一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法
2023-05-25 04:46:11 1
專利名稱：一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，具體的說涉及一種誘導蟲草屬真菌大量產生金屬硫蛋白，以蟲草屬真菌菌絲體為原料大量生產金屬硫蛋白的方法。
背景技術：
1957年Margoshes和Vallee在馬的腎臟裡發現一種富含CcUZn的低分子量蛋白質，隨後Kagl和Vallee將其提純，並命名為金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)。MT廣泛存在於生物界裡，動物體內的MT主要在肝臟中合成，在血液、腎臟中存在。金屬硫蛋白是一種分子量較小(6000 7000)、富含半胱氨酸的非酶蛋白質，其內含有Cd、Cu、Zn、Hg、Au等元素，不含芳香族胺基酸及組氨酸殘基。具有以下特徵分子量低；含30%半胱氨酸且無芳香族胺基酸；巰基與金屬比例為3 1或2 1、4 1 ；金屬含量高，每mol含6個金屬原子。近年來研究發現，金屬硫蛋白有許多生物功能，如可以清除體內自由基，其清除自由基的能力是SOD和穀胱甘肽(GSH)的10000倍；能解除重金屬毒素，可以與鉛、砷、汞等有毒金屬緊密結合，解除重金屬毒素，是目前臨床最理想的生物解毒劑；能抗輻射和紫外線照射，MT含量豐富的細胞組織，可抵抗離輻射或紫外線引起的細胞組織損傷；能參與體內微量元素代謝，可根據體內微量元素狀況，自動釋放出金屬離子，補充體內所缺元素，調節體內微量元素平衡，增強體質；還能防止細胞癌變，可消除自由基、重金屬，從而防止它們致癌、致突變作用，可以幫助維持細胞正常代謝和分裂，激發人體免疫功能，增強肌體的防癌抗癌作用等。隨著對金屬硫蛋白結構、功能等研究的深入，其用途日益廣泛，對其需求量越來越大。目前已有許多金屬硫蛋白生產方法的報導，大部分生產方法是通過某種重金屬誘導某種普遍飼養的動物(如家兔、豬等)產生MT，然後採用相應的理化技術從該動物臟器中分離純化得到MT製品。這種誘導動物生產MT的方法有如下缺點飼養動物容易受到自然條件和規模的制約；動物來源的生化製品有傳染疾病的潛在隱患。所以迄今為止一直缺乏一種高產量、低成本、安全性高、適宜於規模化生產MT的技術和方法。
發明內容
本發明的目的在於克服上述已有技術的不足而提供一種操作簡單，生產周期短， 菌絲體或子實體中MT產率高，可以進行工廠化生產的蟲草金屬硫蛋白的生產方法。本發明可以通過蟲草屬真菌人工培養過程中添加一定量的硫酸鋅，誘導蟲草菌大量產生金屬硫蛋白。工藝過程為蟲草菌一液體培養(添加硫酸鋅誘導)一菌絲體過濾一富含金屬硫蛋白的菌絲體 —加緩衝液、研磨破碎細胞一加有機變性、攪拌，雜蛋白變性一離心去除雜蛋白一清夜加熱變性一離心去除變性蛋白一迅速冷卻至室溫一超濾濃縮一濃縮液一G-50層析一巰基試劑法監測收集MT洗脫液一MT洗脫液真空冷凍乾燥一MT凍乾粉。
本發明的目的可以通過如下措施來達到一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其特徵在於其具體步驟為(1)培養蟲草屬真菌菌絲體將蟲草屬真菌進行試管斜面菌種培養(活化)、三角瓶液體種子培養、種子罐培養及發酵罐培養，發酵罐培養步驟的培養基為每升培養液中葡萄糖10-50g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，硫酸鋅5-20g，pH值為5. 0-7. 0 ；發酵罐投料體積60%-80%，接種重量5-10%，溫度20 30°C，通氣1 0. 3 0. 8，攪拌轉速80 150rpm，培養至菌絲體收得率大於等於1. 2 %，培養基還原糖含量小於等於0. 2 %時，放罐收穫菌絲體；(2)板框過濾將培養好的蟲草屬真菌菌絲體以板框過濾機過濾，經過板框過濾後取出菌絲體，得到的菌絲體可以用於金屬硫蛋白的提取；(3)研磨使細胞破碎，雜蛋白變性將上述菌絲體中加入相當於菌絲體重量1. 5 3倍的0. 05mol/LTris (三羥甲基氨基甲烷)-HC1，pH 8. 