一種嵌合病毒及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-13 10:04:16

專利名稱：一種嵌合病毒及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種嵌合病毒，特別涉及一種嵌合了登革病毒保護性抗原的乙腦病毒感染性克隆。
背景技術：
登革熱是被WHO喻為危害最為嚴重的被忽視的熱帶和亞熱帶傳染病之一。據WHO統計，自1955年發現該病以來，WHO報告的登革病例增長了約30倍。目前，全球有近一半人口(35億)生活在登革熱的流行區域，每年發病例大約為5000萬，但是目前全球還沒有疫
苗可供使用。登革疫苗研發的關鍵難點是登革病毒按血清型分為四種，即登革I型、登革2型、登革3型、登革4型，並在流行區域交替出現。四個血清型之間雖然有交叉反應，但沒有交叉保護或交叉保護很弱，持續時間很短，僅有數月。當感染某種血清型的登革病毒後，一般僅表現症狀較弱的臨床症狀或無症狀，如再被另一種血清型登革病毒感染，會出現抗體依賴的病理增強作用，表現為潛伏期短，臨床症狀明顯加重，可能出現嚴重的出血、休克或死亡。因此必須研發能同時保護4個血清型登革 病毒的四價登革疫苗。由於4個血清型登革病毒生長特性差別大、免疫應答能力各異，要維持4個型登革疫苗之間一定的免疫反應水平的平衡具有一定的技術難度。因此，迄今沒有安全有效疫苗上市。申請號:200910085231.6，發明名稱:乙腦/登革嵌合病毒及其應用的專利申請是利用乙腦減毒疫苗株SA14-14-2為基因骨架，將登革2型病毒NGC株抗原基因prM_E替換乙腦疫苗株相應基因區域構建而成。由於該專利產品僅能在蚊子細胞C6/36上繁殖，該細胞不能用於人用疫苗的生產，且僅為乙腦/登革2型一種嵌合病毒，無法進行疫苗生產，存在很大缺陷。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種新的乙腦病毒感染性克隆，以該乙腦病毒感染性克隆為骨架的登革嵌合病毒，以及登革疫苗和新的細菌人工染色體。本發明乙腦病毒感染性克隆，其是包含乙腦病毒減毒株SA14-14-2基因組全長cDNA的重組載體。其中，所述重組載體是重組pACNR質粒或者重組細菌人工染色體，細菌人工染色體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。其中，所述全長cDNA的5』端具有原核啟動子。所述啟動子為SP6。所述全長cDNA的3』端的轉錄終止位點為限制性內切酶酶切位點。所述限制性內切酶酶切位點為XhoI或Sail。優選地，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID N0.2或者SEQ ID N0.3所示。本發明嵌合病毒，它由前述乙腦病毒感染性克隆構建而成，其中prM-E基因為登革病毒prM-E基因。
其中，所述登革病毒是登革病毒1、2、3或4型。其中，所述登革病毒I型為登革病毒ThD0008_81株；所述登革病毒2型為登革病毒PU0-218株；所述登革病毒3型為登革病毒PaH881-88株；所述登革病毒4型為登革病毒814669 株。其中，所述登革病毒prM-E基因的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.4 7所示。所述嵌合病毒的核苷酸序列如SEQ ID N0.8 11任意一項所示。前述嵌合病毒在製備登革熱疫苗中的用途。本發明還提供了一種登革熱疫苗，它是由前述的嵌合病毒製備而成。本發明還提供給了一種核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的細菌人工染色體。本發明利用乙腦減毒疫苗株SA14-14-2和本發明細菌人工染色體，成功地構建了乙腦病毒感染性克隆，並以該感染性克隆為基因骨架，成功構建了含有登革I型、登革2型、登革3型或者登革4型病毒抗原基因prM-E的乙腦/登革嵌合病毒，這些嵌合病毒能在多種人用疫苗生產用細胞上生長繁殖，並且生長特性類似，可以用於四個血清型登革疫苗的生產，免疫原性強，產生的抗體的滴度高，具有良好的應用前景。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本 發明的範圍。


