生物樣本採集/運輸組合物及方法

2023-05-25 14:44:46

專利名稱：生物樣本採集/運輸組合物及方法
技術領域：
本發明涉及用於採集、運輸和儲存含有核酸群的生物樣品的組合物和方法，可隨後用一種或多種常規方法或測定分離、純化和/或表徵所述核酸群。
背景技術：
在分子和診斷分析領域，不管樣本是取自遠程現場點、醫生辦公室還是實驗室，保持生物樣品中核酸(特別是那些包含在由人患者獲得的診斷樣品中的核酸)穩定的能力常常決定該核酸能否被成功分析。生物樣品中的核酸在室溫迅速降解和/或變性，通常必須儲存在冰點溫度下以保持穩定，然而，隨著時間的推移仍然會發生某種程度的降解。當樣本採集自遠程現場點，或離醫生辦公室或實驗室環境非常遠的距離時，尤其是在進行樣品分析之前持續穩定的冷卻器/冰箱/冷藏室條件的獲得可能受到限制或不能獲得時，例如當電力或冰箱/冷藏設備的獲得不可靠或不存在時，擴大了這一問題。當用於下遊分析的所需核酸包括特別易於被內源性或外源性核酸酶活性降解的核糖核酸(RNA)時，進一步加劇與採集和處理希望由其獲得核酸的生物樣本相關的問題。市售樣本運輸方法通常使用專門的運輸介質用於生物樣品由採集點到分析點的運輸，具體而言，限制樣品可儲存的時間的包裝需要樣品即使是在運輸或延長儲存期間持續保持在低溫，實際上限制了採集點和診斷實驗室之間的可能的時間和距離。除了有關樣本的穩定性的擔憂外，還常常另外存在關於儲存和運輸所採集樣品中所用的試劑的處理和/或儲存的擔憂。例如，試劑本身常常需要低溫或其它專門的維護以保持穩定性。例如，由於這些穩定性問題，將試劑運輸到現場點、使用之前在現場點的儲存以及將生物樣本和試劑運回檢驗點是主要問題。操作生物樣本時的另一個重要關注點，是活的有傳染性的病原體或生物製劑由樣本向環境的潛在接種、釋放或傳播。目前已經有在處理可能有傳染性或另外引起健康或安全風險的樣品時採用的特定方案。如果讓樣品保持有活力和/或生物學完整以保持其用於檢測的完整性，則參與採集、運輸和檢驗過程的個體可能暴露於高危傳染物。另外，如果發生傳染物釋放，現場或樣品採集場所附近的(或運輸期間附近的)無辜旁觀者可能處於暴露中。因此，所需的安全措施通常增加將所述樣品從一個位置移動到另一個位置所需的費用和精力。直到最近，病原體檢測的臨床實驗室方法還是費力、昂貴的過程，需要有特定經驗的高度知識淵博和內行的科學工作者。大多數臨床診斷實驗室採用常規培養方法，所述方法通常需要3 7天來培養病毒，對於一些其它細菌靶標甚至需要更長時間。此外，常規的培養需要採集、運輸及實驗室增殖和處理有潛在傳染性的生物製劑，例如依波拉、禽流感和嚴重急性呼吸症候群(SARS)等等。80年代中期，聚合酶鏈式反應(PCR)的出現使臨床分子診斷領域發生了巨大的變化，但此後不久，90年代中期出現了實時PCR。使用例如實時定量PCR(qPCR)或逆轉錄酶 PCR(RT-PCR)及定量、實時、逆轉錄酶PCR(qRT-PCR)測定的基於核酸的檢測平臺，可在數小時內提供結果，與傳統培養和分離方法需要數天相比，這使分子檢測方法成為現代診斷實驗室分析的支柱。檢測化學的最新改良，例如新改良的報告/猝滅螢光染料、小溝結合劑(MGB) (TaqMan MGB , Applied Biosystems ；關於一般參考亦參見例如 Baraldi 等，Rire Appl. Chem. ,75(2-3) 187-194，2003)和穩定的擴增試劑，業已為更靈敏和高度特異性的核酸檢測測定鋪平了道路，並業已證明比落伍的基於細胞培養的方法更及時、更健全、更經濟。在其它核酸檢測策略方面的進展，例如轉錄介導的擴增、連接酶鏈反應(LCR)和所謂的 「晶片實驗室」多重測定，也有助於臨床實驗室從培養瓶到微陣列的轉變。幾家商業公司(例如 Qiagen [Valencia, CA，USA]、Roche Applied Science[Indianapolis, IN,USA]>Gen-Probe[San Diego, CA, USA]禾口 bioMerieux[Durham, NC，USA])，已開發出用於自動化進行從樣品分離到分子分析的核酸提取過程的儀器。例如， Tigris DTS (Gen-Probe, San Diego, CA, USA)使全部檢測過程自動化，2004年年底由美國食品和藥品管理局(FDA)批准用於同時檢測砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)和淋病奈瑟氏淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)，其使用 Gen-Probe 的 APTIMA C0MB0-2 擴增的核酸檢驗(NAT)測定。鑑於當代的檢測和測定系統對高質量核酸樣品的要求，目前本領域需要安全、容易的採集、儲存和運輸系統，所述系統保持包含在多種生物樣品和樣本中的核酸的完整性和質量。此外，目前亦需要在沒有對一種或多種採集試劑、生物樣品本身或包含其中的核酸群的冷藏、冷凍或其它特殊處理的情況下，持續長時間在周圍環境(即非理想的)條件下於遠程或野外地點採集、保存和運輸樣品(尤其是那些含有有害的或病原生物體的樣品)。而且，目前需要更經濟和更方便的採集/運輸/儲存介質，所述介質最大限度減少病原體暴露於工作人員或無辜旁觀者的風險，允許使用單步製劑，並有助於含有高保真度、高質量核酸群的生物樣本長距離或長時間方便地進行環境運輸。發明概述本發明包括新的有用的組合物以及製備和使用所述組合物的方法，所述組合物可有利地改進用於從一種或多種生物來源中製備核酸的常規採集、裂解、運輸和儲存方法。因此，本發明有利地提供採集和保存的製劑，用以滅活和裂解含有核酸的生物樣本，並保存生物樣本內的核酸(例如RNA或DNA)，優選全部在單一反應容器中，使得至少基本上保持並優選完全保持核酸的完整性，以便可容易地獲得部分核酸用於分子診斷分析。本發明的另一優點是，所述製劑可以使得分離或釋放出的核酸能夠至少基本上保持穩定，而無需持續穩定的冷卻器溫度，例如冷藏或冷凍。本文揭示的一步製劑(one-step formulation)實現以下主要功能使樣品內的病原體失活或被殺死；裂解細胞並從細胞分離或釋放核酸；滅活內源或外源核酸酶及其它細胞酶以防止存在於樣品中的核酸的降解；和促進在環境溫度下採集和處理樣品，在隨後的樣品運輸和儲存期間穩定核酸，通過使用基因組外、無義RNA載體分子保存樣品的完整性，所述載體分子也用作內部陽性對照(IPC)以監測被處理樣品的保真度。單步製劑優選在單一反應區或反應容器中實現所有這些所需功能的能力，是優於目前可用方法的特別顯著的優勢。目前已有的技術不包括單步組合物，所述單步組合物供用於使含有核酸的生物組分滅活，通過裂解細胞並分離或釋放核酸來釋放核酸，保持釋放的核酸群和定量樣本保真度的適宜IPC的完整性。本發明既穩定存在於用於診斷測試的樣本中的核酸又保持所述核酸的完整性，同時還提供用於監測採集介質保真度的便利方法，所述方法採用容易檢測的、可定量的RNA載體分子。本發明的一步製劑允許優選同時使含有核酸的生物組分滅活、裂解和分離或釋放核酸、穩定和保存。在一個實施方案中，滅活、裂解和分離或釋放、穩定和保存中的一些或所有都序貫進行。然而，在優選實施方案中，這些功能中的大多數或優選全部同時發生。在所有實施方案中，將一步製劑與樣品混合以啟動這些功能。這與以前的技術形成對比，以前的技術中滅活不一定發生，並且裂解、穩定和保存發生在連續的分開步驟中，每一步驟通常使用分開加入的一種或多種截然不同的試劑及方案。與需要許多序貫步驟以使誤差最小化、避免試劑不相容性並提供對結果的逐步控制的先前的核酸分離方法不同，本發明在單一步驟製劑中提供所有這些好處，而且還增加了更多的好處保持核酸完整性，通過使用內部無義RNA載體分子監測儲存/採集/運輸過程的保真度，促進樣品核酸的更高提取和純化效率，以及改善其最終收率。本發明的一步製劑優選促進同時滅活含有核酸的生物組分、裂解並從細胞碎片釋放核酸、穩定和保存核酸， 降低生物樣品內含有的核酸群在裂解之前、期間或之後可能發生的降解的機率。開發並優化了所揭示的組合物以1)促進從臨床或環境樣本製備高質量核酸；2) 滅活、殺死或以其它方式中和生物樣品中潛在的有傳染性的病原體，以促進安全處理及運輸所採集的樣本；和3)長時間穩定釋放出的(即「裸的」)DNA/RNA而不會水解或核酸酶降解釋放的核酸。本文所述組合物理想地用於臨床、現場和調度應用，或用於大體積樣品的採集/ 提取。在一種或多種所揭示組合物中採集的樣本是生物滅活的，可安全地運輸，通常甚至不需要冷藏或乾冰。在某些實施方案中，考慮加入核酸(例如RNA和/或DNA)以有益於所揭示方法的多種目的和應用a)作為「載體」(先前已顯示加入少量的補充RNA/DNA以提高/增加樣品/樣本的總收率，特別是對可能含有低量靶標的原始樣本(即細胞、病毒和細菌)的總收率)；b)作為IPC用於下遊分子過程，並跟蹤或監測來自待檢測的採集樣品的核酸製品的保真度；和c)用於與下遊定量分析例如qRT-PCR等的「校準物(calibrator)，，比較。在所述實施方案中，可將一種或多種已知的或「對照」核酸以終濃度為約lag-約lmg，更優選約 Ifg-約1 μ g，還更優選約Ipg-約Ing加入到組合物中。在闡明性實施方案中，本發明提供分離的單鏈(ss)或雙鏈(ds)RNA、DNA、PNA或其雜合體，其可用作(a)載體分子用於幫助從懷疑含有核酸的生物樣品回收多核苷酸；和 /或(b)IPC(即「已知的」、「報告分子」、「對照」、「標準品」或「標記」)序列以監測樣本採集的完整性和保真度及多核苷酸的分離/穩定。在某些實施方案中，本發明提供可用作載體分子和/或IPC的分離的dS-RNA、ds-DNA、ds-PNA或其雜合體。在另外的實施方案中，本發明提供可用作載體分子和/或IPC序列的分離的SSRNA、SSDNA、SSPNA或其雜合體。在例示性實施方案中，本發明提供既可用作載體分子又可用作IPC序列的分離的ssRNA分子。所述分子可自天然來源分離，在實驗室製備，或作為備選，可以是含有天然和非天然序列兩者的雜合體。如本文所述，因為本發明組合物尤其可用於自懷疑含有病原體源的多核苷酸的哺乳動物(特別是人)來源獲得的生物樣本的分離和表徵，因此優選作為載體和/或陽性對照化合物採用的一種或多種序列，基本上含有通常不能在哺乳動物基因組內或對所述哺乳動物為致病的生物體的基因組內發現的一級核苷酸序列。例示性的哺乳動物包括但不限於牛、綿羊、豬、狼、犬、馬、貓、熊、鼠、獅子、野兔、山羊和非人靈長類。優選這種非哺乳動物、非病原體特異性的載體/報告序列不可交叉反應，即基本上不能或優選不能與哺乳動物或病原體特異序列雜交，因此，在配製對照/載體序列中特別優選非編碼、非簡併(即無意義)序列，以使對照/載體序列與自採集的樣本獲得的分離多核苷酸群的成員的雜交減到最低。因此，例示性的載體/對照序列基本上不與或優選不與自哺乳動物基因組分離的多核苷酸群結合(即在嚴格雜交條件下雜交)，或不與自對哺乳動物為致病的細菌、真菌、病毒基因組分離的多核苷酸群結合。本領域普通技術人員已知的例示性的嚴格雜交條件包括但不限於以下所述或與其等同的雜交條件(a)用含有約5X SSC、0. 5% SDS 和 1. OmM EDTA (pH 8.0)的溶液預洗滌；(b)於 5X SSC 中在約 60°C -約 70°C 溫度下雜交過夜；和(c)隨後用含有0. SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC各自在約65°C -約 70°C溫度下洗滌20分鐘。儘管可在本發明組合物中和具體而言在本文揭示的製劑(例如PSS製劑)中使用任何實用長度的載體分子，但優選載體分子的長度為約40-約900個核苷酸長；更優選約50-約800或作為備選約60-約700個核苷酸長；還更優選約70-約600或作為備選約 80-約500個核苷酸長；甚至更優選約90-約400個核苷酸或作為備選約100-約300個左
右核苷酸長。因此，預期所有多核苷酸的中間長度落入本公開內容範圍內，包括但不限於以下長度的載體分子序列約45個核苷酸長、約50個核苷酸長、約55個核苷酸長、約60個核苷酸長、約65個核苷酸長、約70個核苷酸長、約75個核苷酸長、約80個核苷酸長、約85個核苷酸長、約90個核苷酸長、約95個核苷酸長、約100個核苷酸長、約120個核苷酸長、約 140個核苷酸長、約160個核苷酸長、約180個核苷酸長、約200個核苷酸長、約220個核苷酸長、約240個核苷酸長、約260個核苷酸長、約280個核苷酸長或甚至約300個左右核苷酸長。儘管預期任何實際的、無義/最低限度交叉雜交的多核苷酸序列可用於製備載體序列，以促進在其中期需對照序列的情況下改進多核苷酸靶標群的分離，但對所述分子的一級核酸序列有額外的要求，即該序列必須是可用一種或多種常規分子生物學技術檢測和
/或定量的。為此，本發明提供至少含有與適合檢測的探針特異性雜交(即結合)的第一序列域的載體/報告分子，所述探針包括但不限於分子標記探針及其衍生物。例示性的標記探針為包含分子領域普通技術人員已知的放射性的、發光的、化學發光的、螢光的、酶的、磁性或自旋共振的標記的探針。在闡明性實施方案中，標記探針至少含有第一小溝結合劑。在某些實施方案中，為了促進常規可檢測標記探針的結合，本發明的載體/報告分子至少含有與至少第一可檢測探針特異性結合的約10-約60個核苷酸長的第一序列域。儘管第一序列域可以是完整載體序列中的任何實用長度，但優選第一序列域為約 12-約50個核苷酸長；更優選為約14-約45個核苷酸長；還更優選約16-約40個左右核苷酸長；還更優選約18-約30個左右核苷酸長。因此，預期探針雜交序列域的所有中間長度落入本公開內容範圍內，包括但不限於以下長度的探針結合域約13個核苷酸長、約14個核苷酸長、約15個核苷酸長、約16個核苷酸長、約17個核苷酸長、約18個核苷酸長、約19個核苷酸長、約20個核苷酸長、約21個核苷酸長、約22個核苷酸長、約23個核苷酸長、約M個核苷酸長、約25個核苷酸長、約 26個核苷酸長、約27個核苷酸長、約觀個核苷酸長或甚至約四或30個左右核苷酸長。當期需可通過一種或多種基於擴增的方法(包括但不限於基於PCR的方法)來檢測載體/報告序列時，可期需載體/報告序列的其它的分子特徵，即序列或至少其部分可用一種或多種基於聚合酶鏈的測定擴增。例如，對於基於PCR或FRET的方法，可期需載體/ 報告分子至少含有與正向PCR擴增引物(通常約20-約40個核苷酸長)特異性結合的第二序列域和與反向PCR擴增引物(通常也是約20-約40個核苷酸長)特異性結合的第三序列域。優選第二和第三序列域可操作地定位，以促進在有效擴增核酸區段的至少第一部分的條件下自正向和反向引物進行所述至少第一部分的PCR引導擴增。當期需可通過一種或多種基於非對稱性擴增的方法(包括但不限於不對稱PCR、 分子雜交、基於親和標記的方法等)檢測載體/報告序列時，並不一定需要一對正向和反向引物結合域一用適當的診斷測定，僅單一的第二序列域可足以檢測該載體序列。在所述實施方案中，可採用單一的檢測/複製引物(或聚合酶結合域)。通常所述序列域為約15-約 35個左右核苷酸長，但利用常規的分析方法可採用任何常規的靶定域。在分子領域認為所述域的設計和一級序列為日常工作，因此在普通技術人員的知識範圍內。在某些實施方案中，視IPC序列長度和一級核苷酸而定，第一序列域與第二、第三序列域或甚至與第二和第三序列域兩者共享至少第一共有核苷酸序列區。所述序列重疊可能只是一個或多個核苷酸，或作為備選，為由5到10個或更多個核苷酸組成的較大重疊區域。在例示性的實施方案中，可通過一種或多種適當的分子生物學技術來製備IPC序列，包括例如通過包含對照序列或作為備選包含與對照序列本身互補的核酸序列的多核苷酸的體外轉錄。如以下實施例所述，製備對照序列的一種方法包括製備DNA雙鏈體，可從該 DNA雙鏈體合成單鏈RNA對照序列。