6，用研磨機研磨、勻漿，至細胞破碎後，加入與菌絲體和Tris (三羥甲基氨基甲烷)_HC1等重量的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的體積比為0.08 1，變性除雜蛋白，攪拌約5 IOmin ；將細胞破碎液於5000 lOOOOr/min離心，棄沉澱，得上清液；上清液80 90°C 熱變性5-lOmin，沉澱雜蛋白，靜置0. 5h以上，8000r/min以上離心棄沉澱，得上清液，為MT 的粗提液；粗提液以截留分子量小於2000的膜超濾濃縮，得濃縮液；(4)柱層析將上述的MT的提取液的濃縮液採用葡聚糖凝膠G-50進行柱層析分離，以去離子水洗脫，在254nm檢測洗脫液的吸收峰，吸收峰部分輔助以巰基試劑法監測， 收集巰基試劑法監測到的最大吸收峰，即為金屬硫蛋白部分；將柱層析得到的MT收集液冷凍乾燥，得到蟲草金屬硫蛋白凍乾粉。為了進一步實現本發明的目的，所述的試管斜面菌種培養(活化)步驟配製培養基每升培養液中葡萄糖5-25g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，瓊脂粉10-20g，調pH值為5. 0-7. 0，分裝於試管中，滅菌，製成斜面；將蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15 30 °C培養5-10天。為了進一步實現本發明的目的，所述的三角瓶液體種子培養步驟配製培養基 每升培養液中葡萄糖10_20g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，pH值為5. 0-7. 0，將配製好的培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口後在120 130°C條件下滅菌18 30 分鐘，取出培養基，自然冷卻至20 30°C ；在無菌條件下每瓶接入黃豆粒大小的斜面培養物1-2塊，15 30°C，搖床轉速120rpm，培養5天 10天。為了進一步實現本發明的目的，所述的種子罐培養步驟配製培養基每升培養液中葡萄糖10_20g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，pH值為5. 0-7.0，投料體積 60 % -80 %，分批滅菌，接入培養好的三角瓶液體菌種，接種量2-10 %，培養溫度15 30°C，通氣1 0. 5，攪拌轉速120rpm，在種子罐中15 30°C培養2-5天，至菌絲體收得率 0. 4-0. 8% (幹計)。本發明同已有技術相比可產生如下積極效果和顯著的進步申請人通過對蟲草屬真菌多年的基礎研究，發現了蟲草屬真菌產生金屬硫蛋白的高能力，可以解決金屬硫蛋白產生源的問題。本發明生產周期短，金屬硫蛋白產率高，生產成本低的優點。
具體實施例方式下面對本發明的具體實施方式
作詳細說明實施例1 菌種蛹蟲草(Cordyc印s militaris (L. ) Link)菌種來源於中國林業微生物菌種保藏管理中心，編號Cfcc 5974。試管斜面菌種培養(活化)配製培養基每升培養液中葡萄糖25g，蛋白腖5g，酵母提取物lg，瓊脂粉15g， 調PH值為7. 0，分裝於試管中，滅菌，製成斜面；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面， 25°C培養7天。三角瓶液體種子培養配製培養基每升培養液中葡萄糖20g，蛋白腖5g，酵母提取物lg，pH值為7.0， 將配製好的培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口後在121°C條件下滅菌20 分鐘，取出培養基，自然冷卻至30°C ；在無菌條件下每瓶接入黃豆粒大小的斜面培養物1-2 塊，30 0C，搖床轉速120rpm，培養5天。