該變體在其C端末端含12個殘基延伸(它含有單克隆抗體識別位點)。結果表明，該延伸蛋白被有效地轉運。事實上，闡述Vero細胞中轉運的圖3b用到該C端延伸變體。如上所述，含中心胞質VP22ep的細胞灶周圍環繞含核VP22ep的細胞，而且，至於w/t蛋白質，其實可在單細胞層的每個細胞中檢測到VP22的表達。此外，被檢測到的蛋白質就是融合蛋白，而不是某些偶然的缺失產物，因為它可用抗VP22抗體p43或C端肽延伸的抗體檢測。這一重要結果表明，確實可以通過將肽或蛋白質與合適的轉運蛋白如VP22連接而促使它們遞送至細胞。
本領域技術人員可以慣常地應用這些或者其它定點誘變方法來定位或精修對於轉運性能至關重要和/或重要的VP22中決定子，因而能夠應用VP22片段而不是全長蛋白質。
從介質攝取VP22。
雖然在細胞表面易於檢測VP22，但我們還不能檢測已轉染細胞的介質中的VP22。然而為檢驗VP22被從胞外介質輸入的能力，將從VP22表達細胞製備的可溶性提取物加入未轉染細胞介質。VP22被高效和迅速地輸入並定位於細胞核(見圖5(a))，加入介質後5分鐘內被攝取(可解釋我們未能在介質中檢測它)。攝取機理不受4℃下培養作用的影響，說明不是通過正常的胞吞作用內在化。在對照實驗中，對於所試驗的其它任何蛋白質均未觀測到從介質攝取。
將含全長(WT)或者截短(△267)VP22的可溶性提取物加入覆蓋蓋玻片上生長的COS-1細胞的介質，1小時後固定細胞。還通過SDS-PAGE和蛋白質印跡法分析等量的提取物。
為製備可溶性提取物，用全長或△267 VP22表達載體轉染一百萬個COS-1細胞，16小時後收集細胞，將提取物調和於10mMHEPES(pH7.9)、400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT和5％甘油中。然後將一半提取物加入覆蓋生長於蓋玻片上5×105個COS-1細胞的介質，1小時後固定細胞，利用多克隆抗VP22抗體進行免疫螢光分析(見圖5(a)和5(b))。分析1/10的所述提取物是在10％丙烯醯胺凝膠上進行電泳，接著用單克隆抗體P43進行蛋白質印跡分析(見圖5(c))。
此外，雖然在可溶性提取物中存在與全長VP22等量的VP22缺失突變體△267(見圖5(c)，△267)，但在細胞間未檢測出，表明該過程需要C端34個殘基(圖5(b))。
為了進一步研究，我們製備了相應於該C端34個殘基的肽並續上一個12個殘基的標記以便於免疫檢測。將此肽應用於細胞介質後，它可進入細胞並被轉運至細胞核(圖6b)。這些實驗表明，這些C端34個殘基是a)所需的和b)足以引起轉運。
轉運融合蛋白雖然如上所述，我們已闡明可將肽融合至VP22而轉運，但尚不知道多大的蛋白質可與VP22融合以便利轉運。
用質粒pGE109、△267或VP22-GFP轉染6mm皿中的COS-1細胞，VP22-GFP的構建是將UL49開放讀框插入質粒pGFP-N1(Clontech)的BamH1位點，得到VP22與綠螢光蛋白(GFP)的N端的融合體。轉染40小時後收集細胞，製備高含鹽量提取物。這些提取物的蛋白質印跡表明，雖然提取物中存在等量的全長VP22和VP22的△267變體，但22-GFP蛋白質的含量約小5倍。將等量的各提取物加入覆蓋蓋玻片上COS-1細胞的介質，放置1小時，然後在100％甲醇中固定。用AGV30進行免疫螢光分析。結果示出(圖6a)，可在受體細胞中檢測到VP22-GFP融合蛋白，而且它已積累於細胞核內。
總之，我們已證實能獲得表達融合蛋白的細胞提取物，其中連接的蛋白質是32Kda，而且將該提取物應用於細胞介質後，可檢測細胞核內的融合蛋白。