例示性的單鏈RNA對照序列包括但不限於那些含有下列RNA序列中的至少約105 個、至少約95個、至少約85個、至少約75個、至少約65個、至少約55個、至少約45個、至少約35個或至少約25個左右相鄰核苷酸的序列5 『 -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGG CAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO :2)。在闡明性實施方案中，分離的單鏈核糖核酸分子可通過包括多核苷酸體外轉錄的過程製備，所述多核苷酸包含SEQ ID NO 2的核酸序列，或大體上由或作為備選由SEQ ID NO 2的核酸序列組成。在一個所述實施方案中，單鏈RNA對照序列可從DNA序列體外合成，所述DNA序列含有來自以下序列的至少約90個、至少約80個、至少約70個、至少約60個、至少約50個、 至少約40個、至少約30個或至少約20個或更少的相鄰核苷酸5 『 -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGG CAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO 1)。在例示性的實施方案中，分離的單鏈核糖核酸分子可通過包括多核苷酸體外轉錄的過程製備，所述多核苷酸包含SEQ ID NO :1的核酸序列，或大體上由或作為備選由SEQ ID NO :1的核酸序列組成。本發明一方面提供用於檢測自用所揭示的樣品採集/儲存製劑製備的生物樣品獲得的多種多核苷酸內RNA載體分子存在與否的方法，所述製劑包括但不限於本文所述的一種或多種製劑，包括但不限於PSS製劑。還有用於定量測定樣品中RNA載體分子的量並監測製劑在穩定和保護所分離多核苷酸的分子保真度方面的有效性的方法。通過比較經過一段時間後樣品中剩餘的載體分子的量和存在於初始溶液中的載體分子的已知量，人們可以測定載體分子在存在於生物樣品期間遭受的降解量。人們可以利用這種相關性，估計自原始樣品釋放出的多核苷酸群隨著時間的推移已發生降解的程度。另一方面，本發明提供用於快速檢測生物樣品中的特定多核苷酸序列例如IPC序列的方法。從整體和一般意義上看，該方法包括使用常規方法例如PCR和對靶序列特異的正向和反向引物擴增懷疑含有特定序列的核苷酸群，特異性探針套與得到的單鏈PCR產物雜交，進行解鏈曲線分析，並分析單鏈PCR產物與雜交探針的雜合體的Tm變化。在一個實施方案中，本發明提供用於利用基於PCR的方法快速檢測多核苷酸(例如載體IPC序列)的存在情況的方法，所述方法通常包括以下步驟(a)從待分析的樣品分離多核苷酸；(b)通過利用對靶標序列特異的引物套的PCR擴增多核苷酸；(c)讓一種或多種對目的多核苷酸特異的標記探針與自步驟(b)獲得的單鏈PCR產物雜交；和(d)檢測樣品中標記探針的存在情況，其表示分離的多核苷酸群中特定靶標序列的存在情況。用標記「探針」序列檢測多核苷酸的一種所述方法利用螢光共振能量轉移(FRET) 過程。例示性的FRET檢測方法往往涉及包含供體螢光團和受體螢光團的螢光團對，其中供體螢光團能夠向受體螢光團傳遞共振能量。在例示性的FRET測定中，供體螢光團的吸收光譜基本上不與受體螢光團的吸收光譜重疊。本文所用「供體寡核苷酸探針」，是指用螢光共振能量轉移對的供體螢光團標記的寡核苷酸。本文所用「受體寡核苷酸探針」，是指用螢光共振能量轉移對的受體螢光團標記的寡核苷酸。本文所用「FRET寡核苷酸對」，通常包括 「錨定」或「供體」寡核苷酸探針和「受體」或「傳感器」寡核苷酸探針，當供體寡核苷酸探針和受體寡核苷酸探針二者都與其互補靶標核酸序列雜交時，所述寡核苷酸對形成FRET關係。用作螢光共振能量轉移對的可接受的螢光團對為本領域技術人員所熟知，包括但不限於螢光素/羅丹明、藻紅蛋白/Cy7、螢光素/Cy5、螢光素/Cy5. 5、螢光素/LCRed 640及螢光素/LC Red 705等等。可用例如電腦程式例如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc.， Cascade, CO,USA)來設計用於擴增特定IPC序列的引物。儘管任何實用長度的引物可用於本發明實踐中，但寡核苷酸引物一般為約10-約60個左右核苷酸長(包括但不限於所有的中間整數，例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59或甚至60或更多個核苷酸長)。本發明還提供用於提高自懷疑含有多核苷酸的生物樣品獲得純化的這類多核苷酸群的效率的方法。從整體和一般意義上看，所述方法包括讓樣品與組合物以足以提高自生物樣品獲得純化的多核苷酸群的效率的量和時間接觸，所述組合物包含一種或多種本文所述的製劑(包括但不限於PSS製劑)及載體和/或IPC核酸區段。在例示性的實施方案中，生物樣品中多核苷酸群的完整性，和/或自樣品獲得的多核苷酸中的至少一種的至少第一序列的保真度，在以下情況下至少基本上得以保持(即所述群中至少75%的核苷酸基本上為全長)當包含樣品的組合物在約-20°C到約40°C溫度下儲存約7到約14天或更長時間時；或者，在約-20°C到約40°C溫度下儲存約7到約14
11天或更長時間時；或者作為備選在約20°C到約40°C溫度下儲存約14到約30天或更長時間時。或者，生物樣品中多核苷酸群的完整性至少基本上得以保持，如使得當與最初採集樣品時存在於溶液中的量相比時，群體中的核苷酸至少約80%、至少約85%、至少約 90%或至少約95%或更多存在於溶液中。在優選實施方案中，樣品的完整性基本上得以保持，使得所有或幾乎所有存在於原始樣品中的多核苷酸會隨著時間得以保持(即無可檢測到的降解)。在所揭示方法的實施中，優選從採集時間到分離、純化或表徵其中的多核苷酸群的時間，不到約20%的原始存在於所採集的樣品中的多核苷酸群在隨後的儲存期間隨著時間而被降解。優選基本上不到約15%的原始存在於所採集的樣品中的多核苷酸群在隨後的儲存期間隨著時間而被降解，更優選不到約10%的原始存在於所採集的樣品中的多核苷酸群在隨後的儲存期間隨著時間而被降解，還更優選不到約5%的原始存在於所採集的樣品中的多核苷酸群在隨後的儲存期間隨著時間而被降解。在特別優選的實施方案中，不超過約5%、約4%、約3%、約2%或約的原始存在於所採集的樣品中的多核苷酸群在隨後的儲存期間隨著時間而被降解。優選不管樣品的儲存條件如何皆如此高完整性保存樣品質量，並且可基本上保持以下時間至少約7天、至少約14天、至少約21天、至少約30天、至少約45天、至少約60天或甚至至少約90天或更長。用於採集、儲存和/或運輸可自其獲得一種或多種核酸群的生物源樣品的所揭示方法，亦可進一步任選包括一個或多個步驟，所述步驟包括但不限於(a)分析和/或定量測定自樣品獲得的一種或多種多核苷酸；(b)檢測所採集樣品中載體分子(即IPC)的存在情況；(c)測定所採集樣品中的IPC量；和/或(d)測量所採集樣品中IPC的序列保真度， 或測定所採集樣品中IPC的降解百分比。儘管可用分子領域普通技術人員已知的任何常規方法測定自本發明實踐獲得的或在本發明實踐中利用的特定多核苷酸序列的存在情況、完整性或序列保真度，但在一個實施方案中，使用PCR擴增方法。同樣地，目的多核苷酸完整性的測定可包括在給定條件下PCR循環閾值(Ct)的測定，所採集的核酸的序列保真度、定性完整性的測定可通過常規的DNA或RNA測序方法測定，所述方法包括但不限於Maxam-Gilbert的基於化學的方法、 Sanger等的雙脫氧鏈終止法、Mathies等的基於染料螢光團的方法或Nyren和Ronaghi所述的焦磷酸測序技術。本發明例示性的製劑包括一步採集溶液，所述溶液裂解生物樣品、穩定自該生物樣品製備的核酸和保存所述核酸的完整性，用於後續RNA和/或DNA分離、檢測、定量、擴增和/或分析。在某些實施方案中，將本發明的無義載體/IPC組合物調配在一步樣品採集/儲存 /運輸介質中，所述介質包括a) —種或多種離液劑(優選每種在組合物中存在的量為約 0. 5M-約6M) ；b) 一種或多種洗滌劑(優選每種在組合物中存在的量為約0. -約)； c) 一種或多種螯合劑(優選每種在組合物中存在的量為約0. OlmM-約ImM) ；d) 一種或多種還原劑(優選每種在組合物中存在的量為約0. 05M-約0. 3M)；和e) —種或多種消泡劑 (優選每種在組合物中存在的量為約0. 0001% -約0. 3% )。例示性的離液劑包括但不限於硫氰酸胍(GuSCN)、鹽酸胍(GuHCl)、異硫氰酸胍(guanidine isothionate)、硫氰酸鉀(KSCN)、碘化鈉、高氯酸鈉、尿素或其任意組合。另外的例示性離液劑和離液鹽的描述可參見美國專利號5，234，809(通過對其明確引用以其整體具體結合於此)。例示性的洗滌劑包括但不限於十二烷基硫酸鈉(SDQ、十二烷基硫酸鋰(LDS)、牛磺脫氧膽酸鈉(NaTDC)、牛磺膽酸鈉(NaTC)、甘氨膽酸鈉(NaGC)、脫氧膽酸鈉(NaDC)、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉(NaABQ、N-十二烷醯肌氨酸(NLQ、羧酸鹽類(即皂類)、磺酸鹽類、硫酸鹽類、磷酸酯類和多磷酸酯類、烷基磷酸酯類、單烷基磷酸酯(MAP)、全氟羧酸鹽類、包括美國專利號5，691，四9(通過對其明確引用以其整體具體結合於此)所述的那些在內的陰離子洗滌劑或其任意組合。例示性的還原劑包括但不限於2-巰基乙醇(β -ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、 二硫蘇糖醇(DTT)、甲醯胺、二甲亞碸(DMSO)或其任意組合。在優選實施方案中，還原劑包括或為TCEP。例示性的螯合劑包括但不限於乙二醇四乙酸(EGTA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、N，N-雙(羧甲基)甘氨酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨(ammonium bicitrate)、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鉀、檸檬酸鎂、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任意組合。在優選實施方案中，螯合劑包括EDTA、檸檬酸鹽或其組合。在更優選的實施方案中，螯合劑包括EDT。本發明的組合物可進一步包含消泡劑，以防止通常因製劑中存在洗滌劑引起的泡沫的形成。消泡劑有助於移取和處理所揭示的組合物。例示性的表面活性劑/消泡劑包括但不限於椰油醯胺丙基羥基磺基甜菜鹼(cocoamidopropyl hydroxysultaine), 烷基氨基丙酸、咪唑啉羧酸酯類(imidazoline carboxylates)、甜菜鹼、磺基甜菜鹼 (sulfobetaine)、磺基甜菜鹼(sultaines)、烷基酚乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、聚氧乙烯化聚氧化丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、長鏈羧酸酯、鏈烷醇醯胺(alkonolamides)、叔炔屬二醇(tertiary acetylenic glycols)、聚氧乙烯化矽酮、N-烷基吡咯烷酮、烷基多糖苷 (alkylpolyglycosidases)、矽酮聚合物例如Antifoam A. 或聚山梨醇酯例如Tween 或其任意組合。在優選實施方案中，消泡劑包括矽酮聚合物。任選本發明的組合物可進一步包含一種或多種緩衝劑(優選每一種在最終組合物中存在的量為約ImM-約1M)。例示性的緩衝劑包括但不限於三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、檸檬酸鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MEQ、N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1，3-雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、3-(環己氨基)-1-丙磺酸 (CAPS)、3-(環己胺)-2-羥基-1-丙磺酸(CAPSO)、4_ (2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、 3- (N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、3- (N-嗎啉代)-2-羥基丙磺酸(M0PS0)、哌嗪-N，N 『-雙 (2-羥基)丙磺酸(P0PS0)、N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸(TAPQ、N-[三(羥甲基)甲基]-3-氨基-2-羥基丙磺酸(TAPSO)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸 (TES)、N，N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、 N-乙醯胺基)-2-亞氨基二乙酸(ADA)、N-乙醯胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)JjS 嗪-1，4-雙O-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任意組合。在優選的實施方案中， 緩衝劑包括檸檬酸鹽。