圖1BAC載體改造(BAC53)後Hind III &Kpn I雙酶切驗證圖，泳道1、2、3、4為挑選的4個克隆，M為DNA分子量標準DL15000)；圖2JEV 5'半分子質粒PJEV5'構建的酶切鑑定結果，其中第I泳道是DNAmarker (DL15000);第2泳道是質粒載體pACNR;第3泳道是將Fl片段插入到載體pACNR後的pACNR-Fl克隆；第4泳道是將Fl片段和F3片段插入到載體pACNR後的pACNR_F13;第5泳道是將F1、F2和F3片段插入到載體pACNR後的5'半分子質粒pJEV5';第6泳道是對5'半分子質粒PJEV5'用限制內切酶AscI和KasI進行酶切驗證的結果，第7泳道是對
半分子質粒PJEV5'用限制內切酶BglII和KasI進行酶切驗證的結果，第8泳道是對半分子質粒PJEV5'用限制內切酶BglII和BspEI進行酶切驗證的結果，第9泳道是對半分子質粒PJEV5'用限制內切酶AscI和Xhol進行酶切驗證的結果，第10泳道是DNAmarker(DL2000)；圖3pJFC全長質粒結構示意圖，紅色的箭頭表示人為加入的啟動子序列,AscI酶切位點為人為加入用於克隆構建，藍色部分表示乙腦減毒疫苗株SA14-14-2全長cDNA ；圖4pJFC全長質粒酶切鑑定結果，其中泳道I為DNA marker DL15000 ;泳道2為PJFC全長質粒；泳道3為pJFC經HindIII酶切的電泳圖譜；泳道4為pJFC經BglII酶切的電泳圖譜；泳道5為DNA marker DL2000 ；圖5BAC53-JFC全長質粒酶切鑑定結果，其中泳道I為BAC53-JFC經NotI和XhoI酶切的電泳圖譜；泳道 2 為 DNA marker DL2000 ；M 為 DNA markerDL15000 ；
圖6RT-PCR 檢測 rJEV 的電泳結果。泳道 I 為 DNAmarker ( λ DNA/HindlII)，泳道 2為DNA marker (DL2000)，泳道3為PCR擴增F123片段，泳道4為PCR擴增F45片段，泳道5為PCR擴增F67片段泳道6為PCR擴增F89片段，泳道7為PCR擴增FlO片段，泳道8為PCR擴增Fll片段；圖7間接免疫螢光檢測rJEV結果。其中A、B分別是減毒株JEV感染細胞後用JEVE單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；C、D分別是恢復病毒rJEV感染細胞後用JEV E單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；E、F分別是未感染的細胞對照用JEVE單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；圖8r JEV與乙腦疫苗株JEV的蝕斑形態比較；圖9乙腦/登革I型嵌合的5』半分子克隆pJDl-5』質粒電泳圖；圖10乙腦/登革 