一種檢測土壤反硝化酶活性的分析方法

2023-05-25 15:38:31

專利名稱：：一種檢測土壤反硝化酶活性的分析方法
技術領域：
：本發明涉及土壤中反硝化酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中反硝化酶活性的分析方法。技術背景土壤中的反硝化酶能將在土壤氮代謝過程中形成的硝態氮還原生成亞硝態氮或者氮氣或一氧化氮，土壤中的還原態化合物可作為氫的供體。反硝化酶反硝化酶N03—-N-N02—-N-N2+N0+2H+2H因此，土壤中反硝化酶活性的強弱影響到土壤氮代謝過程中氮素的氣態損失，間接影響氮肥的利用效率。土壤中反硝化酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質地的強烈影響，同時也受到農田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中反硝化酶活性的檢驗有很重要的意義。而到目前為止，有關反硝化酶活性的測定基本都是參照JordanTEetW(1998)和WhiteJRetaHl999)的方法。該種方法步驟比較繁瑣，需用專用分析設備，試劑瓶和抽濾裝置進行抽真空培養，且培養批次的不同具有差異性和不確定性，使其難以適應土壤中反硝化酶活性的定性比較和定量研究；同時，該種方法樣品的前期處理比較麻煩，降低了實驗的效率，增加了實驗結果的不準確性。
發明內容本發明的目的在於提供一種檢驗土壤中反硝化酶活性的分析方法。該方法是在借鑑前人測定方法的原理基礎上，對反硝化酶活性的測定步驟和顯色方法進行了部分改進(對其樣品的處理方法和測定方法進行改進)，從而減少樣品處理和試驗步驟的複雜性，使分析結果更加精確可靠，分析重現性更好。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種檢測土壤中反硝化酶活性的分析方法，1)稱取0.5-lg過1-1.5隱篩的土壤風乾樣品n份分別裝入n支試管中，n>2,向其中n-l支試管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN03溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；然後向試管中分別加入l-2mL重量濃度0.5%-P/。的葡萄糖溶液作為氫的供體，用蒸餾水補充至15-20mL,搖勻，塞上不透氣的橡膠塞後37C恆溫培養48h;同時作試劑空白對照(不加土壤，其餘同樣品處理)；2)培養結東後，3900-4100r/min離心20-25min;3)用紫外分光光度法分別測定吸光度A22。，A275;4)求出校正吸光度A-A22。-A275;5)製作工作標準曲線，以硝酸根溶液的系列濃度和測定的吸光值A'製作工作標準曲線，得到斜率b;6)根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中硝酸根的濃度S，S=A*b;7)計算樣品中硝酸根濃度；8)計算反硝化酶活性計算公式為formulaseeoriginaldocumentpage4式中Si為試劑空白中的N03—-N的含量(mg),S2為樣品中的N03—-N的含量(rag/L),S3為樣品對照中的N03—-N的含量(mg/L),V為浸提液總體積(mL)，W為稱土樣重(g),1000為單位轉換係數，T土樣培養時間(h)。對於酸性土樣品，分析前應調解其PH為7-8.5,可釆用加入碳酸錦的方法調解，每支試管中分別加入15-25mgCaC03,混勻向其中n-l支試管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN03溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照。(對於石灰性土壤而言，碳酸鈣無需加入，因為土壤本身的pH值既可以滿足微生物的最適pH)製作工作標準曲線過程為吸取硝酸根標準溶液OmL,0.5mL,lmL,2mL,3mL,4mL，5mL分別放於lOOmL容量瓶中(如有沉澱過濾)用蒸餾水定容，用紫外分光光度計測其吸光度A'，以硝酸根溶液的系列濃度0mg/L,0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L,5mg/L和測定的吸光值A'製作工作標準曲線，得到斜率b。本發明方法改進的依據土壤反硝化酶是硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、土壤羥胺還原酶等一切與硝態氮還原有關的酶的總稱，它們都是參與土壤中氮素代謝的還原酶類。它們在測定過程中均需要厭氧培養條件。