期需包含一種或多種所述任選但優選的緩衝劑以控制製劑的pH，因為已發現核酸提取在PH約5到7的範圍內最佳。優選選擇所揭示組合物中採用的一種或多種緩衝劑以在pH約6-pH約8的範圍內提供顯著的緩衝能力，更優選在pH約6-約7範圍內，還更優選在pH約6. 2-約6. 8的範圍內。在例示性的實施方案中，I^rimeStore 溶液(本文也稱為 「PSS」)的 pH 優選約為 6. 9 士 0.25。本發明組合物亦可任選進一步包含一種或多種短鏈(優選1-6個碳[即C1-C6]) 醇)烷醇(優選每種在組合物中存在的量為約-約25%，但若需要的話可使用更高百分比的醇)。例示性的短鏈烷醇包括直鏈和支鏈醇，例如而不限於甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇或其任意組合。本發明的組合物亦可進一步任選包括一種或多種另外的化合物或試劑，包括但不限於陽離子官能化的兩性離子化合物，例如甜菜鹼(包括但不限於N，N, N-三甲基甘氨酸、椰油醯胺丙基甜菜鹼等等)、類蛋白(包括但不限於卵清蛋白及牛、馬或人源血清白蛋白)和滲透劑(包括但不限於三甲胺N-氧化物(ΤΜΑ0)、二甲基巰基丙酸內鹽 (dimethylsulfoniopropionate)、肌氨酸和糖類或糖醇，包括但不限於海藻糖、麥芽糖、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露醇、山梨醇、福壽草醇等等)。優選本發明的組合物提供充分的緩衝能力以適當穩定自樣品獲得的多核苷酸群， 最優選在配製期間緩衝到PH約6. 4-6. 9，並當樣品與本文所述儲存/採集製劑接觸時讓分離的多核苷酸群保持在相似的PH範圍內。本發明組合物通常至少基本上並優選完全讓樣品中存在的任何內源或外源RNA 酶或DNA酶失活，使得樣品中的核酸在樣品採集、裂解、儲存和運輸期間基本上免於任何降解並優選不降解或不喪失完整性，以用於後續的體外或體內分析。本發明的儲存/運輸/採集組合物的例示性的製劑闡述於本文實施例中，包括但不限於包括以下的組合物，其包含約4M離液劑(例如硫氰酸胍、鹽酸胍、異氰酸胍或其任意組合)、約10-30mM的螯合劑(例如EGTA、HEDTA, DTPA, NTA、EDTA、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任意組合)、約 0. 25%的洗滌劑(例如 SDS、LDS、NaTDC, NaTC, NaGC, NaDC、膽酸鈉、NaABS, NLS 或其任何鹽或組合)、約0. IM的還原劑(例如β -ME、DTT, DMSO,甲醯胺、TCEP或其任意組合)和約0. 1 %的表面活性劑/消泡劑(例如矽酮聚合物[例如Antifoam A ]或聚山梨醇酯[例如Tween ]或其任意組合)。本發明樣本採集組合物的另外的例示性製劑包括但不限於以下組合物，其包含約 3M的離液劑(例如硫氰酸胍、鹽酸胍、異氰酸胍或其任意組合)、約lmM-0. 5M的還原劑(例如β -ME、TCEP,甲醯胺、DTT、DMSO或其任意組合)、約1_約IOmM的螯合劑(例如EGTA、 HEDTA、DTPA、NTA、EDTA、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任意組合)、約0. 25%的洗滌劑(例如SDS、LDS、 NaTDC、NaTC、NaGC、NaDC、膽酸鈉、NaABS、NLS或其任何鹽或組合)和任選但優選約0. 0002% 的消泡劑(也稱為防沫劑)(例如矽酮聚合物或聚山梨醇酯或其任意組合)以及約IOOmM 的緩衝劑(例如Tris、MES、BES、Bis-Tris, HEPES, MOPS、碳酸氫鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其任意組合)。所揭示的多核苷酸分離和穩定組合物的另一種例示性製劑，包括但不限於以下組合物，其包含約1-約4M的離液劑，例如硫氰酸胍、鹽酸胍或異氰酸胍；約0. 5-100mM的螯合劑，例如EDTA或檸檬酸鈉，或兩者；約0. 1-約1 %的陰離子洗滌劑，例如SDS或N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；約0. 001-0. 0001%的表面活性劑或潤溼劑，例如矽酮聚合物、Antifoam A ；約10-約500mM的緩衝劑，例如Tris-HCl ；和約10-約25%的短鏈烷醇，例如乙醇。在特定實施方案中，本發明提供以下組合物，其包含約2. 5M硫氰酸胍；約0. 5mM TCEP ；約IOmM檸檬酸鈉；約0. 4% N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；約0. 0002% Antifoam A ；約 IOOmM Tris-HCl ；約 0. ImMEDTA ；以及約 23% 乙醇。本發明還提供用於自懷疑含有核酸的樣品獲得多核苷酸群的方法。該方法通常涉及在對自樣品獲得多核苷酸群有效的條件下，讓樣品與一定量的所揭示的組合物之一混合 (associate) 0本發明不需要分離該群來「獲得」樣品，因為隨後的診斷可能需要或可能不需要這樣的分離。本發明還提供製備本文所述採集/裂解/運輸/儲存組合物的一步水性製劑用於採集核酸例如RNA和/或DNA的方法。從整體意義來看，該方法通常涉及在反應區中於約20°C -90°C溫度下將一種或多種離液劑與無核酸酶水混合；然後在該反應區中讓溶解的一種或多種離液劑與一種或多種還原劑、一種或多種螯合劑以及一種或多種洗滌劑混合， 以形成中間組合物；任選讓矽酮聚合物以足以使在進一步製備一步水性製劑期間的泡沫形成減到最少的量與中間組合物混合；將足量的緩衝劑與中間組合物混合以保持約6-6. 9的 PH ；任選將第二螯合劑加至反應區；然後將第二中間組合物的溫度升高到約60-95°C達約 1-30分鐘，並使溫度降至環境條件；然後任選讓C^6醇與反應區中的內容物混合；和任選調節 pH 至約 6. 4-6. 9。在另外的實施方案中，本發明提供用於製備適合自懷疑含有核酸的生物樣品或樣本獲得多核苷酸群的一步水性製劑的方法。該方法通常涉及至少以下步驟a)讓樣品與以下量的一步水性製劑接觸，所述量有效於i)至少基本上殺滅樣品中潛在的有傳染性的病原體或使其失活；ii)至少裂解部分細胞以自樣品釋放RNA和/或DNA ；和iii)至少基本上抑制或防止樣品中釋放的多核苷酸進一步水解或酶促降解、修飾或失活，以便自樣品獲得多核苷酸群。優選本發明方法至少包括讓樣品與一定量的一種或多種所揭示的組合物在 O0C -約40°C溫度下(更優選在4°C -約35°C溫度下，還更優選在10°C -約30°C溫度下) 接觸至少M小時的時期，更優選至少48小時、至少72小時、至少96小時或更長的時期，而不導致包含在與所述組合物接觸的樣品中的核酸實質上變質、降解、酶促切割和/或溶核消化、修飾或加工。在某些實施方案中，本發明的方法至少包括讓樣品與一定量的一種或多種所揭示的組合物在約0°C -約40°C溫度下(更優選在約4°C -約35°C溫度下，還更優選在約 IO0C -約30°C溫度下，還更優選在約15°C -約25°C溫度下)接觸至少7天的時期，更優選至少14天、至少21天、至少28天或甚至更長的時期，而不導致包含在如此處理的樣品中的核酸顯著變質、降解、酶促切割和/或溶核加工。應該理解，讓樣品與本發明組合物混合只需要進行短時間，但為了避免立即分離來自樣品的核酸和本發明一步組合物的需要，所有材料可在以上規定的時期保持接觸而沒有任何實質的核酸降解或沒有任何核酸降解。
優選基本上保持自樣品釋放到組合物中的多核苷酸群的完整性，即使是當包含樣品的組合物儲存在環境溫度下和甚至持續延長的時期時，所述時期包括但不限於儲存大於約10天、大於約20天或甚至大於約30天或更長。同樣地，期望基本上保持自樣品釋放到組合物中的多核苷酸群的完整性，即使是當包含樣品的組合物儲存在亞熱帶和熱帶溫度下——甚至持續延長的時期時，所述時期包括但不限於儲存大於或等於約5天、大於或等於約10天、大於或等於約15天或甚至大於或等於約20、約25、約30、約35、約40、約60或約 90天或甚至更長。在本發明方法的實踐中，優選樣品中含有的至少一種或多種生物細胞被基本上裂解以將包含在所述細胞中的至少第一群多核苷酸或第一的多個多核苷酸釋放到組合物中。 優選所揭示組合物的組分足以使所述群從所有或基本上所有的殘留細胞/組織和/或樣品碎片(包括但不限於脂質、磷脂、肽、蛋白質、多糖、脂多糖、多元醇、細胞器、膜組分等等)釋放。亦期望在本發明方法的實踐中，至少一種或多種可能存在於樣品中、樣品上或樣品本身周圍的外源或內源核酸酶，被組合物的一種或多種組分基本上滅活，使得當樣品內含有的生物細胞基本上被裂解以自細胞釋放多核苷酸群時，得到的核酸不會被破壞、損壞或溶核地切割。優選所揭示組合物的一種或多種組分在當DNA酶或RNA酶存在於樣品中時有效破壞、滅活或基本上抑制所述DNA酶或RNA酶的生物活性。還期望在本發明方法的實踐中，當一種或多種目的微生物、病毒、真菌和/或其它病原體或生物體在採集時存在於樣品中、樣品上或樣品周圍時，所述目的微生物、病毒、真菌和/或其它病原體或生物體在與組合物接觸時被裂解、充分滅活或基本上殺死，這便於從業者對樣品的安全處理。優選所揭示組合物的一種或多種組分有效使致病性樣品基本上或優選完全無致病性，而不需要向組合物中加入另外的組分。然而，在某些應用中，還可期望組合物包含一種或多種另外的抗微生物劑、抗病毒劑或抗真菌劑以使其基本上不致病， 因而對用於從業者處理而言為安全的。優選含有樣品的組合物至少充分穩定，以允許組合物中的樣品在周圍環境、接近周圍環境或甚至更冷或更暖條件下儲存至少基本上(或完全)從樣本或樣品採集的時間基本上直到分析或表徵來自樣品中的至少第一群多核苷酸的時間。本文所用「周圍環境溫度」 可指約18°C _25°C的溫度，或在一些實施方案中，更優選從約20°C -約22°C。在某些實施方案中，含有樣品的組合物可在以下溫度儲存至少基本上從採集時間到將自樣品獲得的多核苷酸進一步用一種或多種常規分子生物學方法分離、純化或表徵的時間約0°C -約40°C溫度下，更優選在約4°C -約30°C溫度下，更優選在約10°C -約25°C 溫度下。在某些實施方案中，含有懷疑含有核酸的樣品的組合物將使核酸穩定在如此程度，以致即使組合物在周圍環境、冰箱或零度以下溫度經過長時間的儲存後該核酸也保持至少基本上不被降解(即至少基本上穩定)。期望這一穩定性將提供儲存的樣品中含有的多核苷酸在經過長時間樣品儲存後至少約70%、至少約85%、更優選至少約90%、更優選至少約95 %或甚至更優選至少約98 %不被降解。在某些實施方案中，基本上樣品中含有的所有多核苷酸得以穩定，使得在經處理樣品的採集、裂解、儲存和運輸期間保持多核苷酸的原始完整性。
在某些實施方案中，該方法優選提供自生物樣品製備的核酸群，其中在將樣品最初引到組合物中之後，再將其在組合物中在_20°C到約40°C溫度下儲存至少M、48、72或96 小時或更長的時期之後，樣品中含有的不到約15%的多核苷酸會在樣品採集、裂解、儲存和運輸期間被降解。在相關的實施方案中，該方法優選提供自生物樣品製備的核酸群，其中在將樣品最初引到組合物中之後，再將其在組合物中在-20°C到約40°C溫度下儲存至少M、48、72或 96小時或更長的時期之後，樣品中含有的不到約10%的多核苷酸會在樣品採集、裂解、儲存和運輸期間被降解。同樣地，在本文揭示方法的一些應用中，所揭示組合物的使用將優選提供自生物樣品製備的核酸群，其中在將樣品最初引到組合物中之後，再將其在組合物中在-20°C到約 40°C溫度下儲存至少M、48、72或96小時或更長的時期之後，樣品中含有的不到約5%的多核苷酸會在樣品採集、裂解、儲存和運輸期間被降解。在某些情況下，通過本發明方法製備的核酸群可保持足夠的完整性，使得即使當組合物在0°c到約40°C溫度下儲存數天到數周時間時不超過約或2%的樣品會被降解。 事實上，本發明者已顯示，用所揭示方法分離的核酸樣品以其非降解形式保持至少基本上穩定、優選穩定數周到甚至數月或更長時間，即使是當含有核酸的組合物儲存在10°C到約 40°C溫度下時。在一個優選實施方案中，上述溫度範圍的上限為約37°C，因此本文所用術語 「穩定」，可指上述關於在給定溫度下經歷特定的時長後的核酸群完整性的不同實施方案。本發明的多核苷酸，尤其是可用於製備IPC的多核苷酸，優選至少含有可操作地連接到陽性對照序列(PCS)的第一聚合酶轉錄區。所述區可被可操作地定位在PCS的上遊，使得當適當的聚合酶(例如T3、SP6或T7聚合酶等)與PCS在適當的反應條件下接觸時，擴增PCS。構建體可進一步包含單引物，或作為備選兩條或更多條引物(例如「正向」和 「反向」引物)可用於促進PCS的表達。可用於本發明實踐中的例示性的引物包括但決不僅限於與PCS本身或與PCS的立即上遊(5『)和或下遊(3')區域特異性結合的引物序列。 在闡明性實施方案中，PCS至少含有與第一檢測探針(包括但不限於本文所述的發光的、螢光的、化學發光的或FRET探針)特異性結合的第一區域可用於製備IPC的多核苷酸也可進一步任選包含一種或多種天然的、合成的、同源的、異源的或雜合的啟動子、加強子、調節元件、接頭、間隔基、結合域或轉錄激活位點等。在闡明性實施方案中，本發明者已證明所揭示的樣品採集/運輸介質可成功地用於允許生物樣品採集並儲存數天到數周到數月的時間，即便是當儲存在周圍環境條件下時。因此，所揭示的製劑提供有效的組合物以保持分離核酸群的保真度和完整性長達約1 周、約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7周、約8周、約9周或甚至約10周或更長時間，而樣品中含有的多核苷酸沒有顯著的質量退化。事實上，樣品的長期儲存即使是在周圍環境和接近周圍環境條件下達數月或更長時間也是可能的一這是優於本發明者在本發明期間調查的任何常規商用製劑的重要改進。利用所採集樣本的體外分析獲得的數據表明，採集並儲存於所揭示的採集/儲存 /運輸製劑之一中的樣品，當儲存在溶液中達幾天到幾周到幾個月或更長的時間時，保持基本上不被降解和有功能活性。約1周、約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7周或甚至約8周或更長的時間之後獲得的結果的比較，顯示了該溶液在防止針對分離多核苷酸的大量核酸酶活性以及保護分離的分子免受汙染或分子降解方面的有效性。本發明包括組合物，所述組合物包含a) —種或多種離液劑；b) —種或多種洗滌劑；c) 一種或多種還原劑；d) —種或多種螯合劑；e) —種或多種緩衝液；和f)長約60到 500個核苷酸的分離的單鏈核酸分子，其包含以下核酸區段，所述核酸區段(1)包括與約 12-約40個核苷酸長的標記探針特異性結合的第一序列域，所述標記探針對檢測所述核酸區段有特異性；(2)包括與約20-約40個核苷酸長的正向PCR擴增引物特異性結合的第二序列域；和(3)包括與約20-約40個核苷酸長的反向PCR擴增引物特異性結合的第三序列域；其中第二和第三序列域可操作地定位，以促進在有效擴增所述核酸區段的至少第一部分的條件下自正向及反向引物PCR引導擴增所述至少第一部分；其中在嚴格雜交條件下所述分子基本上不與哺乳動物基因組或對哺乳動物致病的細菌、真菌或病毒基因組結合； 另外其中(a)-(e)以以下量存在於組合物中，當樣品與懷疑含有核酸群的組合物接觸時， 所述量足以使所述樣品中的一種或多種蛋白質變性；使所述樣品中的一種或多種核酸酶滅活；殺死所述樣品中的一種或多種病原體；或防止所述樣品中的一種或多種核酸不被降解。在一個實施方案中，(a)-(e)中的每一項存在於組合物中的量，足以抑制或防止包括單鏈核酸分子在內的核苷酸群在約10°C到約40°C溫度下儲存約1天到約90天的時間時大量降解。在另一實施方案中，a) —種或多種離液劑每種以約0. 5M到約6M的量存在；b) 一種或多種洗滌劑每種以約0. 到約(重量/體積)的量存在；c) 一種或多種還原劑每種以約0. 05M到約0. 3M的量存在；d) —種或多種螯合劑每種以約0. Olm M到約Im M的量存在；e) —種或多種緩衝劑每種以約Im M到約IM的量存在。在又一實施方案中，標記探針至少包括第一小溝結合劑、放射性標記、發光標記、化學發光標記、螢光標記、酶標記、 磁性標記或自旋共振標記或其組合。在一個優選實施方案中，組合物包含a) —種或多種離液劑，包括硫氰酸胍、異氰酸胍、鹽酸胍或其任意組合；b) —種或多種洗滌劑，包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、牛磺脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、脫氧膽酸鹽、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉、N-十二烷醯肌氨酸或其任意組合；c) 一種或多種還原劑，包括2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、二甲亞碸或其任意組合；d) —種或多種螯合劑，包括乙二醇四乙酸、羥乙基乙二胺三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、N，N-雙(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、無水檸檬酸鹽、 檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任意組合；或e) —種或多種緩衝劑，包括三(羥甲基)氨基甲烷、檸檬酸鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、N，N-雙O-羥乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3_雙(三(羥甲基)甲基氨基)丙烷、 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-嗎啉代)丙磺酸、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任意組合。