I型嵌合的5』半分子克隆pJDl-5』質粒用NotI和BglII雙酶切的電泳圖；圖11乙腦/登革I型嵌合全長克隆的質粒pJDIFC電泳圖；圖12乙腦/登革I型嵌合全長克隆的質粒pJDIFC用NotI和XhoI雙酶切的電泳圖；圖13乙腦/登革I型嵌合全長克隆的質粒PJDlFC分別用BamHI和XhoI單酶切的電泳圖；圖14乙腦/登革I型嵌合全長克隆的質粒PJDlFC體外轉錄產物的電泳圖；圖15乙腦/登革I型嵌合全長克隆的質粒PJDlFC體外轉錄產物轉染細胞BHK21後的細胞病變，左邊圖為未轉染的細胞對照，右邊為轉染後的細胞病變；圖16嵌合病毒JDl在原代地鼠腎細胞上傳代後的病變結果，左邊為未感染的細胞對照，右邊為感染後的細胞病變；圖17嵌合病毒JDl的RT-PCR檢定的電泳圖，擴增片段1、2、3都和預期一致；圖18乙腦/登革I型嵌合病毒JDl的蝕斑檢測結果；圖19乙腦/登革I型嵌合病毒JDl中登革病毒I型E蛋白表達Westernblot檢測結果；圖20乙腦/登革I型嵌合病毒JDl在原代地鼠腎細胞PHK上的生長特性檢測結果;圖21乙腦/登革I型嵌合病毒JDl的免疫原性檢測結果；圖22乙腦/登革2型嵌合全長克隆？邛2 (:酶切鑑定。1為0應111&46^01^15000);2為PJD2FC質粒；3為pJD2FC質粒HindIII酶切圖譜；4為pJD2FC質粒BglII酶切圖譜；5為PJD2FC質粒雙酶切圖譜(Ascl+Xhol) ;6為pJD2FC質粒雙酶切圖譜(BspEI+Xhol) ; 7為DNA marker(DL2000)；圖23乙腦/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠腎細胞上的細胞病變，左邊為未感染對照細胞，右邊為JD2感染PHK細胞後的細胞病變；圖24RT-PCR檢測嵌合病毒JD2的電泳圖。I為DNA marker (DL15000) ; 2為PCR擴增片段F123; 3為PCR擴增片段F45; 4為PCR擴增片段F67; 5為PCR擴增片段F89; 6為PCR擴增片段FlO; 7為PCR擴增片段Fl I ；圖25間接免疫螢光檢測乙腦/登革2型嵌合病毒JD2的實驗結果。其中A、B、C是登革2型病毒感染細胞後分別用登革2型單克隆抗體、JEV E單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；D、E、F是嵌合病毒JD2分別用登革2型單克隆抗體、JEV E單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；G、H、I是乙腦恢復病毒rJEV分別用登革2型單克隆抗體、JEV E單克隆抗體和JEVNSl單克隆抗體檢測的結果；J、K、L是未感染病毒的細胞分別用登革2型單克隆抗體、JEV的E單克隆抗體和JEV NSl單克隆抗體檢測的結果；圖26乙腦/登革2型嵌合病毒JD2蝕斑形態及大小；圖27乙腦/登革2型嵌合病毒JD2在原代地鼠腎細胞上的生長曲線；圖28乙腦/登革2型嵌合病毒JD2的免疫原性檢測結果；圖29有8個鹼基缺失的乙腦/登革3型嵌合5 』半分子pJD3-5 』雙酶切(Kas I /Bgl II )鑑定電泳圖；圖30融合PCR擴增1-3446片段，消除缺失的8個鹼基；圖31乙腦/登革3型嵌合5』半分子BAC53JD3-5』雙酶切鑑定電泳圖，泳道I為BamH I單酶切，泳道2為Asc I /BamH I雙酶切；圖32用於構建含有SalI酶切位點的JEV 3』半分子pJEV_3』(Sal I )的JEV-Fll片段PCR擴增電泳