種子罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖20g，蛋白腖5g，酵母提取物lg，pH值為7.0， 投料體積80%，分批滅菌，接入培養好的三角瓶液體菌種，接種重量5%，培養溫度25°C，通氣1 0.5，攪拌轉速120rpm，在種子罐中15 30°C培養2天，至菌絲體收得率0.4% (幹計)；發酵罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖30g，蛋白腖8g，酵母提取物5g，硫酸鋅15g，pH 值為6.5 ；發酵罐投料體積70%，接種重量6%，溫度20 30°C，通氣1 0.3 0.8，攪拌轉速120rpm，培養至菌絲體收得率(幹計)大於等於1. 2 %，培養基還原糖含量小於等於 0.2%時，放罐收穫菌絲體。板框過濾將培養好的蛹蟲草菌絲體以板框過濾機過濾，經過板框過濾後取出菌絲體，5噸發酵罐獲得菌絲體溼重380Kg。研磨使細胞破碎，雜蛋白變性溼菌絲體中加入760Kg的0. 05mol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)-HCl (pH 8.6)， 用研磨機研磨、勻漿，至細胞破碎後，加入1040Kg的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的體積比為 0.08 1，變性除雜蛋白，攪拌約7min。將細胞破碎液於8000r/min離心，棄沉澱，得上清液；上清液85°C熱變性8min，沉澱雜蛋白，靜置0.證後，8000r/min以上離心棄沉澱，得上清液，為MT的粗提液；粗提液以截留分子量小於2000的膜超濾濃縮，得濃縮液20Kg。柱層析MT的提取液的濃縮液採用葡聚糖凝膠G-50進行柱層析分離，以去離子水洗脫，在254nm檢測洗脫液的吸收峰，吸收峰部分輔助以巰基試劑法監測，收集巰基試劑法監測到的最大吸收峰，即為金屬硫蛋白部分；柱層析得到的MT收集液冷凍乾燥，得到蟲草金屬硫蛋白凍乾粉4. 25Kg。實施例2
菌種亞香棒蟲草(Cordyc印s hawkesii Gray)菌種，來源於來源於中國林業微生物菌種保藏管理中心，編號Cfcc 5967。試管斜面菌種培養(活化)配製培養基每升培養液中葡萄糖20g，蛋白腖10g，酵母提取物5g，瓊脂粉10g， 調PH值為6. 0，分裝於試管中，滅菌，製成斜面；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面， 15°C培養10天。三角瓶液體種子培養配製培養基每升培養液中葡萄糖10g，蛋白腖10g，酵母提取物5g，pH值為6. 0， 將配製好的培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口後在120°C條件下滅菌30 分鐘，取出培養基，自然冷卻至25°C ；在無菌條件下每瓶接入黃豆粒大小的斜面培養物1-2 塊，20 0C，搖床轉速120rpm，培養7天。種子罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖10g，蛋白腖10g，酵母提取物10g，pH值為6. 0， 投料體積70 %，滅菌，接入培養好的三角瓶液體菌種，接種量10 %，培養溫度30 V，通氣 1 0. 5，攪拌轉速120rpm，在種子罐中15°C 30°C培養3天，至菌絲體收得率0. 5% (幹計)；發酵罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖50g，蛋白腖10g，酵母提取物10g，硫酸鋅20g， PH值為7.0;發酵罐投料體積80%，接種重量10%，溫度20 30°C，通氣1 0. 3 0. 8， 攪拌轉速150rpm，培養至菌絲體收得率(幹計)大於等於1. 2%，培養基還原糖含量小於等於0.2%時，放罐收穫菌絲體。板框過濾將培養好的亞香棒蟲草菌絲體以板框過濾機過濾，經過板框過濾後取出菌絲體，5 噸發酵罐獲得菌絲體溼重400Kg。研磨使細胞破碎，雜蛋白變性溼菌絲體中加入1200Kg的0. 05mol/L Tris (三羥甲基氨基甲烷)-HCl (pH 8. 