在另一優選實施方案中，組合物進一步包含下列的一種或多種g) —種或多種選自矽酮聚合物、聚山梨醇酯及其任意組合的表面活性劑；h) —種或多種選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇及其任意組合的短鏈烷醇；和i) 一種或多種選自矽酮聚合物、聚山梨醇酯及其任意組合的消泡劑；和它們的任意組合。在再一實施方案中，讓組合物a)緩衝到pH為約6. 0到7. 0 ；b)基本上無RNA酶或DNA酶活性；或c)進一步包含細菌、病毒或真菌來源的分離多核苷酸群，包括RNA、DNA、 PNA或其任意組合。在優選實施方案中，組合物包含a)約4M的硫氰酸胍；約30mM的檸檬酸鈉；約0. 25% (重量/體積)的十二烷基硫酸鈉；約0. 25% (重量/體積)的N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；(ν)約0. IM的2-巰基乙醇；和約0. 1 %的矽酮聚合物(重量/體積)；b) 約3M的硫氰酸胍；約ImM的TCEP ；約IOmM的檸檬酸鈉；約0. 5%的N-十二烷醯肌氨酸；約 0.0002%的矽酮聚合物；約IOOmM的2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1，3-ニ醇(TRIS)；和約 0. ImM的EDTA ；c)約IM到約4M的硫氰酸胍；約0. 5mM到IOmM的TCEP ；約ImM到IOOmM的檸檬酸鈉；約0. 到約的SDS或NLS ；約0. 001%到約0. 0001 %的矽酮聚合物、約IOmM 到約 500mM 的 TRISJ^] 0. ImM 到約 ImM APCA、EDTA、EGTA、HEDTA、DTPA、NTA 或檸檬酸鹽；以及約10%到約25%的乙醇(體積/體積)；或d)約3M的硫氰酸胍；ImM的TCEP ；約IOmM 的檸檬酸鈉；約0. 5%的N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；約0. 0002%的矽酮聚合物；約IOOmM的 TRIS ；約0. ImM的EDTA ；及約10%到約25%乙醇(體積/體積)。在另ー實施方案中，將核酸群採集並保存在包括組合物的單一反應容器中。在又一實施方案中，樣品是臨床的、獸醫的、流行病學的、環境的、法醫的或病理來源的生物樣品；或其中其包含或懷疑含有ー種或多種病毒、細菌、真菌或哺乳動物來源的多核苷酸。在優選的實施方案中，分離的單鏈核酸分子包括下列序列中的至少20個相鄰核苷酸5' -CC CUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCMUUUCAGAGCUCAGCGAGACAGUUUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCG CUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCAGUU-3 『 (SEQ ID NO 2)。在一個實施方案中，每ー種上述組合物適合用於微生物、真菌或病毒感染的診斷或治療。本發明還包括前述實施方案中任一個的組合物在製備用於診斷或治療微生物感染或其ー種或多種症狀的藥物中的用途。在優選實施方案中，本發明用於診斷或治療細菌、 病毒或真菌感染或其ー種或多種症狀。本發明進一歩包括診斷試劑盒或樣品採集系統，其包括a)權利要求1-11中任一項的組合物；和b)利用組合物診斷或治療微生物感染的使用說明。本發明進一歩包括用於提高自懷疑含有多核苷酸的生物樣品獲得純化的多核苷酸群的效率的方法，所述方法包括讓樣品與包含權利要求1-11中任一項的分離單鏈核酸分子的組合物接觸，所用量和接觸時間足以提高自生物樣品獲得純化的多核苷酸群的效率。在一個實施方案中，當包含樣品的組合物在約10°c到約40°C溫度下儲存(a)約7到約 14天的時間或(b)約14到約30天的時間吋，生物樣品中的多核苷酸群的完整性或多核苷酸之一的至少第一序列的保真度至少基本上得以保持。在另ー實施方案中，(a)包含樣品的組合物在約10°C到約40°C溫度下儲存基本上從採集時間到分離、純化或表徵其中的多核苷酸群的時間；或(b)在包含樣品的組合物在約10°C到約40°C溫度下儲存約7到約30 天時間之後，樣品中含有的不到約5%的多核苷酸群被降解。在優選的實施方案中，包含樣品的組合物在(a)約10°C到約40°C溫度下儲存約M到約96小時的時間；或(b)約10°C 到約30°C溫度下儲存約7到約30天的時間。在優選實施方案中，所述方法進ー步包括分析或定量測定自純化樣品獲得的多核苷酸群。在又一實施方案中，定量測定步驟包括測定分子的PCR循環閾值(CT)。本發明還包括自懷疑含有核酸的生物樣品獲得多核苷酸群，其包括讓樣品與一定量的組合物接觸，所述組合物包含約IM到約4M的硫氰酸胍、約0. 5mM到約IOmM的TCEP、 約ImM到約IOOmM的檸檬酸鈉、約0. 到約的N-十二烷醯肌氨酸(darcosine)鈉鹽、 約 0.001% 到約 0.010% 的 10% antifoam A 溶液、約 IOmM 到約 500mM 的 Tris、約 0. ImM到約ImM的EDTAJ^ 10%到約25%的乙醇(體積/體積)以及具有下列序列的核酸分子 5' -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCU ACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3' (SEQ ID NO :2)，其以足以穩定多核苷酸群的量存在，使得包含樣品的組合物在約10°C到約40°C溫度下儲存至少約7到約30天的時間之後，樣品中含有的不到約30%的多核苷酸群被降解。商用製劑和試劑盒本發明還提供採用所掲示的組合物和本文所述的採集/儲存/運輸溶液的試劑盒和樣品採集系統。在特定實施方案中，所述樣品採集系統可包括採集裝置，例如藥籤、刮匙或培養物環；和採集容器，例如含有ー種或多種本文所掲示的組合物的小瓶、試管或樣品杯。採集容器優選為可釋放地開啟(releasably openable)，使得其可被打開以添加ー步組合物並關閉和包裝；可被打開以添加樣品及任選採集裝置的部分，並密封用於儲存和運輸； 或兩種情況都有。採集容器可使用任何適宜的可釋放或可開啟結構，包括但不限於螺帽、彈簧蓋(snap top)、按壓旋轉蓋(press-and-turn top)等等。所述系統亦可進ー步任選包括ー種或多種另外的試劑、儲存裝置、運輸裝置和/或在所述系統中獲得、採集、裂解、儲存或運輸樣品的使用說明。在優選實施方案中，可已經將本發明ー步組合物置於樣品可與之混合的反應區。在所述實施方案中，本發明只需要採集裝置和採集容器。試劑盒也可包括一種或多種分離或提取裝置，以幫助自ー種或多種其它生物分子或樣品組分釋放和/或分離樣品中含有的ー個或多個核酸群或者多種核酸，以獲得至少部分或基本上純化的適合鑑定、檢測或進ー步分子分析的核酸。亦可包裝試劑盒用於商業流通，試劑盒可進ー步任選包括用於樣品或樣本採集、 處理或加工的ー種或多種採集、傳遞、運輸或儲存裝置。所述試劑盒的ー種或多種容器通常可包括至少ー個小瓶、試管、燒瓶、瓶、杯或其它適合的容器或採集裝置，其中可放置ー種或多種組合物，優選適合地分為等份樣用於單個樣本的採集、運輸和/或儲存。試劑盒亦可包括更大的容器，例如箱，其包括上述較小的単獨容器以及其它採集裝置、設備、試劑、使用說明等等。試劑盒也可任選包括ー種或多種另外的緩衝液、化合物或組合物，也可任選進一歩包括詳細說明試劑盒在採集或儲存ー種或多種生物、臨床、診斷、環境、法醫樣品中的ー種或多種用途的ー種或多種使用說明。任選試劑盒也可進ー步提供一旦置於ー種或多種所揭示的組合物中後運輸樣品的使用說明，甚至可包括詳細說明一種或多種採用自樣品或樣本分離的核酸的後續分析方法或測定的使用說明或另外的試劑。所述試劑盒還可包括多種不同採集裝置和採集容器及待包括的任何其它組分，以便可將該試劑盒用於採集來自同一來源或不同來源的多個樣品。在一種商業化應用中，將試劑盒以5套或更多套形式包裝以便於銷售和使用。附圖簡述為了增進對本發明原理的理解，現在要引用在附圖中闡明的實施方案或實施例， 並將使用專門的語言來描述同一內容。然而，應該理解，並非意欲藉此限制本發明範圍。如對本發明相關領域的普通技術人員通常會進行的，考慮所述實施方案的任何變更和進ー步的修改及本文所述本發明原理的任何進ー步應用。以下附圖形成本說明書的部分，並包括以下附圖以顯示本發明某些方面。通過聯合附圖參考以下說明可更好地理解本發明，其中相似的參考數值表示相似的元素，其中


圖1顯示PSS(1型)的提取效率。用完整的甲型流感病毒標準量比較PSS(1型 [本文描述為「一歩+」])與RNAqueous -Micro試劑盒(Ambion，貨號AM1931)提供的裂解液。為了比較，讓ー步製劑或RNAqueous -Micro試劑盒提供的裂解液用於病毒RNA裂解，然後按照廠商方案提取。通過qRT-PCR用例如Applied Biosystems ABI7500序列檢測系統(Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA)處理和分析一式ニ份的反應物；圖2顯示與商業試劑盒比較的PSS(1型)的提取效率。讓用甲型流感(H3N2)或在2006-07時期採集的人臨床甲型流感(HlNl)樣品攻擊的均質棉鼠鼻(*)在PSS中裂解，或用來自以下三種市售試劑盒各自的裂解液、方案及提取程序裂解RNAqUe0US-MiCr0 試劑盒(Ambion)、QiaAmp 病毒微型試劑盒(Viral Mini Kit) (Qiagen)和 AI/NCD MaxMag (Ambion)試劑盒。以比較Ct法用Applied Biosystems ABI7500平臺評估提取效率。當用PSS(描述為「一歩制剤」)代替每ー標準市售試劑盒中提供的各自裂解緩衝液吋， 所檢測的相對Ct分值及病毒拷貝最佳；圖3顯示裸RNA在PSS與Ambion的RNA儲存溶液中的保存的比較。讓單鏈禽 H5RNA在環境溫度02- °C )下儲存在PSS、RNA儲存溶液(Ambion)或水中96小時。用 RNAqueous -Micro試劑盒(Ambion，貨號AM1931)按照廠商推薦方案提取總共5pg的RNA， 隨後用 qRT-PCR 在 Applied Biosystems ABI7500 平臺(Life Technologies)上分析。用絕對定量方法以Ct給出數值；圖4顯示用於臨床診斷採集的PSS包裝形式的實例。樣品採集說明使用臨床採集藥籤(Copan Diagnostics)和含有1. 5mL PSS的5mL採集管；圖5顯示PSS的例示性的商用製劑。描述了三種例示性的商用採集液規格25mL 瓶、5mL和1. 5mL試管；圖6闡明PSS快速殺死微生物的能力。所示為抗甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA)在培養基(TSB)中或在PS溶液中的細胞生長的比較。在 PSS中10秒鐘之後，未檢測到活的細菌病原體；圖7A顯示PSS(1型)中的雞洩殖腔樣本的滅活。PSS(1型)在彡1小時內使微生物製劑滅活。將4份原始雞洩殖腔樣品浸入PSS(1型)(上排)或水(下排)中，隨後塗板到血瓊脂平板上；圖7B顯示PSS在室溫下抑制RNA鹼水解達30天。室溫)下，在PSS (凝膠泳道1和幻和水(凝膠泳道2和4)中孵育RNA，隨後在第O天和第30天進行RT-PCR擴增(1500個鹼基對)。PSS保存了所採集的RNA，並在室溫下防止RNA/DNA降解多達30天；圖8A描述保存於PSS中的甲型禽流感H5 「裸」 RNA模板在RNA/DNA核酸酶中孵育之後的qRT-PCR分析。讓H5 cRNA(2ng)與核糖核酸酶A和Tl以及DNA酶I在37°C孵育1小時，用RNAaqueous -Micro試劑盒(Ambion)提取。每種反應條件包括一式三份反應。與加入的核酸酶保存幹PSS中的裸RNA的qRT-PCR Ct值(平均Ct :22. 88)與等量模板 cRNA對照(平均CTt 23. 70)相近。在沒有PSS的情況下，經過核酸酶消化的模板cRNA反應物幾乎完全被降解了(平均Ct :39.58)；圖8B描述保存於PSS中的甲型禽流感H5「裸」RNA模板在37°C下於RNA/DNA核酸酶中孵育7天之後的qRT-PCR分析和凝膠電泳。讓2ng H5 cRNA與RNA酶A、RNA酶Tl和DNA酶I 一起孵育，7天後用RNAaqueous -Micro試劑盒(Ambion)提取。每個反應包括一式ニ份反應。7天後檢測了與添加的核酸酶保存幹PSS中的裸RNA的qRT-PCR Ct值(平均Ct 33. 51)，在沒有PSS的情況下，經過核酸酶消化的模板cRNA反應物完全被降解了，與 NTC反應相似；圖8C顯示PSS製劑基本上抑制樣品多核苷酸被內源核酸酶消化。擴增後的產物的凝膠電泳。泳道3為來自模板RNA+PSS於37°C下達7天後的PCR產物，泳道5為陽性對照RNA的擴增。泳道5 (無擴增)含有無PSS的RNA ；泳道2和6分別為100_bp的梯條帶和NTC反應；圖9闡明在PSS中獲得的核酸保存優於其它溶液。在環境溫度Q2-25°C )下達 30天，甲型流感病毒RNA的PSS O型及2. 2型)保存與Qiagen AVL緩衝液、乙醇和病毒運輸介質(VTM) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)的比較；圖10顯示在不同溫度下，於PSS (2. 2型)中保存30天的甲型流感病毒的提取效率環境Ql-37°C )；冷凍-解凍(_25°C;32X)；周圍環境溫度)；和泳道5 冷藏 (4°C )；圖11是以TCEP為還原劑用完整甲型流感病毒所作的Ct對摩爾濃度的曲線圖；圖12是以TCEP為還原劑用H5W禽流感ssRNA所作的Ct對摩爾濃度的曲線圖；圖13A和圖1加顯示TCEP和β-ME作為PSS製劑中的還原劑組分之間的比較，用単獨水作為對照。在圖13Α中，使用Η5禽流感RNA，而在圖13Β中使用的是全病毒；圖14Α顯示使用PSS保存來自血液的核酸的研究結果。PPS與QIAamp DNA血液微型試劑盒中的裂解液比較對全血加RNA的提取效率。添加0. Ipg和Ipg的甲型流感RNA， 用PSS或AL裂解緩衝液提取。在兩種RNA濃度下，PSS都產生較優的結果，如通過qRT_PCRCT 分值所表明；圖14B將圖14A中顯示的涉及自血液管提取H5禽流感「裸」 ssRNA的研究數據製成表格。用不同的抗凝血劑，比較PPS與QIAamp DNA血液微型試劑盒中的裂解液對全血加RNA的提取效率。在常見抗凝血劑血液採集管中用血液加RNA，PSS與Qiagen的AL裂解緩衝液相比較優；和圖14C將圖14A中顯示的涉及PSS與商用提取試劑盒儲存試劑^jIAamp Qiagen, Inc.)比較的研究數據製成表格。顯示的是與QIAamp DNA血液微型試劑盒中的裂解液相比的PPS對全血加RNA的提取效率。添加0. Ipg和Ipg的甲型流感病毒RNA，用 PSS或AVL裂解緩衝液提取。在兩種RNA濃度下，PSS都產生較優的結果，如qRT-PCR Ct分值所表明；圖15A和圖15B顯示用對檢測IPC特異的測定來qPCR擴增141個核苷酸的單鏈 DNA。圖15A 用ΙΟ"6到10_13(即8-logs)系列稀釋的DNA模板以一式ニ份反應進行擴増。 圖15B :DNA擴增的IPC標準曲線。測定斜率為-3. 39，用E = 10H/IW)-1計算的PCR效率為 97. 23%。用 Applied Biosystems ABI7500 平臺進行 qPCR ；圖16A和圖16B顯示能夠起IPC作用的130-核苷酸ssRNA載體分子的qRT-PCR擴増。在圖16A中顯示用5皮克(pg) (2.75父107個拷貝)到5阿克(ag)(約2-10個拷貝) 系列稀釋的RNA模板以一式ニ份反應進行擴増。在圖16B中顯示的是擴增載體ssRNA分子的IPC標準曲線。該測定斜率為-3. 144，用E =計算的PCR效率為100%。用