顯微注射VP22雖然通過轉染而轉運適用於組織培養應用中，但在組織或病人中遞送可能不是真正有效的途徑。
顯微注射(還有脂質體遞送)被用於活體內且它還適用於闡述通過活體內實用的遞送途徑的VP22轉運。
用100ng/μl pGE109和100ng/μl pBAG混合物作為注射細胞用的標記物(PNAS 84:156-160)顯微注射鋪板於蓋玻片上的COS-1細胞，應用Carl Zeiss半自動手工操作型顯微注射器。將細胞培養24小時，於100％甲醇中固定，應用多克隆抗VP22抗體AGV30(1∶500)和單克隆抗β-半乳糖苷酶(1∶50)(Promega)進行雙免疫螢光分析。圖7a示出用β-gal的抗體染色的一個顯微注射細胞視野的代表圖。在這些細胞的相同視野內，不但在顯微注射細胞內而且在很多非注射細胞內可見到VP22(圖7b)。因此，該遞送途徑可用於活體內通過顯微注入例如腫瘤中心以遞送VP22或其變體。當然，其它遞送途徑也同樣可行，這裡只是闡述一種直接途徑。目前，應用兩種主要途徑遞送基因，即脂質體介導的感染和病毒感染。因此，可以把VP22或各種修飾物(包括融合蛋白)的基因摻入脂質體載體供活體內遞送。同樣，脂質體遞送也可用於組織培養系統。也可將VP22或其變體的基因插入例如腺病毒或逆轉錄病毒的基因組以傳遞感染。在兩種情況下，將在初始轉染或感染細胞群中表達，但VP22將被遞送至周圍細胞內。這特別適用於通過設計成不複製的缺損病毒載體(disabled virus vectors)的遞送。該場合的遞送將會增強。直接顯微注射基因或者直接應用裸DNA也是本領域中正在研究的方法。
轉運VP22至不同種細胞我們已進一步證實了VP22可從初始表達它的細胞被轉運至不同種細胞。
用被PUC19 DNA從1μg配成4μg的pGE109轉染60mm板中的COS-1細胞。轉染24小時後用胰蛋白酶消化除去細胞，再與先被胰蛋白酶消化的BHK-21細胞(倉鼠)以1∶20的比率混合。將該細胞混合物鋪板於6孔板中的蓋玻片上，再進一步培養20小時，然後在100％甲醇中固定。應用AGV30(1∶500)和單克隆抗T抗原pAB419(純淨的)進行雙免疫螢光分析以鑑定COS-1細胞(J.Vi-rol.39:861-869)。
圖8示出混合細胞的典型視野，其中可見T抗原陽性COS細胞(圖6a，左邊欄)，周圍的BHK細胞當然未被T抗原抗體檢測到)，而在圖8b右邊欄中是VP22陽性細胞，即中心COS細胞和周圍的未轉染BHK細胞均可見。
VP22的DNA結合性能我們已證實，在VP22在核內的細胞中，它在有絲分裂期間與濃縮染色體結合。這表明有絲分裂期間與染色體的強烈結合，且說明一旦VP22或其變體被攝入細胞，它們也在分裂後被傳給子細胞。這性能使VP22更適用於遞送。此外我們已證實，在體外，VP22具有非專一性DNA結合性能，這可能(至少部分地)解釋活體內染色質結合。綜合這兩種現象得知VP22有可能結合DNA和遞送DNA/基因至細胞核。
分析期間我們發現，一部分核內含VP22的細胞中該蛋白質的模式類似於有絲分裂染色質的模式。對VP22和DNA的細胞雙染色表明，對於有絲分裂各階段的細胞均可檢測出VP22定位於濃縮染色體周圍(圖9a)。為測定VP22是否能與DNA直接作用，我們通過凝膠阻滯分析測試了GST-VP22融合蛋白結合40bp寡核苷酸探針的能力。對於GST-VP22觀測到3種複合體的出現隨劑量增大而增強(圖9b)，在GST對照組中未存在該現象。尺寸更大的複合體可能表示該蛋白質的多聚化，因為所形成的最大一個對於更短的探針結合效果差(未顯示)。此外，VP22能結合一系列DNA探針，說明該蛋白質與DNA以非專一性方式作用。