硝酸還原酶活性測定是以硝酸鉀(KN03)為底物，通過加入2,4-二硝基酚抑制亞硝酸還原酶的活性，來檢測單位時間內N02—-N的生成量；亞硝酸還原酶活性的測定方法則是以亞硝酸鈉(NaN02)為底物，經過24小時厭氧培養，通過單位時間內NO—21的減少量來表徵；羥胺還原酶活性的測定則是以羥胺(NH20H)為底物，經過5小時厭氧培養，通過單位時間內羥胺的減少量來衡量羥胺還原酶的活性。與此相同，本方法中土壤反硝化酶活性的測定是以硝酸鉀(KN03)為底物，經過48h的厭養培養，通過計算單位時間內單位土壤的N03—-N的減少量來表徵反硝化酶的活性。本試驗中土壤樣品淹沒在液面以下，目的就是為培養試驗創造良好的厭養環境。本發明所使用的測定原理為土壤反硝化酶反應需要在厭養環境中進行，加入試管中的硝態氮的去向只能是作物利用、淋失、土壤吸附和反硝化4個方面之一。本試驗中，1g土壤被溶液完全淹沒，處於厭氧條件下，其硝態氮也不可能淋失，加之其又是一種陰離子，土壤對其吸附的量很小。所以培養結東後硝態氮的損失只能是反硝化作用的結果。因此，本試驗擬通過反應後N03--N的損失量來表徵土壤反硝化酶活性。硝酸根在紫外線(22Onm)有吸收峰，樣品可以不經處理用紫外分光光度計測其吸光度，轉化並計算硝酸根的含量，進而計算減少的N03--N量。與過去的分析方法相比較，本發明的優點主要有1)所需設備簡單、降低了試驗成本。本發明中的培養試驗是在直徑10-15mm、長為100-150mm的普通玻璃試管中進行，不需用原來方法中提及的用來實現抽真空的帶磨口塞的專用真空瓶及真空泵。2)所使用的方法不需要顯色，減少操作過程的複雜性。利用硝酸根在紫外線有吸收峰，免去了樣品的複雜處理，由於硝酸根在紫外線(220nm)有吸收峰，樣品可不經處理在紫外分光光度計上于波長220nm和275nm直接測定A，和A275，用校正吸光度A=A22。一A^查得硝酸根濃度。3)操作簡單，分析結果穩定可靠，重現性好。原來方法需要設置滅菌土壤作為對照，本方法只需要一個不加底物的溶液作為對照，與傳統方法比較，所需設備簡單，成本低；同時，由於本發明所涉及到的培養方法減少了厭氧培養過程的複雜性和不確定性，故分析結果重現性非常良好。離心處理使吸附在土壤顆粒上的硝態氮充分與水混合併溶解在溶液裡，提高了實驗結果的準確度。具體實施方式試劑配製1.硝酸根標準溶液[P(冊3—XOOmg.L-1]:稱取硝酸鉀(KN03，分析純)0.1631g溶於水稀釋至1L。2.底物KN(U容液aOg/L):稱取10gKNOs溶於蒸餾水中,用蒸餾水定溶至1L。3.CaC03，分析純試劑。4.ly。的葡萄糖溶液稱取lg葡萄糖，用蒸餾水定容至100mL。5.製作工作標準曲線吸取硝酸根標準溶液OmL，0.5mL,lmL,2mL,3mL，4mL，5mL分別放於100mL容量瓶中(如有沉澱過濾)用蒸餾水定容，用紫外分光光度計測其吸光度A',以硝酸根溶液的系列濃度(0mg/L,0.5mg/L，1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L，5mg/L)和測定的吸光值A'製作工作標準曲線，得到斜率b。操作步驟1)稱取lg過lmm篩的土壤風乾樣品4份於4支試管中，分別加入20mgCaCO3,仔細混合後，向其中3支試管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN(V溶液，另l支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；然後向試管中分別加入l-2mL0.5%-1%的葡萄糖溶液作為氫的供體，用蒸餾水補充至15-20mL,搖勻，塞上不透氣的橡膠塞後37L恆溫培養48h;同時作試劑空白對照；2)培養結束後，4000r/min離心20min;3)用紫外分光光度法測定吸光度A22Q,A275;4)求出校正吸光度A=A22。-A275;5)根據吸光值A和斜率b,計算所測定溶液中硝酸根的濃度S,S=A*b;6)計算樣品中硝酸根含量；7)計算反硝化酶活性；計算公式為[S「(S2-S3)*V/1000]/W.T=mgNO廣N/g土48h式中為試劑空白中的N(V-N的含量(mg),S2為樣品中的N03—-N的含量(mg/L)，S3為樣品對照中的N0,-N的含量(mg/L),V為浸提液總體積(mL)，W為稱土樣重(g)，1000為單位轉換係數，T土樣培養時間(h)。實施例1本實施例所使用的黑土採自於中國科學院海倫生態試驗站，設三個不同的處理l號位對照，既不經過任何處理和添加任何土壤添加劑在25。C培養24h以上的普通土壤；2號為添加硝化抑制劑DCD且在25。C培養24h以上的土壤；3號為添加硝化抑制劑DMPP且在25。C培養24h以上的土壤。土壤含水量均為20%(風乾土重)。2號和3號添加硝化抑制劑的土壤，其中兩種抑制劑的添加量都是50ppm，用上述方法檢測三種處理的反硝化酶活性。