22Applied Biosystems ABI7500 平臺實施 qRT-PCR ；圖17顯示含有合成的ssRNA載體/IPC分子的PSS提高裸RNA病原體靶標的保存。在本研究中，將裸甲型流感RNA模板(1.27ng/yl)加到人鼻洗滌樣本中，並在含(閉合方框)或不含(開ロ環)合成的RNA増加物的PSS中於37°C保存。提取RNA，隨後經由 qRT-PCR檢測。製劑中存在合成的SSRNA載體/IPC分子，既導致樣品多核苷酸的初始提取 (第O天)増加，又導致在延長時期內穩定保存分離的多核苷酸(參見例如第31天)。圖18闡明通過加入合成的ssRNA載體/IPC核酸到PSS製劑中，提高了 PSS穩定及保存溶液中的樣品多核苷酸的能力。在本研究中，讓完整甲型流感病毒在含(閉合方框) 或不含(開ロ環)合成的ssRNA載體/IPC増加物的PSS中於37 °C保存35天。完整流感病毒亦保存到VTM(閉合三角形)中。提取RNA並用qRT-PCR檢測。製劑中存在合成的載體 RNA分子，既導致樣品多核苷酸的初始提取(第O天)増加，又導致在延長時期內穩定保存分離的多核苷酸(參見例如第35天)。圖19闡明合成的ssRNA載體分子在室溫和37°C的穩定性。在本研究中，將合成的 RNA(0. lpg/μ 1)加入到 PSS，在室溫(RT)或 37°C儲存 14 天。使用 Applied Biosystems ABI7500平臺用IPC測定測量RNA的穩定性作為qRT-PCR的函數。合成的RNA在RT和37°C 於14天期間穩定，無顯著的Ct值損失。顯示一式ニ份反應的平均值。闡明性實施方案的詳述以下闡述本發明闡明性實施方案。為簡明目的，並不是實際執行的所有特徵都在本說明書中闡述。當然應該理解，在所述任何實際實施方案的開發中，必須做出很多具體的執行決定，以實現開發者的特定目標，例如與系統相關及商業相關約束的順從性，其在不同執行中會有變化。同樣，應該理解儘管所述開發努力可為複雜或費時的，但對受益於本公開內容的本領域普通技術人員而言這些仍然是常規工作。當樣品或樣本位於距離檢測設施遙遠的地理區域吋，本公開製劑賦予的延長的穩定、採集、運輸和保存尤其有利。遠程位置亦稱為現場地點，包括通常不能實施診斷檢測的多種環境。這些地點包括醫生辦公室、傷員檢別分類中心、機場、邊境、爆發區域及多種戶外場所。所掲示的組合物和其使用方法對以下區域提供特別的優點，在該區域中無法獲得電和/或冷蔵，或獲得途徑不穩定。因為在室溫下的延長穩定性，可自任何遠程場所採集樣品，例如但不限於在非洲瘧疾爆發位點，並可將樣品運輸到美國或歐洲用於實驗室診斷分折。因為所掲示的採集製劑在室溫或以下溫度穩定，優選即使在熱帶或亞熱帶溫度下也穩定一定時間，所以可將它們常規地帶至現場而不擔心通常可在遠離採集的場所分析樣品之前組分試劑(例如RNA對照)本身降解。本發明組合物可為本文所述的任何合適水性製劑，包括但不限於溶液劑、混懸劑 (包括膠體混懸劑)、漿液、乳劑、勻漿等等。優選水性製劑為溶液劑，因此在整個優選實施方案的詳述中以例示性意義使用術語「溶液剤」，以指任何本發明水性組合物。本發明的重要方面涉及分離的RNA和DNA區段以及重組載體和包含以上的多核苷酸群，並涉及通過應用傳統分子生物學技術創造及利用重組方法來製備RNA載體分子，所述傳統分子生物學技術包括但不限於qPCR、qRT-PCR等等。本發明亦涉及核酸組合物，所述核酸組合物包含但不限幹可用本文所述樣本採集/儲存/運送介質自ー種或多種生物樣品或樣本分離的DNA、RNA和PNA ；或用作載體分子和/或IPC的分離的RNA或DNA區段。本文所用術語「DNA區段」，是指不含特定物種的總基因組DNA的經分離的DNA分子。因此，用本文掲示的組合物之一自生物樣品獲得的DNA區段，是指與哺乳動物或人總基因組DNA分離或自所述總基因組DNA純化的ー種或多種DNA區段。包括在術語"DNA區段"內的有DNA區段和所述區段的較小片段以及重組載體，包括例如質粒、粘粒、噬菌體、
炳母4本同樣，術語「RNA區段」是指不含特定物種的總細胞RNA的經分離的RNA分子。因此，用本文掲示的組合物之一自生物樣品獲得的RNA區段，是指與其它RNA分離或不含其它 RNA的純化的ー種或多種RNA區段(天然來源或人工合成來源)。包括在術語"RNA區段" 內的有RNA區段和所述區段的較小片段。包含分離的和/或純化的多核苷酸的核酸區段，是指基本上與其它天然存在的基因或編碼蛋白質的序列分離的核酸區段，所述其它天然存在的基因或編碼蛋白質的序列可存在於經歷採集和隨後分析的生物樣品中。在特定實施方案中，本發明涉及核酸樣品採集、儲存和運送介質，所述介質包含有助於分離和穩定自所述樣品獲得的核酸的第一載體分子。優選載體分子為單鏈RNA分子， 但在某些情況下，亦可使用RNA RNA或RNA DNA雙鏈體分子。儘管對於常規實施本發明不需要闡明怎樣將外源載體分子和RNA分子摻入到特別是本文所掲示的樣本採集/儲存/運輸製劑中的特定分子機理，但不受任何特定理論的限制，本發明人認為PSS和本文所述相關製劑中存在外源提供的RNA載體分子，有助於當與 PSS接觸時自細胞材料釋放的多核苷酸的沉澱和穩定，並且亦可用作用於以有利於多核苷酸聚集或沉澱的保護性分子形式給釋放的樣品核酸「塗布」或「加覆蓋物」的方法。不管作用機理如何，本發明人證明在製備高質量高保真度的核酸群方面提供優於常規多核苷酸分離溶液的令人驚訝的益處，所述益處免除常規樣品中慣常觀察到的在採集、分離、儲存和運輸過程期間遭受降解和汙染的有害作用。可如下製備載體分子和/或含有IPC的序列用本領域已知的常規方法部分或全部合成，或根據重組分子生物學方法(包括但不限於體外轉錄和/或翻譯方法，例如PCR擴増)製備，或自天然生物學來源(優選自非哺乳動物來源和對哺乳動物物種非致病的來源) 獲得。或者，本發明載體RNA分子可為雜合分子一含有用分子遺傳和重組DNA/RNA領域中的一種或多種常規方法可操作地連接的天然和合成部分兩者。在某些應用中，RNA載體分子可由ー種或多種轉錄起始序列、引物或探針結合域、功能化結合位點、核酸外切酶或核酸內切酶切割位點和/或功能模體或活性位點構成。術語「基本上如SEQ ID NO =X提出的序列」，意指該序列基本上對應於SEQ ID NO X的部分，並具有相當少的與SEQ ID NO :X的核苷酸不同或不為其生物學功能等同物的核苷酸(或在多肽序列情況下為胺基酸)。術語「生物學功能等同物」在本領域良好理解，並在本文中進ー步詳細定義。因此，特別考慮以下序列以用於本發明實施中，該序列與本文提供的一個或多個核苷酸序列具有約85% -約90%或更優選約91% -約95%或甚至更優選約96% -約99%同一性或功能等同性。用於本發明的合適標準雜交條件包括例如，在50%甲醯胺、5XDenhardt氏溶液、 5父55(、251111磷酸鈉、0. 1% SDS和100 μ g/ml的變性鮭魚精子DNA中於42°C雜交16小時，接著用0. 1XSSC、0. 1% SDS溶液在60°C序貫洗滌1小吋，以除去期需量的背景信號。用於本發明的較低嚴格雜交條件包括例如，在35%甲醯胺、5XDenhardt氏溶液、5XSSC、25mM 磷酸鈉、0. 1% SDS和100μ g/ml的變性鮭魚精子DNA或大腸桿菌(E. coli)DNA中於42°C雜交16小吋，接著用0.8XSSC、0. 1% SDS在55°C序貫洗滌。本領域技術人員應認識到，可易於調整條件以獲得所期需的嚴格水平。當然，本發明亦包含與本文提出的ー個或多個特定序列互補或基本上互補的DNA 區段。「互補」的核酸序列為能夠按照標準Watson-Crick互補法則鹼基配對的核酸序列。 本文所用術語「互補序列」，意指基本上互補的核酸序列，如可通過以上提出的相同核苷酸比較來評估，或如按照能夠在相對嚴格條件例如剛剛的上述條件下與本文掲示的一種或多種特定核酸區段雜交所定義的。如上所述，本發明探針和引物可為任何長度。通過為序列分配數值，例如第一個殘基為1，第二個殘基為2等，可提出定義所有引物的算法η 至ljn+y其中η為1到序列的最後數字的整數，y為引物長度減1，其中n+y不超過序列的最後數字。因此，對於25-聚物，探針對應於1-25位、2- 位、3-27位、…等等鹼基。對於 45-聚物，探針對應於1-45位、2-46位、3-47位、…等等鹼基。對於60-聚物，探針對應於 1-60位、2-61位、3-62位、 等等鹼基。在某些實施方案中，採用與合適的可檢測標記(即「標籤」)組合的本發明核酸序列用於測定雜交是有利的。本領域已知各種各樣的合適指示化合物和組合物，其包括但不限於螢光配體、放射性配體、酶配體或其它配體，例如親和素/生物素等，它們能夠被檢測。 在特定實施方案中，人們可期需採用螢光標記或酶標籤(例如脲酶、鹼性磷酸酶或過氧化物酶)取代放射性或其它環境上較不理想的試劑。在酶標籤情況下，已知可採用比色、產色或產螢光指示底物以提供用於檢測人眼可見的樣品的方法，或通過分析方法例如閃爍掃描法、螢光測定法、分光光度法等等來鑑別與含有一個或多個互補或基本上互補的核酸序列的樣品的特異性雜交。—般而言，設想本文所述雜交探針既可用作溶液雜交中(如在PCR中)的試劑用於檢測特定核苷酸，又可用作在採用固相的實施方案中的試劑。雜交後讓核酸引物複合物與促進模板依賴性核酸合成的ー種或多種酶接觸。進行亦稱為「循環」的多輪擴増，直到產生足夠量的擴增產物。接下來檢測擴增產物。在某些應用中，可通過目視檢查來進行檢測。或者，檢測可涉及通過化學發光、摻入放射性標記的放射性閃爍掃描法或螢光標記或甚至通過利用電或熱脈衝信號的系統來間接鑑別產物。可利用多種模板依賴性過程來擴增存在於給定模板樣品中的標記序列。最著名的擴增方法之ー是聚合酶鏈式反應(稱為PCR)，其詳細闡述於美國專利號4，683，195、 4，683，202和4，800，159中，它們每一個都以整體在此引作參考。另ー擴增方法是連接酶鏈反應(「LCR」)，其掲示於例如EPA No. 320308和美國專利4，883，750中，它們每ー個都通過對其明確引用以其整體具體結合於此。等溫擴增方法亦可用於本發明中擴增核酸，在所述方法中將限制性核酸內切酶和連接酶用於實現擴增在限制性位點的一條鏈中含有5' -[α-硫代]-三磷酸核苷酸的靶標分子。鏈置換擴增(SDA)是實施等溫擴增核酸的另ー種方法，所述方法涉及多輪鏈置換和合成，即缺ロ平移。稱作修復鏈式反應(RCR)的相似方法，涉及讓整個擴增的靶向區域的若干探針退火，接著修復反應，其中僅存在四種鹼基中的兩種。為了易於檢測可加入作為生物素化的衍生物的另外兩種鹼基。在SDA中使用相似的方法。亦可用環狀探針反應(CPR) 來檢測靶標特異性序列。在CPR中，讓具有非特異性DNA的3'和5'序列及特異性RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交後用RNA酶H處理反應物，將探針的產物鑑定為消化後釋放的與眾不同的產物作用。原始模板與另ー循環探針退火，反應重複進行。在本發明擴增步驟中亦可使用以下方法，所述方法基於在具有所得「ニ-寡核苷酸」的序列的核酸存在下兩種(或更多種)寡核苷酸的連接，藉此擴增所述ニ-寡核苷酸。在任何擴增後，可期需自模板和過量引物分離擴增產物，用於測定是否出現特異性擴增。在一個實施方案中，用本領域普通技術人員已知的常規方法，通過瓊脂糖電泳、瓊脂糖-丙烯醯胺電泳或聚丙烯醯胺凝膠電泳分離擴增產物。多核苷酸和寡核苷酸組合物本文所用「核酸」或「多核苷酸」組合物，包括但不限於含有單鏈或雙鏈多核苷酸的那些，例如脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)或其任何組合或衍生物(包括例如基因組的、基因組外的、質粒、粘粒、重組體、人工的和/或合成的)。所述序列可為編碼或非編碼序列、有義、無義或反義序列，可以但不必一定存在於ー個或多個多核苷酸群或眾多多核苷酸(本發明中的任ー種)中，多核苷酸可以但不必與其它分子和/或支持物質連接。同樣，本發明多核苷酸，尤其是在所掲示的樣本採集/運輸介質中作為載體多核苷酸或IPC分子起作用的多核苷酸，不必與本文闡明的本發明的各種實施方案中採用的特定序列同一或甚至基本上同源。儘管本發明人闡明利用特定DNA和RNA對照序列作為以下工具，其用於監測所採集、運輸或儲存在本文所述組合物中的多核苷酸的完整性和質量，並優選增加所述多核苷酸的穩定性，但所述對照序列不必含有所採用的特定核苷酸序列。事實上，在某些情況下，在所掲示的採集/運輸/儲存組合物中用作內部對照序列的多核苷酸，可包含可為所述目的獲得、製備、修飾或合成的任何合適序列。此外，優選所述內部對照序列與試圖用所掲示的製劑鑑別的病毒、細菌、真菌或其它病原物種沒有顯著的同源性或同一性。或者，適合作為IPC的多核苷酸可與ー個或多個本文掲示的例示性IPC序列同源或甚至基本上同一，因此可能能夠與本文掲示的特異性IPC序列之一(或其互補序列)在中嚴格性、高嚴格性和/或甚至極高嚴格性雜交條件下雜交。認為用於核酸雜交的方法對分子生物學領域的普通技術人員為日常工作，因此， 本文無需提供使用所述方法的分析方法的詳細論述。然而，作為指導，本領域通常認為由kuthern等推廣的「中嚴格性」雜交條件包括，例如在含有約5X標準檸檬酸鈉緩衝劑 (SSC)、0· 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)U. OmM乙ニ胺四乙酸(EDTA)(例如pH 8. 0)的溶液中預洗滌；在約50°C-約60°C溫度於5X SSC過夜雜交；接著在約60_65°C用含有0. 1%SDS的 2X、0.5X和0.2X SSC中的每ー種洗滌2次20分鐘。同樣，「嚴格性」雜交條件通常包括例如在含有約5X SSC,0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)的溶液中預洗滌；在約60°C -約70°C的溫度於5X SSC過夜雜交；接著在約65-70°C用含有0. 1 % SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC中的每ー種洗滌2次20分鐘。同梓，「高嚴格性」雜交條件的代表性實例包括但不限於在含有約5X SSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)的溶液中預洗滌；在約70°C -約75°C的溫度於5X SSC過夜雜交；接著在約70°C -約75°C用含有0. 1 % SDS的2X、0. 5X和0. 2X SSC中的每ー種洗滌2次20分鐘。本領域普通技術人員亦應理解，由於遺傳密碼簡併的結果，編碼給定一級胺基酸序列的核苷酸序列有很多。這些多核苷酸中的某些與任何天然基因的核苷酸序列具有極小的同源性。雖然如此，由於密碼子使用差異而變化的多核苷酸明確涵蓋在本發明中。可通過常規分子生物學重組方法來製備IPC，或作為備選可通過包括化學合成 (例如固相亞磷醯胺化學合成)等等在內的本領域已知常規方法全部或部分合成IPC。