VP22在病毒感染的細胞內轉運基因治療中遞送基因的主要途徑之一是應用病毒來進行。這類病毒一般在某些方面無功效以至它們低效複製或完全不能複製。希望限制複製以防止病理方面的併發症。病毒載體的安全性是基因治療中的主要問題，研究人員作出很大努力試圖開發嚴格缺損的病毒。但應用缺損病毒的缺點在於目的基因只能被遞送至初始感染的細胞。
我們意在直接證實VP22可從病毒感染的細胞被轉運至未感染的細胞。為此，我們用缺損的單純皰疹病毒突變體HSV-1[gH-ve]感染細胞。該病毒缺乏病毒糖蛋白gH必需的基因，且必需在含gH的特化互補細胞系上繁殖。但當該病毒感染非互補細胞(即不含病毒gH的任何細胞類型)時，該病毒能滲入初始細胞群、合成病毒蛋白(gH除外)和裝配病毒粒子，但這些都是非感染性的。未發生第二輪感染。我們想證實VP22可從初始用HSV-1[gH-ve]病毒突變體感染的細胞轉運(Desai,P.J.等，J Gen Virol 69(pt 6):1147-56(1988)；Forrester,A.等，J Virol 66:341-8(1992)U.Gompels A.Minson Virology 153:230-47(1986))。在大約0.2pfu/細胞的感染複數下用HSV-1[gH-ve]感染Vero細胞。因而大約5個細胞中有一個開始時將被感染。感染24或66小時後使細胞在甲醇中固定，再估測VP22或β-半乳糖苷酶的存在。應注意，該病毒含β-半乳糖苷酶的基因，而且存在的β-半乳糖苷酶用作初級感染細胞的標記物。結果示於圖10。
圖10a示出對β-半乳糖苷酶染色、感染24小時後的視野。
圖10b示出對VP22染色的相同視野。
圖10c示出對β-半乳糖苷酶染色、感染66小時後的視野。
圖10d示出對VP22染色的相同視野。
圖10a中用箭頭標出了表達β-半乳糖苷酶的兩個細胞。注意周圍的細胞缺乏β-半乳糖苷酶。在對VP22染色的相同視野(圖10)中，這兩個細胞也是VP22陽性的(大箭頭)，但還檢測到幾個周圍細胞含VP22(小箭頭)，它們是β-半乳糖苷酶陰性的。
在圖10c(感染66小時後)中示出的3個細胞也是β-半乳糖苷酶陽性的(大箭頭)。在對VP22染色的相同視野(圖10d)中，這3個細胞是陽性的，但周圍其它細胞是β-半乳糖苷酶陰性的因而未感染，不過含有VP22，它已積聚於細胞核內(小箭頭)。注意儘管在3個中心陽性細胞中濃染色，最後的這些細胞完全缺乏可檢測的β-半乳糖苷酶。
結果表明，VP22可從病毒感染細胞轉運。這不只是瘡疹病毒感染的性質，因為VP22可從轉染的細胞或顯微注射的細胞轉運。因此，轉運不需其它任何瘡疹病毒編碼的蛋白質，於是應用任何病毒載體如腺病毒或逆轉錄病毒都幾乎肯定會發生轉運。
這樣我們直接證實了VP22從病毒感染細胞轉運的原理依據。很容易預測，含目的基因的融合蛋白可通過與VP22的基因或其活性部分連接而被構建，並在基本上有效的或組織專一性的啟動子控制下被插入病毒載體。隨後該融合蛋白可被遞送至比初始感染的細胞群要大得多的細胞群。
討論上還結果表明，VP22表現出相當獨特的性能，因為它被有效地從初始表達它、而且它在其中表現為胞質定位的細胞轉運至細胞單層中毗鄰細胞，在那裡它被細胞核攝取。在我們試驗過的一系列蛋白質中，對於其它任何蛋白質均未觀測到這種行為模式，而且以前從未闡述過這種活性。於是，例如VP16也是在細胞胞質中表達的，但它的表達模式在表達細胞群中是完全均勻的，而且它未被轉運至毗鄰細胞。這種差異和VP22的這種意外的性能從如下結果得以證實即，當VP22或VP16被引入細胞單層大約30小時後，雖然VP16能在平均約2-5％的細胞中被檢測到，但VP22能在單層的每個細胞中被檢測到。