6)， 用研磨機研磨、勻漿，至細胞破碎後，加入ieooKg的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的體積比為 0.08 1，變性除雜蛋白，攪拌lOmin。將細胞破碎液於5000r/min離心，棄沉澱，得上清液。上清液90°C熱變性5min，沉澱雜蛋白，靜置0.證後，8000r/min以上離心棄沉澱，得上清液，為MT的粗提液；粗提液以截留分子量小於2000的膜超濾濃縮，得濃縮液21Kg。柱層析MT的提取液的濃縮液採用葡聚糖凝膠G-50進行柱層析分離，以去離子水洗脫，在254nm檢測洗脫液的吸收峰，吸收峰部分輔助以巰基試劑法監測，收集巰基試劑法監測到的最大吸收峰，即為金屬硫蛋白部分。柱層析得到的MT收集液冷凍乾燥，得到蟲草金屬硫蛋白凍乾粉4. 85Kg。實施例3 菌種九州蟲草菌種(Cordyc印s kyusyuensis)來源於中國林業微生物菌種保藏管理中心，編號Cfcc 89250。試管斜面菌種培養(活化)
配製培養基每升培養液中葡萄糖5g，蛋白腖8g，酵母提取物10g，瓊脂粉20g，調 PH值為5，分裝於試管中，滅菌，製成斜面；將蛹蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，30°C 培養5天。三角瓶液體種子培養配製培養基每升培養液中葡萄糖15g，蛋白腖8g，酵母提取物10g，pH值為5，將配製好的培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口後在130°C條件下滅菌18分鐘，取出培養基，自然冷卻至20°C ；在無菌條件下每瓶接入黃豆粒大小的斜面培養物1-2 塊，25 0C，搖床轉速120rpm，培養7天。種子罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖10g，蛋白腖8g，酵母提取物5g，pH值為5， 投料體積60 %，滅菌，接入培養好的三角瓶液體菌種，接種重量2 %，培養溫度15°C，通氣 1 0. 5，攪拌轉速120rpm，在種子罐中15°C 30°C培養5天，至菌絲體收得率0.8% (幹計)；發酵罐培養配製培養基每升培養液中葡萄糖10g，蛋白腖5g，酵母提取物lg，硫酸鋅5g，pH 值為5.0;發酵罐投料體積60%，接種重量5%，溫度20 30°C，通氣1 0.3 0.8，攪拌轉速80rpm，培養至菌絲體收得率(幹計)大於等於1. 2 %，培養基還原糖含量小於等於 0.2%時，放罐收穫菌絲體。板框過濾將培養好的九州蟲草菌絲體以板框過濾機過濾，經過板框過濾後取出菌絲體，5噸發酵罐獲得菌絲體溼重300Kg。研磨使細胞破碎，雜蛋白變性溼菌絲體中加入450Kg的0. 05mol/LTris (三羥甲基氨基甲烷)-HCl(pH 8.6)， 用研磨機研磨、勻漿，至細胞破碎後，加入750Kg的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的體積比為 0.08 1，變性除雜蛋白，攪拌約5min。將細胞破碎液於lOOOOr/min離心，棄沉澱，得上清液。上清液80°C熱變性lOmin， 沉澱雜蛋白，靜置0. 5h後，8000r/min以上離心棄沉澱，得上清液，為MT的粗提液；粗提液以截留分子量小於2000的膜超濾濃縮，得濃縮液15Kg。柱層析:MT的提取液的濃縮液採用葡聚糖凝膠G-50進行柱層析分離，以去離子水洗脫，在254nm檢測洗脫液的吸收峰，吸收峰部分輔助以巰基試劑法監測，收集巰基試劑法監測到的最大吸收峰，即為金屬硫蛋白部分。柱層析得到的MT收集液冷凍乾燥，得到蟲草金屬硫蛋白凍乾粉3. 55Kg。
權利要求