亦可用標準誘變技術例如寡核苷酸定點特異性誘變在多核苷酸序列內引入修飾。亦可直接合成用於IPC的RNA分子，或作為備選通過用合適系統(例如T3、T7和SP6聚合酶等等)體外或體內轉錄DNA序列來製備。可對本發明多核苷酸尤其是用於製備IPC的多核苷酸，進行修飾以提高體外和/ 或體內的穩定性。所述修飾包括但不限幹將側翼序列加到5'-端、3'-端或兩端；在骨架中使用磷代磷酸酯或2' -ο-甲基而不是磷酸ニ酯酶連接；和/或包含非傳統鹼基，例如肌苷、辮苷(queosine)和wybutosine以及腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙醯基-、甲基-、硫代-或另外的修飾形式或其任何組合。可用確定的重組技術讓本文所述核苷酸序列與多種其它核苷酸序列結合或連接。 例如，可通過克隆到多種克隆載體中的任一種來產生用作IPC的多核苷酸，所述克隆載體包括質粒、噬菌粒、λ噬菌體衍生物和粘粒中的ー種或多種。特定目的的載體包括表達載體、複製載體、探針產生載體和測序載體。一般而言，載體應含有在至少ー種生物體中有功能的複製起點、適宜的限制性內切核酸酶位點和一種或多種選擇標記。其它元件將視所期需用途而定，對於本領域普通技術人員顯而易見。或者，可通過ー種或多種模板依賴性的或擴增子指引的重組製備方法來製備IPC序列。在特定實施方案中，本發明提供多核苷酸組合物，可將所述組合物加到所掲示的採集/儲存/運送介質中，以提供ー種或多種IPC來監測本文採用的取樣/儲存/和運送過程的保真度及完整性。所述多核苷酸組合物可含有可結合特定聚合酶、寡核苷酸引物和 /或重組探針的ー種或多種序列域。在闡明性實施方案中，可採用例示性IPC，其含有陽性對照序列(PCS)，所述PCS可用一種或多種特異性擴增引物序列擴增，並用與所述PCS的至少第一序列域特異性雜交的一種或多種寡核苷酸探針檢測和/或定量測定。在某些實施方案中，可利用檢測探針，其採用螢光、化學發光或FRET-特異性檢測方法來檢測和/或定量測定給定樣品中的PCS量。樣品中PCS的檢測可提供用於監測本文採用的一步採集/儲存 /運輸溶液的有效性及保真度的內部參考標準。可設計本發明寡核苷酸引物和探針用於選擇性擴增和檢測ー種或多種PCS。所述引物序列適合用於雜交方法和擴增方法，例如基於PCR的擴增方法(包括例如實時PCR分折、RT-PCR等等)。同樣，所掲示的寡核苷酸檢測探針適於用適當的標記來標記，以用於檢測並定量測定用ー對或多對本文掲示的擴增引物擴增核酸而產生的產物。當用適當標記來標記時，寡核苷酸檢測探針尤其適合包含在採集/儲存介質(包括但不限於PSS製劑)中的IPC-特異性核苷酸序列的基於螢光的檢測，包括例如經由基於FRET的分析。FRET-標記的檢測探針尤其可用於螢光測定檢測方法，包括例如基於FRET 的微體積螢光測定設備。在聯合的實時PCR/基於FRET的微體積螢光測定方法(實時 PCR-FRET)中，和具體地在由 Idaho Technology, Inc. (Salt Lake City,UT,USA)開發並且目前由 Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA)製造並銷售的「 LightCycler 」 儀器促進的分析中，特別考慮使用一種或多種擴增和檢測寡核苷酸。內部陽性對照(IPC)序列在闡明性實施方案中，本發明亦提供IPC序列，所述IPC序列包含以下核酸序列、 基本上由以下核酸序列組成或由以下核酸序列組成，所述核酸序列優選與以上掲示的任何 ー個或多個序列尤其是SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 13中的任ー個所掲示的序列有至少約 80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或更多同一性。在相關實施方案中，本發明亦提供IPC序列，所述IPC序列在體外用包含以下核酸序列、基本上由以下核酸序列組成或由以下核酸序列組成的模板擴增子合成，所述核酸序列優選與來自SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:14到SEQ ID NO :23所掲示的序列中的任何 ー個或多個的至少30個鄰接核苷酸序列有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%或更多同一性。多核苷酸擴增試劑盒本發明亦提供用於檢測和/或擴增IPC、尤其是包含在本文掲示的製劑之一中的 RNA或DNA IPC序列的試劑盒，所述製劑包括但不限於PSS製劑。所述試劑盒通常包含對擴增IPC特異性序列所必需的兩種或更多種組分，所述組分可為化合物、試劑、容器和/或設備。例如，試劑盒內的ー種容器可含有第一引物，而試劑盒內的第二容器可包含第二引物。 試劑盒內的第三容器可含有雜交探針組或用於標記所述探針的一種或多種螢光探針。另外，本發明試劑盒亦可包含使用說明，例如在本文所述擴增和/或檢測反應中使用引物的使用說明，以及ー種或多種螢光分子或可能必需的其它試劑，包括例如但不限於緩衝劑酶、 聚合酶、RNA酶等等。本發明提供一種或多種載體RNA或DN組合物連同一種或多種採集/運輸/儲存溶液(包括但不限於PSS製劑)或相容的賦形劑、緩衝劑載體、稀釋劑、輔助劑和/或其它組分，如可用於分離、檢測、擴增或定量檢測診斷工具。基於實時PCR的FRET檢測在文獻中很好地闡述了實時PCR和FRET方法(參見例如美國專利號4，996，143、 5，565，322,5, 849，489,6, 162，603，其每ー專利都通過對其明確引用以其整體具體結合於此)。LightCycler 平臺代表遺傳突變篩選和分析中的重要突破。該系統併入可在不到20分鐘內實施30個聚合酶鏈式反應(PCR)循環的快速氣動熱循環儀器。其利用在線微體積螢光計來檢測並定量測定螢光標記的雜交探針，提供確定解鏈曲線分析必需的數據。LightCycler 平臺提供革新的儀器來促進遺傳分析工具的開發，並提供用於測定特定核苷酸序列和遺傳突變的快速定量方法。可在製造商網站和產品應用手冊中找到儀器在擴增和檢測方法中的詳細應用。該技術亦闡述在包括例如PCT國際專利申請公開號WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712 (每ー專利都通過對其明確引用以其整體具體結
28合)中。用於臨床診斷實驗室的樣本採集在需要檢測潛在的少量來自包括病毒在內的病原體的核酸的診斷平臺或分子方案中採集是第一歩。為了促進基於核酸的檢測策略的動態進步及將其整合到主流診斷實驗室，對可靠健全和標準化的採集系統有巨大需要，所述採集系統明確針對下遊基於核酸的檢測例如前述平臺來開發。本發明可備選地適合從醫生辦公室或手術室運輸核酸，或作為備選運輸到區域中心，例如醫院。臨床或獸醫樣本或法醫或環境樣品採集系統可包括一種或多種採集工具和ー種或多種試劑，用於有效地1)獲得超過本領域目前可獲得的高收率的合適樣本；2)使潛在的感染性生物學病原體失活，以使其不再有活力，並可對其進行處理； 在最不擔心病原體釋放或汙染的情況下運輸或輸送；或3)在環境溫度下長時間有效穩定並保存來自水解或核酸酶降解的裂解的 『裸』RNA/DNA聚合物，直到可在診斷實驗室處理樣品；並且優選用於達到這些目標中的兩個或更多個或全部三個。如上所述，本發明樣品採集/運輸/儲存溶液可優於先前技術可獲得的溶液提供許多明顯改迸。例示性益處包括但不限於以下ー種或多種■使微生物、病毒或病原體失活、殺死和/或裂解；■使外源性或內源性核酸酶受到破壞和/或失活，所述酶包括但不限於RNA酶和 /或DNA酶；■與多種常規核酸提取、純化和擴增系統相容；■保存樣品內RNA和/或DNA的完整性；■促進在環境溫度的運輸和運送，甚至是在延長時間或極端溫度變化下；和■適合短期(幾小時到幾天)、中期(幾天到幾個星期)或長期(幾個星期到幾個月)儲存分離的核酸。所掲示的組合物尤其非常適合現場護理、野外研究、居家衛生保健或測試、傷員檢別分類/突發事件和傷亡評估、流動法醫、病理學、流行病學取樣、犯罪現場調查、親子鑑定、孕前和孕後遺傳篩選、強姦/亂倫檢驗、家庭諮詢、性傳播疾病(包括但不限於HIV、梅毒、衣原體、淋病和其它性病等等)的秘密檢測。同樣，所掲示的組合物亦可尤其適合用於國內外人或動物群體流行病或大流行病的監測、病因學和控制，包括採集和分析含有流感病毒的樣本；尤其是用於預測及控制病毒的「變換和漂移(drift) 」和鑑別或管理發生的或發展中的流行病、大流行病等等。在某些實施方案中，用本發明方法分離的核酸可在一種或多種隨後的分子生物學應用、測定或技術中起模板的作用，所述應用、測定或技術包括但不限於遺傳指紋識別； 擴增片段長度多態性(AFLP)PCR;限制性片段-長度多態性分析(RFLP)；等位基因特異性寡核苷酸分析(ASOA)；微衛星分析；DNA雜交；RNA雜交；可變數目串聯重複(VNTR)PCR ；點印跡雜交；聚合酶循環組裝(PCA)；嵌套PCR;定量PCR(qPCR)；不對稱PCR ;DNA足跡法；單核苷酸多態性(SNP)基因型分型；逆-轉錄PCR(RT-PCR)；多重PCR(m-PCR)；多重連接依賴性探針擴增(MLPA)；連接介導的PCR(LmPCR)；甲基化特異性PCR(MPCR)；解旋酶依賴性擴增(HDA)；重疊延伸PCR(OE-PCR)；全基因組擴增(WGA)；質粒分離；等位基因擴增；位點定向誘變；高通量遺傳篩選；等等，或其任何組合。在一個實施方案中，樣本採集/儲存/運輸製劑保存、延長、促進或保持自樣本釋放的多核苷酸群中的至少第一核酸的穩定性達延長的時期，尤其是例如大大長於由常規樣品採集介質提供的時期。優選在不需要冷藏或冷凍採集的樣品情況下，甚至是當樣品在周圍環境條件下採集或儲存時，組合物在以下時期內促進來自所述分離的多核苷酸群內的ー種或多種核酸區段的保存和穩定，所述時期包括但不限於至少約7天、優選至少約14天、更優選至少約21 天和還更優選至少約觀、35、42、56、63或約70天或更長。當所述樣品在遠程位置或在溫帶、 亞熱帶或熱帶氣候中採集或儲存時，尤其期需所述改善的樣本保存特性。在另ー實施方案中，本發明提供製備來自生物學來源的樣品的核酸的所掲示組合物在不需要將樣品儲存在冷藏或冷凍的條件下在延長期內保持包含在自樣品釋放的多核苷酸群內的ー種或多種核酸的完整性和保真度方面的用途，所述延長期包括但不限於至少約5天、至少約10天、優選至少約15天、更優選至少約20天或還更優選至少約25天或更
37 ο自實施所掲示的方法獲得的核酸有利地與許多常規分子和診斷分離、純化、檢測和/或分析方法相客。所掲示的組合物促進穩定的基本上不降解的多核苷酸群回收儲存和運輸，用於多種隨後的方法，所述方法包括但不限於核酸分離、純化、擴增和分子分析和/ 或診斷檢驗、測定、分析或表徵等等。本發明例示性商業試劑盒以下概要提供採用本發明PSS製劑的例示性商業試劑盒(圖5)。剝離-小袋(PEEL-POUCH)採集系統含有1. 5mL PrimeStore 溶液的 5_mL管；採集拭子(例如FlockedSWABS [Copan Diagnostics, Inc.，Murrieta，CA, USA])；和用於採集和/或處理樣品的使用說明。(例如以50個小袋/単位包裝)(參見圖4A、圖4B、圖4C、圖4D和圖4E關於所述系統的示意性展示)°PRIMESTORE 儲液調配後I^imeStore 儲液在4°C或以下穩定至少1年或更長時間。亦顯示調配的 I^imeStore 溶液在環境溫度(例如約20_30°C )下穩定數個月。樣品與本文掲示的I^rimeStore 製劑接觸後，可合理地預期其可在0°C或以下溫度無限期地儲存，在冷藏(例如 40C )下儲存至少1年或更長時間，在環境溫度(例如約 20-30°C)下儲存至少30天或更長，而不會顯著損失樣品的核酸組成、保真度或完整性。例如但不限幹，當包含樣品的組合物儲存在約-20°C到約40°C溫度約30天-約60天吋，自樣品獲得的多核苷酸群的完整性至少基本上保持並優選完全保持而無可檢測的降解。用於環境樣品的採集試劑盒所掲示用於採集環境樣品的製劑的例示性商業包裝包括但不限於含有有效量儲存溶液的採集容器(例如0. l-,ο. 2-,0. 5-、1-、2-或3-!11し採集小瓶，各自含有0. ImL, 0. 2mL、0. 25mL、0. 5mL、0. 75mL或ImL PrimeStore 溶液)；和用於採集和/或處理樣品的使用說明。可視推薦的一種或多種樣本或一種或多種採集方法而定按需要確定採集容器的大小，或以或大或小的尺寸來包裝。在某些應用中，亦可期需將單獨採集裝置包裝到多個容器 (包括但不限於含有例如10或20個採集裝置/単位包裝的商業包裝)中。序列比較、同一性和同源性在兩個或更多個核酸或多肽序列情景中的術語「同一的」或「同一性」百分比，是指以下兩個或更多個序列或子序列，其當用下述序列比較算法(或普通技術人員可獲得的其它算法)之一或通過目視檢查來比較及比對最大一致性時為相同的，或具有規定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸。在兩種核酸情景中的術語「基本上同一的」，是指以下兩個或更多個序列或子序列，其當用序列比較算法或通過目視檢查來比較及比對最大一致性吋，具有以下核苷酸殘基同一性至少約90%、優選91%、最優選約92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 98. 5%,99%,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4%,99. 5 %,99. 6 %,99. 7 %,99. 8 %,99. 9 %^； 更多。通常認為所述「基本上同一的」序列是「同源的」，而不必參考實際的祖先。對於序列比較和同源性測定，通常將ー個序列用作與測試序列比較的參考序列。 當使用序列比較算法吋，將測試序列和參考序列輸入電腦，指定子序列坐標，若需要時則指定序列算法程序參數。然後可基於指定的程序參數將序列比較算法用於計算相對於參考序列的所述測試序列的序列同一性百分比。可如下進行用於比較的序列的最佳比對例如通過局部同源性算法(參見例如 Smith和Waterman，1981)、通過同源性比對算法(參見例如Needleman和Wunsch，1970)、 通過搜尋相似性比較方法(參見例如Pearson和Lipman，1988)、通過算法的計算機化執行例如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA)或通過目視檢查。適於測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的ー個實例是BLAST算法(Altschul等，1990)和BL0SUM62記分矩陣(參見例如Henikoff和Henikoff，1989)。用於實施BLAST分析的軟體可通過國立生物技術信息中心 ι www, ncpi. nlm. nih. gov/)公開犾得。除了計算序列同一性百分比外，BLAST算法亦進行兩個序列之間的相似性的統計學分析(參見例如Karlin和Altschul，1993)。有用的序列比對算法的另ー實例為PILEUP 程序，其用漸進的逐對比對自相關序列組產生多重序列比對。其亦可繪製顯示用於產生比對的聚類關係的樹形圖。PILEUP使用簡化的漸進比對比較方法(參見例如!^eng和 Doolittle, 1987)，並採用類似於Higgins和Sharp (1989)闡述的通用比對矩陣。例示性定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的一祥的含義。