本工作還證明了VP22胞間轉運的專一性，並證明了該蛋白質C端包含一個決定子，因為缺乏C端34個胺基酸的變體雖然在初始表達細胞內胞質定位中被表達，但未被轉運至毗鄰細胞。這些實驗表明，VP22的胞間轉運可在一些不同種細胞包括COS-1細胞、Vero細胞和HeLa細胞中進行，即該現象對其中最初觀察到該現象的COS細胞不具有專一性。
蛋白質分泌或外排通常經過特定途徑發生，要求完全鑑定的信號序列以分選入外排途徑中包括的區室和載體。在蛋白質分泌的主要機制之一中，信號序列通常殘留於蛋白質的N端末端，被7S RNA和至少6個多肽的複合體識別，其中複合體的組分一起包括信號識別顆粒(SRP)。由SRP識別後接著在內質膜中停靠和將信號肽傳遞給受體。然後該出現的多肽通過ER膜排出，接著通過在Golgi網絡中相互作用和小泡裝配的複雜網絡進行處理。VP22不具備任何慣常的信號序列，而且它在胞質內的分布模式與ER分布或Golgi分布不相似。
已有少量有關哺乳動物蛋白質通過非經典途徑分泌的現有實例，例如包括細胞因子白細胞介素1α和1β，以及鹼性和酸性成纖維細胞生長因子(7)。輸出這類成分的一種可能性是通過ABC-轉運蛋白系統。這些蛋白質包括依賴於ATP的蛋白質和膜結合蛋白質，它們含跨膜螺旋。它們包括於蛋白質專一性結合中和轉運穿過膜並在細菌系統中已被最完全鑑定。然而，迄今尚無有關任意哺乳動物ABC-轉運蛋白在蛋白質分泌中的作用的直接證據。
還有，雖然某些蛋白質是通過非經典途徑被分泌的，但VP22分泌的模式極為獨特。由於不想受任何具體理論的束縛，對於我們的結果的最簡單解釋是這樣的VP22被分泌後就被靶細胞的核攝取並在其中濃縮。又一次地，雖然該蛋白質的預計分子量為32k，但VP22中沒有明顯的核定位信號，所以它無需專門的信號就能進入細胞核。對於VP22內所需決定子和細胞內生理需求的進一步研究將會有助於闡明所包括的途徑，而對於VP22如何被分泌的理解將有助於理解其它蛋白質在非經典輸出途徑中是如何被轉運的。
這些結果揭示了有可能應用VP22轉運中涉及的決定子來使其它蛋白質或與VP22決定子相關的其他分子在靶細胞群中被轉運、有效表達或攝取。我們業已證實，短肽(12個殘基)可與VP22連接且該融合蛋白仍能被轉運至單層的每個細胞中。該結果表明，確實易於通過將肽與VP22連接而促使肽的傳遞。
此外，我們已證實大型蛋白質(32Kd)與VP22連接後可從細胞介質被輸入細胞，並看到它在細胞核內積聚。
容易預測這種能力的廣泛應用。例如有可能將DNA結合蛋白質與VP22決定子連接，使得當遞送至靶細胞群後，它們將在大得多的細胞群中被有效地表達。
其它應用包括宿主加強免疫響應需要共同刺激分子和細胞因子疫苗開發領域的近期資料著重於對共同刺激分子和細胞因子的需求，以使疫苗有效地作用以加強細胞水平的宿主免疫響應。腫瘤細胞不在其細胞表面表達共同刺激分子，這就是為什麼在宿主中沒有CTL(細胞毒性T細胞)的克隆擴充的原因，導致病人沒有藥物介入就不能使腫瘤收縮。
直接刺激宿主中的細胞毒性T細胞響應遞送具有抗癌性能的外源蛋白至細胞核。外源蛋白可能是已知能引起對腫瘤的免疫(T細胞)響應的腫瘤特異抗原。
該外源蛋白可與VP22分子一起直接遞送至細胞核(這也會模擬病毒感染-見注釋)。然後該外源蛋白在細胞的蛋白體中會斷裂成肽。如果接著進行經典的T細胞引入途徑，則肽被導向通過細胞的ER和高爾基體並與MHC-Ⅰ型分子結合呈現於細胞表面。加強病人中CTL響應對於非癌治療，尤其是由病毒感染引起的疾病有顯著作用。認為在宿主中引起強烈的CTL響應可導致體內病毒的消除，近期已獲得科學證據。