1.一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其特徵在於其具體步驟為(1)培養蟲草屬真菌菌絲體將蟲草屬真菌進行試管斜面菌種培養(活化)、三角瓶液體種子培養、種子罐培養及發酵罐培養，發酵罐培養步驟的培養基為每升培養液中葡萄糖 10-50g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，硫酸鋅5-20g，pH值為5. 0-7. 0 ；發酵罐投料體積 60%-80%，接種重量5-10%，溫度20 30°C，通氣1 0. 3 0. 8，攪拌轉速80 150rpm， 培養至菌絲體收得率大於等於1. 2%，培養基還原糖含量小於等於0. 2%時，放罐收穫菌絲體；(2)板框過濾將培養好的蟲草屬真菌菌絲體以板框過濾機過濾，經過板框過濾後取出菌絲體，得到的菌絲體可以用於金屬硫蛋白的提取；(3)研磨使細胞破碎，雜蛋白變性將上述菌絲體中加入相當於菌絲體重量1. 5 3倍的0. 05mol/LTris(三羥甲基氨基甲烷)_HC1，pH 8. 6，用研磨機研磨、勻漿，至細胞破碎後，加入與菌絲體和Tris(三羥甲基氨基甲烷)-HCl等重量的氯仿和乙醇，氯仿和乙醇的體積比為0.08 1，變性除雜蛋白，攪拌約5 IOmin ；將細胞破碎液於5000 lOOOOr/min離心，棄沉澱，得上清液；上清液80 90°C熱變性5-lOmin，沉澱雜蛋白，靜置0. 5h以上，8000r/min以上離心棄沉澱，得上清液，為MT的粗提液；粗提液以截留分子量小於2000的膜超濾濃縮，得濃縮液；(4)柱層析將上述的MT的提取液的濃縮液採用葡聚糖凝膠G-50進行柱層析分離， 以去離子水洗脫，在254nm檢測洗脫液的吸收峰，吸收峰部分輔助以巰基試劑法監測，收集巰基試劑法監測到的最大吸收峰，即為金屬硫蛋白部分；將柱層析得到的MT收集液冷凍乾燥，得到蟲草金屬硫蛋白凍乾粉。
2.根據權利要求1所述的一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其特徵在於所述的試管斜面菌種培養(活化)步驟配製培養基每升培養液中葡萄糖5-25g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g，瓊脂粉10-20g，調pH值為5. 0-7. 0，分裝於試管中，滅菌，製成斜面；將蟲草菌種在無菌條件下接入試管斜面，15 30°C培養5-10天。
3.根據權利要求1所述的一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其特徵在於所述的三角瓶液體種子培養步驟配製培養基每升培養液中葡萄糖10_20g，蛋白腖5-10g，酵母提取物1-lOg,pH值為5. 0-7. 0，將配製好的培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝200ml，封口後在120 130°C條件下滅菌18 30分鐘，取出培養基，自然冷卻至20 30°C;在無菌條件下每瓶接入黃豆粒大小的斜面培養物1-2塊，15 30°C，搖床轉速120rpm，培養5天 10 天。
4.根據權利要求1所述的一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其特徵在於所述的種子罐培養步驟配製培養基每升培養液中葡萄糖10_20g，蛋白腖5-10g，酵母提取物l-10g， PH值為5. 0-7. 0，投料體積60% -80%,分批滅菌，接入培養好的三角瓶液體菌種，接種量2-10%，培養溫度15 30°C，通氣1 0. 5，攪拌轉速120rpm，在種子罐中15 30°C培養 2-5天，至菌絲體收得率0. 4-0. 8% (幹計)。
全文摘要
本發明公開了一種蟲草金屬硫蛋白的生產方法，其具體步驟為蟲草菌→液體培養(添加硫酸鋅誘導)→菌絲體過濾→富含金屬硫蛋白的菌絲體→加緩衝液、研磨破碎細胞→加有機變性、攪拌，雜蛋白變性→離心去除雜蛋白→清夜加熱變性→離心去除變性蛋白→迅速冷卻至室溫→超濾濃縮→濃縮液→G-50層析→巰基試劑法監測收集MT洗脫液→MT洗脫液真空冷凍乾燥→MT凍乾粉，本發明操作簡單，生產周期短，菌絲體或子實體中MT產率高，可以進行工廠化生產。
文檔編號C07K1/36GK102206693SQ201110076199
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月23日 優先權日2011年3月23日
發明者劉宇, 張聰聰, 李維煥, 程顯好, 董洪新, 馬天雲 申請人:魯東大學