儘管可在本發明實行或測試中使用與本文所述類似或等同的任何方法和組合物，但在本文中描述優選方法和組合物為。為本發明目的，以下術語如下定義本文所用術語「約」和「大約」可互換，通常應該理解為指給定數值附近的數值範圍以及數值的所述範圍內的所有數值(例如除非另外指出，否則「約5-15」意指「約5-約 15」)。此外，本文所有數值範圍應該理解為包括範圍內的每ー個整數。本文所用術語「載體」意在包括任何一種或多種溶劑、分散介質、ー種或多種塗層、 ー種或多種稀釋劑、ー種或多種緩衝劑、ー種或多種等滲劑、ー種或多種溶液、ー種或多種混懸液、ー種或多種膠體、ー種或多種惰性劑等等或其組合，它們如使用的話對於給予相關動物為藥學上可接受的或對於診斷目的為可接受的。通常用於化學化合物和具體用於肽及表位的一種或多種遞送溶媒的使用，為藥物領域普通技術人員所熟知。任何常規介質或作用劑除了與活性成分不相容的情況外，否則考慮其在診斷、預防及治療組合物中的應用。亦可將ー種或多種補充活性成分摻入ー種或多種所掲示的免疫原性組合物中或與所述組合物聯合給予。本文所用術語「核酸」包括ー種或多種以下類型聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)和任何其它類型的多核苷酸，其為嘌呤或嘧啶鹼基或修飾的嘌呤或嘧啶鹼基(包括無鹼基位點)的N-糖苷。本文所用術語「核酸」亦包括核糖核苷或脫氧核糖核苷的聚合物，核糖核苷或脫氧核糖核苷通常經由亞単位之間的磷酸ニ酯鍵但在某些情況下經由硫代磷酸酷、甲基膦酸酯等等共價鍵合。「核酸」包括單鏈和雙鏈DNA以及單鏈和雙鏈RNA。例示性核酸包括但不限於gDNA ；hnRNA ；mRNA ；rRNA、tRNA、 微小RNA(miRNA)、小幹擾RNA(siRNA)、核仁小RNA(snORNA)、核內小RNA(snRNA)和小時序 RNA(StRNA)等等及其任何組合。本文所用術語「蛋白質」、「多肽」和「肽」可互換使用，包括包含至少ー個將兩個或更多個胺基酸殘基連接在一起的醯胺鍵的分子。一般而言，儘管可互換使用，但肽為相對短 (例如2-約100個胺基酸殘基長)的分子，而蛋白質或多肽為相對較長的聚合物(例如100 或更多個殘基長)。然而，除非由鏈長明確限定，否則術語肽、多肽和蛋白質可互換使用。本文所用「樣品」包括含有或假定含有目的物質的任何東西。因此其可為含有核酸、蛋白質或另一目的生物分子的物質的組合物。因此術語「樣品」可包括包含核酸群(基因組DNA、cDNA、RNA、蛋白質、其它細胞分子等)的溶液、細胞、組織或所述溶液、細胞、組織中的ー種或多種的群。術語「核酸來源」、「樣品」和「樣本」可以以廣泛含義在本文互換使用，意欲包括含有核酸、蛋白質、一種或多種其它目的生物分子或其任何組合的多種生物學來源。例示性生物樣品包括但不限於全血、血漿、血清、痰、尿、糞便、白血細胞、紅血細胞、 血沉棕黃層、拭子(包括但不限於口腔拭子、咽喉拭子、陰道拭子、尿道拭子、子宮頸拭子、 直腸拭子、病灶拭子、膿腫拭子、鼻咽拭子等等)、尿、糞便、痰、眼淚、黏液、唾液、精液、陰道分泌物、淋巴液、羊膜液、脊柱液或腦脊液、腹膜積液、胸腔積液、滲出物、穿刺液、上皮塗片、 活檢、骨髓樣品、囊腫或膿腫內容物流液、滑液、玻璃體液或房水、眼洗出物或抽吸物、肺灌洗液或肺抽吸物和器官及組織，包括但不限於肝、脾、腎、肺、腸、腦、心、肌肉、胰腺等等及其任何組合。在一些實施方案中，樣品可為或可來自作為載體的生物體，例如蚊子或蝨子或其它ー種或多種昆蟲。包括移植材料、原代細胞、繼代細胞系等等在內的組織培養細胞，以及自任何細胞獲得的裂解物、勻漿、提取物或材料，亦在本文所用術語「生物樣品」含義內。可存在於生物樣品上或內的以下生物體亦在本發明範圍內，正如自臨床或法醫環境獲得的含有ー種或多種核酸的任何材料亦在本發明範圍內一祥微生物(包括但不限於原核生物，例如古細菌和真細菌；藍細菌；真菌、酵母、黴菌、放線菌；螺旋菌和支原體)；病毒(包括但不限於正嗜肝病毒屬[包括例如甲、乙和C型肝炎病毒]、人乳頭瘤病毒、黃病毒屬[包括例如登革病毒]、狂犬病毒屬[包括例如狂犬病毒]、麻疹病毒屬[包括例如麻疹病毒]、單純病毒屬 [包括例如單純皰疹病毒]、多瘤病毒屬、腮腺炎病毒屬[包括例如腮腺炎病毒]、風疹病毒屬[包括例如風疹病毒]、水痘病毒屬[包括例如水痘病毒]、輪狀病毒、冠狀病毒、巨細胞病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、杆狀病毒、細小病毒、逆轉錄病毒、牛痘病毒、痘病毒等等)、藻類、原生動物、原生生物、植物、苔蘚類植物等等及任何前述任何組合。普通技術人員亦應理解，自任何以上例示性生物樣品獲得的裂解物、提取物或材料亦在本發明範圍內。本文所用術語「緩衝劑」包括一種或多種組合物或其水溶液，其當將酸或鹼加入到包含所述緩衝劑的溶液或組合物中吋，抵抗PH波動。這種對pH變化的抵抗是由於所述溶液的緩衝特性，其可以是包含在組合物中的ー種或多種特定化合物的功能。因而，表現出緩衝活性的溶液或其它組合物被稱為緩衝劑或緩衝溶液。緩衝劑通常不具有無限保持溶液或組合物的PH的能力；更準確地說，它們通常能夠保持pH在某些範圍內，例如pH約5-7。本文所用術語「生物分子」是指在細胞中存在的或包括病毒在內的活生物體產生的任何分子。這可包括但不限於核酸、蛋白質、碳水化合物和脂質。本文所用「細胞」是指能夠獨立發揮功能的生物體的最小結構單位，其由細胞質及由細胞膜包圍的各種細胞器組成。這可包括但不限於獨立起作用的細胞，例如細菌和原生生物；或生活在較大生物體內的細胞，例如白細胞及紅細胞。本文所定義的細胞可不具有細胞核，例如成熟人紅血細胞。本發明實施中的樣品可新鮮使用，或可在儲存一段時間或延長時期後使用，包括例如低溫保存、冷凍或冷藏的樣品等等，並可包括臨床、獸醫、環境或法醫來源的材料，可分離自食品、飲料、給料、飲用水來源、廢水流、エ業廢物或廢液、天然水來源、土壌、空中傳播來源、大流行群或流行群、流行病學樣品、研究材料、病理學樣本、懷疑的生物恐怖活動製劑、犯罪現場證據等。本文所用術語「患者」(亦可互換稱為「宿主」或「受試者」)，是指可作為本文所述的 ー種或多種生物樣品或樣本來源的任何宿主。在某些方面，供者為脊椎動物，其意在表示任何動物物種(並優選哺乳動物物種，例如人)。在某些實施方案中，「患者」是指任何動物宿主，包括但不限於人和非人靈長類、禽類、爬行動物、兩棲動物、牛、犬、山羊(caprines)、 cavines、烏鴉、印ines、馬、貓、山羊(hircines)、母兔(Iapines)、野兔、狼、鼠、綿羊、豬、 racines、狐狸等等，包括但不限於家畜、群畜或遷移動物或鳥類、外來動物(exotics)或動物學樣本以及伴侶動物、寵物和在獸醫從業人員照顧下的任何動物。本發明亦可用於對多種全球種群監測疾病爆發、進展及流行病學統計，包括但不限於有蹄類動物的消耗性疾病、 結核病、依波拉病、SARS和禽流感。在某些實施方案中，樣品優選為哺乳動物來源，更優選人來源。本文所用術語「離液劑(chaotrope或chaotropic agent) 」，包括如下在蛋白質或核酸中引起混亂的物質通過例如但不限於改變蛋白質或核酸的ニ級、三級或四級結構同時保留ー級結構的完整。本文所用術語「例如」僅當作舉例使用，沒有限制目的，不應該解釋為僅提及明確列舉的那些項目。本文所用術語「基本上不含」或「本質上不含」，通常意味著組合物含有小於約10% 重量，優選小於約5%重量，更優選小於約重量的化合物。在優選實施方案中，這些術語是指小於約0. 5%重量，更優選小於約0. 重量或甚至小於約0. 01%重量。所述術語也包括完全不含化合物或其它規定性質的組合物。關於降解或變質，術語「基本上」亦可指上述重量百分比，使得防止基本上的降解應指小於約15%重量、小於約10%重量、優選小於約5%重量等因降解而損失。在其它實施方案中，這些術語僅指百分比而不是重量百分比，例如關於術語「基本上非致病的」，其中術語「基本上」是指留下小於約10%、小於約5%等致病活性。本文所用術語「異源的」是就與預定參考核酸序列的關係來定義。例如，關於結構基因序列，將異源啟動子定義為天然不存在於參考結構基因鄰近但以ー種或多種實驗室操作人工放置的啟動子，所述操作為由分子生物學領域普通技術人員常規採用的操作。同樣， 將異源基因或核酸區段定義為天然不存在於參考序列、啟動子和/或增強子元件等鄰近的基因或核酸區段。本文所用術語「同源性」是指兩個或更多個多核苷酸或多肽序列之間的互補性程度。當第一核酸或胺基酸序列與第二核酸或胺基酸序列具有確切相同的ー級序列吋，措辭 「同一性」可取代措辭「同源性」。可通過用本領域已知的算法及電腦程式分析兩種或多種序列來測定序列同源性和序列同一性。可用所述方法來評估給定序列是否與另一所選的序列同一或同源。本文所用「同源的」當提及多核苷酸時意指儘管由不同來源產生但具有基本上相同的核苷酸序列的序列。通常同源核酸序列起源於擁有ー個或多個基本上相似的基因組序列的緊密相關基因或生物體。相比之下，「同功的」多核苷酸為與來自不同物種或生物體的多核苷酸共有相同的功能的多核苷酸，但其可具有顯著不同的一級核苷酸序列，所述ー級核苷酸序列編碼實現相似功能或具有相似生物學活性的ー種或多種蛋白質或多肽。同功多核苷酸通常可源自非緊密相關(例如遺傳或系統發生上)的兩種或更多種生物體。在兩種或更多種核酸或多核苷酸序列情境中術語「同一的」或「同一性」百分比，指以下兩個或更多個序列或子序列，其當在比較窗口內比較並比對最大一致性時，為相同的或具有規定百分比的相同核苷酸，如用序列比較算法或通過手工比對和目視檢查來測定。「引物」或「引物序列」可包括與互補模板核酸鏈(「靶標序列」)選擇性雜交並用作添加核苷酸的起始點以複製模板鏈的任何核酸序列或區段。本發明引物序列可被標記或含有其它修飾，這使得可檢測和/或分析擴增產物。除了充當靶標DNA序列的聚合酶介導複製的起始物外，還可將引物序列用於將模板RNA逆轉錄為相應的DNA。 本文所用「靶標序列，，或「靶標核苷酸序列，，包括在以下條件下所述弓I物序列之一與其雜交的任何核苷酸序列，所述條件允許具有聚合酶活性的酶延伸引物序列並藉此複製互補鏈。本文所用術語「可操作地連接的」是指呈功能關係的兩種或更多種多核苷酸或兩個或更多個核酸序列的連接。當將核酸置於另ー核酸序列的功能關係中時其為「可操作地連接的」。例如，啟動子或增強子如果影響編碼序列的轉錄，則為可操作地連接所述編碼序列。「可操作地連接的」意指連接的核酸序列通常鄰接或基本上鄰接，並在需要將兩個蛋白質編碼區連接時，為相鄰的且在讀框中。因為增強子通常在與啟動子相隔幾千個鹼基時起作用，並且內含子序列長度可變化；所以另ー方面，一些多核苷酸元件可可操作地連接但不相鄰。「轉錄単元」是指包含至少第一結構基因和至少第一遠端調控元件以及任何另外的順式序列的多核苷酸序列，所述至少第一結構基因與至少第一順式作用啟動子序列可操作地連接並任選與對有效轉錄結構基因序列所必需的ー種或多種其它順式作用核酸序列可操作地連接，所述至少第一遠端調控元件可能需要用於可操作地位於啟動子和/或增強子元件控制下的結構基因序列的適當組織特異性和發育轉錄，所述任何另外的順式序列對有效轉錄和翻譯所必需(例如ー個或多個聚腺苷酸化位點、ー個或多個mRNA穩定控制序列等)。
短語「分離的，，或「生物學純的，，是指基本上或大體上不含以下組分的材料，所述組分通常伴隨所述材料，如在其天然狀態中發現該材料吋。因而，本發明的分離多核苷酸優選不含通常在其天然或原位環境中與那些多核苷酸伴隨的材料。「連接」或「結合」是指本領域已知的用於功能連接ー種或多種蛋白質、肽、核酸或多核苷酸的任何方法，包括但不限於重組融合、共價鍵合、ニ硫鍵鍵合、離子鍵合、氫鍵合、 靜電鍵合等等。術語「病原體」本文定義為任何種類的傳染原，包括例如病毒、感染性蛋白質、原生動物、寄生蟲以及微生物，例如細菌、酵母、黴菌、真菌等等。本文所用術語「質粒」是指由遺傳材料(即核酸)組成的遺傳構建體。通常質粒含有複製起始點和選擇標記，所述複製起始點在細菌宿主細胞例如大腸桿菌中起作用，所述選擇標記用於檢測包含質粒的細菌宿主細胞。本發明質粒可包括遺傳元件，其如本文所述安排使得插入的編碼序列可在真核細胞中轉錄及翻譯。另外，質粒可包括源自天然或人 エ來源的ー種或多種核酸。本文所用術語「多肽」意在包括単數「多肽」以及複數「多肽」，並包括兩個或更多個胺基酸的任何一條鏈或多條鏈。因而，包括但不限幹「肽」、「ニ肽」、「三肽」、「蛋白質」、「酶」、 「胺基酸鏈」和「鄰接胺基酸序列」的本文所用術語，全部包括在「多肽」定義中，術語「多肽」 可用於取代任何這些術語或與其互換使用。所述術語進ー步包括業已經受ー種或多種翻譯後修飾的多肽，所述修飾包括例如但不限於糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、衍生化、蛋白酶剪切、翻譯後加工或通過包含ー種或多種非天然存在的胺基酸來修飾。在多核苷酸和多肽結構領域存在常規命名。例如，廣泛採用ー個字母和三個字母縮寫來闡述胺基酸丙氨酸 (A ；Ala)、精氨酸(R ；Arg)、天冬醯胺(N ；Asn)、天冬氨酸(D ；Asp)、半胱氨酸(C ；Cys)、穀氨醯胺(Q ；Gln)、穀氨酸(E ；Glu)、甘氨酸(G ；Gly)、組氨酸(H ；His)、異亮氨酸(I ；lie)、亮氨酸(L ；Leu)、甲硫氨酸(M ；Met)、苯丙氨酸(F ；Phe)、脯氨酸(P ；Pro)、絲氨酸(S ；Ser)、蘇氨酸(T ；Thr)、色氨酸(W ；Trp)、酪氨酸(Y ；Tyr)、纈氨酸(V ；Val)和賴氨酸(K ；Lys)。本文所述胺基酸殘基優選呈「L」異構形式。然而，「D」異構形式的殘基可取代任何L-胺基酸殘基， 前提為保留所期需的多肽性質。「蛋白質」在本文中可與「肽」和「多肽」互換使用，既包括合成、重組或體外產生的肽及多肽，又包括在給予宿主動物或人受試者核酸序列後體內表達的肽及多肽。術語「多肽」優選意指所有胺基酸鏈長度，包括約2-約20個胺基酸殘基長的那些短肽、約10-約100 個胺基酸殘基長的寡肽和包括約100個胺基酸殘基長或更長的多肽。術語「序列」當指胺基酸時，涉及給定胺基酸鏈例如多肽或蛋白質內的線性N-末端到C-末端次序的全部或部分胺基酸；「子序列"意指序列內任何連續的胺基酸段，例如給定蛋白質或多肽序列內的至少3個連續胺基酸。關於核苷酸和多核苷酸鏈，「序列」和「子序列」具有涉及核苷酸的 5' -3'次序的相似含義。本文所用術語「基本上同源的」，包括在一級核苷酸序列水平上彼此顯著相似的兩個或更多個生物分子序列。例如，在兩個或更多個核酸序列情境中，「基本上同源的」可指至少約75%、優選至少約80%和更優選至少約85%或至少約90%同一性，甚至更優選至少約 95%、更優選至少約97%同一，更優選至少約98%同一、更優選至少約99%同一、甚至更優選至少基本上或完全100%同一(即「不變的」)。同樣，本文所用術語「基本上同一的」包括在核苷酸水平上彼此表現高度同一性的兩個或更多個生物分子序列(特別是多核苷酸序列)。例如，在兩個或更多個核酸序列情境中，「基本上同一的」可指彼此至少約80%、更優選至少約85%或至少約90%同一的序列， 甚至更優選至少約95%、更優選至少約97%同一、更優選至少約98%同一、更優選至少約 99%同一和甚至更優選至少基本上或完全100%同一(即「非簡併的」)。術語「重組體」表示業已通過人為幹預人工或合成(非天然)改變材料(例如多核苷酸或多肽)。可對在其天然環境或狀態內或從其天然環境或狀態中移出的材料實施改變。 具體地，例如當啟動子序列由通過人工工程改造的核酸區段表達產生吋，其為「重組體」。例如，「重組核酸」為通過例如在克隆、DNA改組或其它程序期間重組核酸來製備的核酸，或通過化學或其它誘變而製備的核酸；「重組多肽」或「重組蛋白質」為通過重組核酸的表達而產生的多肽或蛋白質；「重組病毒」例如重組流感病毒通過重組核酸的表達而產生。根據本發明，多核苷酸、核酸區段、核酸序列等等包括但不限幹DNA(包括且不限於基因組或基因組外DNA)、基因、肽核酸(PNA)、RNA(包括但不限於rRNA、mRNA和tRNA)、核苷和合適核酸區段，它們自天然來源獲得、是化學合成的、經修飾的或由人工全部或部分以其它方式製備或合成。同樣，按照長期使用的專利法律慣例，當用於包括權利要求在內的本申請中吋，措辭「ー個」和「ー種」表示「ー種或多種」。