用待導向的蛋白質/抗原加強遞送MHC分子的免疫響應有可能通過導向抗原加HLA分子來解決細胞群中MHC限制性並加強細胞的響應的問題。該應用也會具有非癌用途。
信號轉導途徑的調節很多信號轉導途徑是通過如下方法進行的轉移環境信號、激素、將配體與膜結合、脅迫(DNA損傷、熱滲透的等等)細胞核以引起基因表達變化。可以通過將蛋白質或肽與信號分子偶合而應用VP22介導這種信號。遞送融合蛋白或相應基因將會增強信號，因為融合體也是輸出至相鄰細胞。例如，將VP22與質膜相關性信號效應子的顯性突變體(例如小GTP酶及其效應子或編程性細胞死亡(apoptotic)調節分子)融合可能實現所需途徑，不但可在存在該基因的受體細胞內實現，還能在沒有該基因的周圍細胞中實現。可設想調節信號轉導途徑的多種變化形式。
VP22在體外與DNA結合的能力和VP22在有絲分裂期間與濃縮染色體結合的能力可應用於基因/DNA治療。該應用有如下幾種形式
a)病毒感染，其中VP22或其突變體的基因被插入腺病毒或逆轉錄病毒的基因組以傳遞感染。同樣，也可插入所需蛋白質的基因從而可表達包括VP22和目的蛋白質的融合蛋白。然後VP22就能遞送目的蛋白質至周圍細胞群。這樣，可使這類病毒的量減少因而降低病毒感染的危害。
b)將編碼VP22(或其變體)的核酸和目的蛋白質直接顯微注入細胞，於是一旦表達，VP22就能將目的蛋白質轉運入周圍細胞群。
c)脂質體介導的感染，其中VP22的基因或包括融合蛋白的各種修飾物被摻入脂質體載體以供活體內遞送。
對技術人員而言，將DNA引入細胞的其它方法是顯而易見的，例如，直接劃痕(direct scarification)，其中DNA直接被組織攝取；受體介導的DNA轉化；磷酸鈣介導的轉染；和彈道式遞送(ballistic de-livery)。
有效遞送功能分子是基因/蛋白質治療中所期望的。該機制的另外優點在於，表達VP22的基因將只存在於小群細胞中，而蛋白質存在於大得多的細胞群內。當需要考慮遞送基因的可能有害效果時，這將是有用的因素。低基因遞送量同時保持較大功能性蛋白遞送量是所期望的。實際上可預測，需要或者希望有效表達試驗蛋白質的任何應用都可運用VP22遞送機制。遞送腫瘤抑制蛋白、酶等等。我們還已證實有可能將核酸與VP22結合，因此，除了DNA之外也可以遞送反義RNA核酸等等。參考文獻1．Blaho,J.A.,C.Mitchell，和B.Roizman.1994.由單純瘡疹病毒1α調節蛋白0、4、22和27共享的胺基酸序列預示UL21、UL31、UL47和UL49基因產物的核苷醯化(nucleotidylylation)。J.Biol Chem269:17401-10。2．Blair,E.D.，和R.W.Honess.1983.由herpes virus saimiri專一化的DNA結合蛋白。J.Gen.Virol.64:2697-2715。3．Chen,C.，和H.Okayama.1987.用質粒DNA高效轉化哺乳動物細胞。Mol.Cell Biol.7:2745-2752。4．Elliott,G.D.，和D.M.Meredith.1992。由基因UL49編碼單純瘡疹病毒-1型殼蛋白VP22。J.Gen．Virol.73:723-6。5．Greaves,R.F.，和P.OHare.1990。對於同細胞八聚體結合蛋白序列和靶TAATGARAT序列作用的單純瘡疹病毒-1型反式激活蛋白Vmw65的結構要求。J.Virol.64:2716-2724。6．Haarr,L.，和S.Skulstad.1994。單純瘡疹病毒-1型粒子結構和分子功能。論文綜述。Apmis 102:321-46。7．Klucher,K.1993.蛋白質分泌的獨特途徑簡易分泌方式。