每種土壤得具體分析步驟如下1)稱取lg過lmm篩的土壤風乾樣品4份於4支試管中，分別加入20mgCaCO3,仔細混合後向其中3支試管中加入10mL10g/L的底物KNOr溶液，另l只試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；然後向試管中分別加入lmLW的葡萄糖溶液作為氫的供體，用蒸餾水補充至15-20mL，搖勻，塞上不透氣的橡膠塞後37。C恆溫培養48h;同時作試劑空白對照；2)培養結束後，4000r/min離心20min;3)用紫外分光光度法測定吸光度A，，A275;4)求出校正吸光度A=A22Q-A275;5)根據吸光值A和斜率b,計算所測定溶液中硝酸根的濃度S,S=A*b;6)計算樣品中硝酸根含量；7)計算反硝化酶活性。試驗結果如下:tableseeoriginaldocumentpage7由表中數據可以看出，各處理之間結果差異達到顯著水平，較小的標準差值表明該分析方法結果之間的偏差較小，精確度較高，重現性好。實施例2本實施例所使用的三種不同種植作物的棕壤均釆於中國科學院瀋陽生態實驗站其中4號土壤前茬作物為水稻，5號土壤前茬作物為玉米，6號土壤前茬作物為大豆。三種不同耕作制度的土壤均在含水量為2W(風乾土重)，溫度在25'C條件下培養24h以上，測定其反硝化酶活性，具體步驟如下底物硝酸鉀濃度為20g/L,加入5mL,葡萄糖濃度為1%，加入lmL,其餘步驟同實例1。試驗結果如下:tableseeoriginaldocumentpage8表中數據同樣顯示了分析結果的穩定性及較高的精密度。權利要求1.一種檢測土壤中反硝化酶活性的分析方法，其特徵在於1)稱取0.5-1g過1-1.5mm篩的土壤風乾樣品n份分別裝入n支試管中，n≥2，向其中n-1支試管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KNO3溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；然後向試管中分別加入1-2mL重量濃度0.5％-1％的葡萄糖溶液作為氫的供體，用蒸餾水補充至15-20mL，搖勻，塞上不透氣的橡膠塞後37℃恆溫培養48h；同時作試劑空白對照；2)培養結束後，3900-4100r/min離心20-25min；3)用紫外分光光度法分別測定吸光度A220，A275；4)求出校正吸光度A＝A220-A275；5)製作工作標準曲線，以硝酸根溶液的系列濃度和測定的吸光值A』製作工作標準曲線，得到斜率b；6)根據吸光值A和斜率b，計算所測定溶液中硝酸根的濃度S，S＝A*b；7)計算樣品中硝酸根濃度；8)計算反硝化酶活性計算公式為[S1-(S2-S3)*V/1000]/W.T＝mgNO3--N/g土·48h式中S1為試劑空白中的NO3--N的含量(mg)，S2為樣品中的NO3--N的含量(mg/L)，S3為樣品對照中的NO3--N的含量(mg/L)，V為浸提液總體積(mL)，W為稱土樣重(g)，1000為單位轉換係數，T土樣培養時間(h)。2.根據權利要求1所述的分析方法，其特徵在於對於酸性土樣品，分析前應調解其PH為7-8.5,可釆用加入碳酸鈣的方法調解，每支試管中分別加入15-25mgCaC03,混勻向其中n-1支試管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物體03溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照。3.根據權利要求1所述的分析方法，其特徵在於製作工作標準曲線過程，吸取硝酸根標準溶液OmL,0.5mL,lmL,2raL,3mL,4mL，5mL分別放於100mL容量瓶中用蒸餾水定容，用紫外分光光度計測其吸光度A',以硝酸根溶液的系列濃度Omg/L，0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L，5mg/L和測定的吸光值A，製作工作標準曲線，得到斜率b。全文摘要本發明涉及一種檢測土壤中反硝化酶活性的分析方法1)稱取過篩的土壤風乾樣品n份於試管中，向其中n-1支試管中加入底物硝酸鉀溶液，另1支試管中加入等量的蒸餾水作為樣本對照；然後向試管中分別加入葡萄糖溶液，用蒸餾水補充至15-20mL，搖勻，加塞後恆溫培養；2)4000r/min離心20min；3)用紫外分光光度法測定吸光度A220，A275；4)用校正吸光度A＝A220-A275計算查得硝酸根含量。本發明優點為1)簡化了操作步驟，減少了厭養培養過程的複雜性和不確定性；2)減少對設備要求的依賴性；3)方法準確度高，易操作；4)結果穩定可靠，重現性好；5)省略了樣品的顯色過程。文檔編號G01N21/31GK101270385SQ20071001068公開日2008年9月24日申請日期2007年3月21日優先權日2007年3月21日發明者史雲峰,武志傑,陳利軍,雋英華申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所