實施例包括以下實施例以闡明本發明闡述性實施方案。本領域普通技術人員應該理解， 以下實施例中掲示的技術代表經發現在實施本發明中很好地起作用的技木，因此，可認為構成其實施的優選方式。然而，本領域普通技術人員應該理解，根據本公開內容，可在已揭示的具體實施方案中進行很多變化，仍獲得類似或相似結果，而不會背離本發明精神和範圍。實施例1-例示性儲存溶液配方本實施例提供本發明PSS(PanFlu)組合物的通用配方。PSS組合物的另外的配方亦舉例於實施例2到實施例5中材料硫氰酸胍、檸檬酸鈉、Antifoam A 濃縮液和N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽全都購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。三羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)自 Soltec Ventures Inc. (Beverly, MA, USA)獲得。2_ 氨基 _2_ 羥基甲基-丙烷 _1，3_ ニ醇(TRIS) 自 Applied Biosystems/Ambion (Austin,TX,USA)獲得。2-[2-(雙(羧基甲基)氨基)乙基-(羧基甲基)氨基]乙酸(EDTA)GIBCO Ultra Pure 自 hvitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA)獲得。所有其它試劑可市購自Sigma-Aldrich或USB Corporation。表 1
用於製備PRIMEST0RE 組合物的例示性組分的配方範圍
化合物最終濃度範圍
1.離液劑，例如
碗氰酸胍約0.5 M-約6 M
或鹽酸胍約0.5 M-約6 M
或異氰酸胍約0.5 M-約6 M
2.陰離子洗滌劑，例如
從十二烷醜肌I酸(尤其是Na鹽) 約0.15%-約1% (重量/體積)
或十二烷基硫酸鈉，相同
十二燒基較。酸鋰，相同
甘氨膽酸鈉，相同
脫氧膽酸鈉，相同
牛磺脫氧膽酸鈉，或相同
膽酸鈉約0.1%-約1% (重量/體積)
3.還原劑，例如
TCEP約 0.5 mM-約 30 mM
或β-ΜΕ、DTT、甲醯胺或 DMSO 約 0.05 M-約 0.3 M
4.螫合劑，例如/
檸檬酸鈉約0.5 mM-約50 mM
或 EGTA、HEDTA, DTPA, NTA、APCA 等約 0.01 mM-約 1 mM
5.緩衝劑(例如TRIS、HEPES, Bis-Tris 等)約 1 mM-約 1 M
6.酸(例如HCl或檸檬酸)適量調整到pH約6-7，優選6.4-6.8
7.無核酸酶水任選以下ー種或多種
8.表面活性劑/消泡劑，例如: Antifoam A 或 Tween
9.烷醇
(例如曱醇、乙醇、丙醇等) 10.栽體/IPC RNA 或 DNA
足量到期需最終體積
約0.0001%-約0.3% (重量/體積) 約1%-約25% (體積/體積)
約 1 pg-約 1 pg/mL
實施例2-例示性儲存溶液製劑本實施例闡述本發明組合物的第一種例示性製劑。該製劑亦由本發明人另外稱為 「Prim必tore 溶液」或「PSS，，1 型。表2PRIMEST0RE 組合物(1型)的製備
化合物終濃度
石充氰酸胍4 M
檸檬酸鈉30 mM
十二烷基ぶ直酸鈉0.25% (重量/體積)
ガ-十二烷醯カ幾氨酸鈉鹽 0.25% (重量/體積) 2-疏基乙醇(β-ΜΕ)0.1 M
Antifoam A0.1 % (重量/體積、
檸檬酸適量調整到ρΗ6.5
無核酸酶水11,82 mL實施例3-第二種例示性儲存溶液的製備本實施例闡述本發明另一例示性儲存溶液的製備。該製劑亦由本發明人另外稱為 PrimeStore 2 型。表3PrimeStore 組合物Q型)的製備
化合物量終濃度
硫氰酸胍35.488 gm3 M
TCEP0.02867 gm1 mM
檸檬酸鈉0.2931 gmIOmM
が-十二烷醯肌氨酸鈉鹽(NLS) 0.5 gm0.5%
Antifoam A (10%溶液)200 μ 0.002%
TRIS(IM)IOmLIOOmM
EDTA (0.5 Μ)20 ル0.1 mM
鹽酸(HCl)適量調整到pH6.7-
無核酸酶水足量到IOOmL--實施例4-第三種例示性儲存溶液的製備
本實施例闡述本發明另一例示性儲存溶液的製備。該製劑亦由本發明人另外稱為 PSS 2. 2 型。表 4PrimeStore 組合物(2· 2 型)的製備
權利要求
1.--種組合物，其包含a)-一種或多種離液劑；b)-一種或多種洗滌劑；C)-一種或多種還原劑；d)-一種或多種螯合劑；e)-一種或多種緩衝劑；f)約60-500個核苷酸長的分離的單鏈核酸分子，所述單鏈核酸分子包含以下核酸區段，其包含(1)與約12-約40個核苷酸長的標記探針特異性結合的第一序列域，所述標記探針對檢測所述核酸區段特異；(2)與約20-約40個核苷酸長的正向PCR擴增引物特異性結合的第二序列域；(3)與約20-約40個核苷酸長的反向PCR擴增引物特異性結合的第三序列域；其中所述第二和第三序列域可操作地定位，以促進在有效擴增所述核酸區段的至少第一部分的條件下自所述正向和反向引物進行所述至少第一部分的PCR引導擴增；其中在嚴格雜交條件下所述分子基本上不與哺乳動物基因組或對哺乳動物致病的細菌、真菌或病毒基因組結合；和另外其中(a)-(e)以以下量存在於所述組合物中，當懷疑含有核酸群的樣品與所述組合物接觸時，所述量足以使所述樣品中的一種或多種蛋白質變性，使所述樣品中的一種或多種核酸酶滅活，殺死所述樣品中的一種或多種病原體，或防止所述樣品中的一種或多種核酸不被降解。
2.權利要求1的組合物，其中(a)-(e)中的每一種以以下量存在於所述組合物中，所述量足以抑制或防止包含所述單鏈核酸分子的核苷酸群當在約10°C -約40°C溫度下儲存約 1天-約90天的時間時大量降解。
3.前述權利要求中任一項的組合物，其中a)所述一種或多種離液劑各自以約0.5M-約6M的量存在；b)所述一種或多種洗滌劑各自以約0.1 % -約1 % (重量/體積)的量存在；c)所述一種或多種還原劑各自以約0.05M-約0. 3M的量存在；d)所述一種或多種螯合劑各自以約0.OlmM-約ImM的量存在；和e)所述一種或多種緩衝劑各自以約ImM-約IM的量存在。
4.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述標記探針包含至少第一小溝結合劑、放射性標記、發光標記、化學發光標記、螢光標記、酶標記、磁性標記或自旋共振標記或其組I=I ο
5.前述權利要求中任一項的組合物，其中a)所述一種或多種離液劑包括硫氰酸胍、異氰酸胍、鹽酸胍或其任何組合；b)所述一種或多種洗滌劑包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、牛磺脫氧膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、烷基苯磺酸鈉、N-十二烷醯肌氨酸或其任何組合；c)所述一種或多種還原劑包括2-巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫蘇糖醇、二甲亞碸或其任何組合；d)所述一種或多種螯合劑包括乙二醇四乙酸、羥乙基乙二胺三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、N，N-雙(羧甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鋰或其任何組合；或e)所述一種或多種緩衝劑包括三(羥基甲基)氨基甲烷、檸檬酸鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、N，N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸、1，3_雙(三(羥基甲基)甲基氨基)丙烷、 4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸、3-(N-嗎啉代)丙磺酸、碳酸氫鹽、磷酸鹽或其任何組合。
6.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物進一步包含以下一種或多種g)一種或多種選自矽酮聚合物、聚山梨醇酯及其任何組合的表面活性劑；h)一種或多種選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇及其任何組合的短鏈烷醇；和i)一種或多種選自矽酮聚合物、聚山梨醇酯及其任何組合的消泡劑；和其任何組合。
7.前述權利要求中任一項的組合物，所述組合物a)被緩衝到pH約6.0-7. 0 ；b)基本上沒有RNA酶或DNA酶活性；或c)進一步包含細菌、病毒或真菌來源的分離的多核苷酸群，所述多核苷酸群包括RNA、 DNA、PNA或其任何組合。
8.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述組合物包含a)約4M硫氰酸胍；約30mM檸檬酸鈉；約0.25% (重量/體積)十二烷基硫酸鈉；約 0. 25% (重量/體積)N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；(ν)約0. IM 2-巰基乙醇；和約0. 矽酮聚合物(重量/體積)；b)約3M硫氰酸胍；約ImMTCEP ；約IOmM檸檬酸鈉；約0. 5% N-十二烷醯肌氨酸；約 0.0002%矽酮聚合物；約IOOmM 2-氨基-2-羥基甲基-丙烷-1，3-二醇(TRIS)；和約0. ImM EDTA ；c)約IM-約4M硫氰酸胍；約0.5mM-10mM TCEP ；約ImM-IOOmM檸檬酸鈉；約0. 1 % -約 SDS 或NLS ；約 0. 001% -約 0. 0001%矽酮聚合物、約 IOmM-約 500mM TRIS、約 0. ImM-約lmMAPCA, EDTA, EGTA, HEDTA, DTPA, NTA 或檸檬酸鹽；和約 10% -約 25% 乙醇(體積 / 體積)；或d)約3M硫氰酸胍；ImMTCEP ；約IOmM檸檬酸鈉；約0. 5% N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽；約 0. 0002%矽酮聚合物；約IOOmM TRIS ；約0. ImM EDTA ；和約10% -約25%乙醇(體積/體積)。
9.前述權利要求中任一項的組合物，其中將所述核酸群採集並保存在包含所述組合物的單一反應容器中。
10.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述樣品為臨床、獸醫、流行病學、環境、法醫或病理來源的生物樣品；或其中所述樣品含有或懷疑含有病毒、細菌、真菌或哺乳動物來源的一種或多種多核苷酸。
11.前述權利要求中任一項的組合物，其中所述分離的單鏈核酸分子包含來自以下序列的至少 20 個鄰接核苷酸5 『 -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAGCGAGA CA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCAGUU-3『 (SEQ ID NO 2)。
12.用於診斷或治療微生物、真菌或病毒感染的權利要求1-11中任一項的組合物。
13.權利要求1-11中任一項的組合物在製備用於診斷或治療微生物感染或其一種或多種症狀的藥物中的用途。
14.用於診斷或治療細菌、病毒或真菌感染或其一種或多種症狀的權利要求13的用途。
15.一種診斷試劑盒或樣品採集系統，所述診斷試劑盒或樣品採集系統包括a)權利要求1-11中任一項的組合物；和b)使用所述組合物診斷或治療微生物感染的使用說明。
16.一種用於提高自懷疑含有多核苷酸的生物樣品獲得純化的這類多核苷酸群的效率的方法，所述方法包括讓所述樣品與包含權利要求1-11中任一項的分離的單鏈核酸分子的組合物接觸，所用量和接觸時間足以提高自所述生物樣品獲得純化的多核苷酸群的效率。
17.權利要求16的方法，其中當包含所述樣品的組合物在約10°C-約40°C溫度下儲存 (a)約7-約14天的時間或(b)約14-約30天的時間時，所述生物樣品中的多核苷酸群的完整性或所述多核苷酸之一的至少第一序列的保真度得到至少基本上保持。
18.權利要求16或權利要求17的方法，其中(a)包含所述樣品的組合物基本上從採集時間到分離、純化或表徵其中的多核苷酸群的時間儲存在約10°C -約40°C溫度下；或(b) 在包含所述樣品的組合物在約10°C -約40°C溫度下儲存約7-約30天的時間後，所述樣品中含有的不到約5%的多核苷酸群被降解。
19.權利要求16-18中任一項的方法，其中包含所述樣品的組合物在(a)約10°C-約 400C的溫度下儲存約24-約96小時；或在(b)約10°C -約30°C的溫度下儲存約7天-約 30天。
20.權利要求16-19中任一項的方法，所述方法進一步包括分析或定量測定自所述純化的樣品獲得的多核苷酸群的步驟。
21.權利要求20的方法，其中所述定量測定步驟包括測定所述分子的PCR循環閾值 (Ct) ο
22.—種從懷疑含有核酸的生物樣品獲得多核苷酸群的方法，所述方法包括讓所述樣品與一定量的以下組合物接觸，所述組合物包含約IM-約4M硫氰酸胍； 約 0. 5mM-約 IOmM TCEP ； 約ImM-約IOOmM檸檬酸鈉； 約0. 1 % -約1 % N-十二烷醯肌氨酸鈉鹽； 約 0. 001% -約 0. 010% 的 10% antifoam A 溶液； 約 IOmM-約 500mM Tris ； 約 0. ImM-約 ImM EDTA ； 約10% -約25%乙醇(體積/體積)；和具有以下序列的核酸分子5 『 -CCCUUAGCAGCAC⑶CA⑶CAGGGAGCCAAUUUCAGAGCUCAG CGAGACA⑶UUUAUAGGCAUGGCAUCAGCUACGCUCGCUCAGGCUA⑶CAGGUCCAAA⑶UUCA⑶U-3 『 (SEQ ID NO :2)，其以足以穩定所述多核苷酸群的量存在，使得在包含所述樣品的組合物在約 IO0C -約40°C溫度儲存至少約7天-約30天後，所述樣品中含有的不到約30%的多核苷酸群被降解。
全文摘要
本發明揭示用於採集、儲存和運輸來自生物樣本和臨床、法醫或環境樣品的核酸群的組合物。亦揭示用於用這些組合物作為一步製劑殺死樣品中的病原體、使樣品中的核酸酶滅活及從樣品中的其它細胞組分釋放多核苷酸並在進一步處理或測定前穩定核酸的方法。在特定實施方案中，本發明提供含有已知量的非基因組核酸載體分子的單一一步樣品採集/運輸/儲存製劑，所述核酸載體分子起內部參考對照的作用，以監測採集/運輸介質的保真度，並測量隨後自處理的樣品分離和純化的核酸的完整性。
文檔編號C07H21/00GK102575286SQ201080028416
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月20日 優先權日2009年4月20日
發明者G·W·費希爾, L·T·道姆 申請人:長角牛疫苗和診斷有限責任公司