Trendsin Cell Biol.3:421-426。8．Knopf,K.W.，和H.C.Kaerner.1980.與單純瘡疹病毒-1型(HSV-1)粒子結合的病毒特異性鹼性磷蛋白和HSV-1感染的細胞的染色質。J.Gen.Virol.46:405-414。9．Meredith,D.M.,J.A.Lindsay,I.W.Halliburton，和G.R.Whit-taker。1991.通過糖基化作用和磷酸化作用對單純瘡疹病毒-1型的殼蛋白(VP13和VP14)的翻譯後修飾。J.Gen.Virol.72:2771-5。10．Pinard,M.F.,R.Simard，和V.Bibor-Hardy.1987.單純瘡疹病毒-1型感染的BHK細胞核基質的DNA結合蛋白。J.Gen.Virol.68:727-35。11．Preston,C.M.，和E.L.Notarianni.1983.單純瘡疹病毒立即早期多肽的聚(ADP-核糖基)化作用。Virol.131:492-501。12．Rothman,J.E.1994。胞內蛋白質轉運的機制。Nature.372:55-63。
權利要求
1．VP22或者其活性部分、片段或同源物作為能被靶細胞群攝取的轉運蛋白的應用。
2．權利要求1的應用，其中轉運蛋白至少包括VP22的C端34個胺基酸。
3．權利要求1或權利要求2的應用，其中轉運蛋白與一個或多個需要轉運至靶細胞群的其它分子結合。
4．權利要求3的應用，其中的一個或多個相關分子是非肽基分子。
5．前述權利要求任一項的應用，其中的蛋白質還能從表達它的靶細胞群的第一部分輸出，並被不直接產生該蛋白質的靶細胞群的第二部分攝取。
6．轉運蛋白質，它包括VP22或者其活性部分、片段或同源物，該蛋白質結合需要轉運至靶細胞群的一個或多個其它分子。
7．權利要求6的轉運蛋白，其中的一個或多個相關分子是非肽基分子。
8．權利要求6或權利要求7的轉運蛋白，其中的蛋白質還能從表達它的靶細胞群的第一部分輸出，並被不直接產生該蛋白質的靶細胞群的第二部分攝取。
9．核酸，它編碼權利要求6、7和8中任一項的轉運蛋白。
10．表達載體，它包括權利要求9的核酸。
11．哺乳動物或微生物宿主細胞，它包括權利要求10的載體或權利要求9的核酸。
12．轉運所需蛋白質或肽至靶細胞群的方法，該方法包括ⅰ)將權利要求9或權利要求10的核酸或載體引入靶細胞群的第一部分；ⅱ)表達該核酸而產生蛋白質，隨後從細胞中輸出該轉運蛋白，連同與之結合的其它任何蛋白質，而被不直接產生該蛋白質的靶細胞群的第二部分攝取。
13．權利要求12的方法，其中通過重組病毒將核酸引入靶細胞群的第一部分。
14．權利要求12的方法，其中通過轉染將核酸引入靶細胞群的第一部分。
15．權利要求12的方法，其中通過顯微注射將核酸引入靶細胞群的第一部分。
16．將所需分子轉運至細胞群的方法，該方法包括ⅰ)將所需分子與包括VP22或其活性部分、片段或同源物的轉運蛋白偶聯而形成複合體；和，ⅱ)使細胞與該複合體接觸使細胞能攝取該複合體。
17．權利要求16的方法，其中所需的分子是非肽基分子。
18．權利要求16或權利要求17的方法，其中通過摻入脂質基載體而將所需分子與轉運蛋白偶聯。
全文摘要
本發明涉及轉運蛋白,具體涉及VP22及其同源物,並涉及遞送這些蛋白質和任何結合的分子至靶細胞群的方法。該轉運蛋白可應用於基因治療和引導試劑至需要高效導向的細胞的方法。
文檔編號C12N15/38GK1208438SQ9619584
公開日1999年2月17日 申請日期1996年7月25日 優先權日1995年7月28日
發明者P·F·J·奧黑爾, G·D·埃利奧特 申請人:瑪麗·柯裡癌症治療中心