圖33含SalI酶切位點的JEV3』半分子pJEV3』 (Sal I)酶切鑑定電泳圖，泳道I是Xho I /Xba I雙酶切，泳道2為Sall/Xbal雙酶切；圖34乙腦/登革3型嵌合全長克隆BAC53JD3FC質粒用HindIII限制內切酶進行酶切鑑定的電泳圖，泳道I為PJD3質粒，Ml為分子量標準DL 15，000, M2為分子量標準DL2, 000 ；圖35乙腦/登革3型嵌合全長克隆BAC53JD3FC質粒用XhoI限制內切酶進行酶切鑑定的電泳圖，泳道I為PJD3質粒，M為分子量標準DL15，000 ；圖36乙腦/登革3型嵌合全長克隆BAC53-JD3FC體外轉錄RNA電泳圖，I為體外轉錄RNA，Ml為分子量標準DL15，000, M2為分子量標準DL2，000 ；圖37PHK細胞的病變情況，與對照細胞相比(左)，感染了乙腦/登革3型嵌合病毒的細胞(右)出現明顯CPE ；圖38乙腦/登革3型嵌合病毒採用登革f登革4型特異檢測引物的RT-PCR鑑定結果，只有登革3型檢測引物擴增出長度為615bp的片段；圖39乙腦/登革3型嵌合病毒的蝕斑檢測結果，根據蝕斑計數得到的病毒滴度為5.931gPFU/ml ；圖40乙腦/登革3型嵌合病毒生長曲線，根據結果MOI為0.001為最佳感染劑量;圖41乙腦/登革3型嵌合病毒的Western blot鑑定。結果顯示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相應位置可觀察到清晰條帶，乙腦病毒未見條帶；圖42乙腦/登革3型嵌合病毒JD3的免疫原性測定結果；圖43乙腦/登革4型5』半分子克隆pJD4-5』質粒的電泳圖譜。pJD4_5』half 質粒大小為6.3kb ；圖44乙腦/登革4型5』半分子克隆pJD4_5』質粒的酶切鑑定圖譜。pJD4_5』質粒經KasI和BglII雙酶切為4.1kb和2.2kb片段；
圖45乙腦/登革4型全長克隆pJD4FC質粒的電泳圖譜。PJD4FC質粒大小為
13.6kb ；圖46乙腦/登革4型全長克隆PJD4FC質粒的酶切鑑定圖譜。pJD4FC質粒經BspEI和MluI雙酶切為8.9kb和4.7kb片段；圖47pJD4FC體外轉錄產物的電泳圖譜；圖48BHK21細胞的病變情況，與對照細胞相比(左)，轉染了 PJD4FC體外轉錄物的細胞(右)出現明顯CPE ；圖49PHK細胞的病變情況，與對照細胞相比(左)，感染了乙腦/登革4型嵌合病毒JD4的細胞(右)出現明顯CPE ；圖50乙腦/登革4型嵌合病毒的RT-PCR鑑定結果，採用4對引物分別擴增出長度為 2078bp、2155bp、820bp 和 1608bp 的片段；圖51乙腦/登革4型嵌 合病毒的蝕斑檢測結果，根據蝕斑計數得到的病毒滴度為5.991gPFU/ml ；圖52乙腦/登革嵌合病毒在PHK細胞中的生長曲線；圖53乙腦/登革嵌合病毒的Western blot鑑定。結果顯示嵌合病毒在登革病毒E蛋白相應位置可觀察到清晰條帶，乙腦病毒未見條帶；圖54乙腦/登革4型嵌合病毒JD4的免疫原性檢測結果。具體實施實例實施例1:含JEV疫苗株SA14-14-2全長感染性全長cDNA克隆的構建、鑑定及重組病毒的恢復一、載體的改造(I)低拷貝質粒pACNR的改造分別溶解引物01igo-l(5』 -CGCGCCATTAGGCGCCTTATAGATCTAATGTCCGGATTATGGATCCTGATTGATCATTATTCTAGAATTAC-3』，下劃線處依次為 Kas1、BglI1、BspE1、BamH1、Bell、XbaI識別位點，人工合成)和 01igo-2(5』 -TCGAGTAATTCTAGAATAATGATCAATCAGGATCCATAATCCGGACATTAGATCTATAAGGCGCCTAATGG-3』 ,與Oligo-Ι形成互補雙鏈後，5』和3』端分別形成Ascl和Xhol酶切後粘端，人工合成)於100 μ I滅菌雙蒸水中，各取10 μ I混合，加熱到100°C後自然冷卻，取2 μ I與用AscI和Xhol雙酶切的pACNR於4°C連接過夜，轉化感受態細胞T0P10(天根生化科技(北京)有限公司)，挑取氨苄青黴素抗性克隆抽提質粒做測序鑑定(上海英濰捷基生物技術有限公司)。測序結果表明:酶切位點被植入質粒的多克隆區，得到多克隆區位點經改造的pACNR質粒。(2) BAC53載體的改造首先以載體pBAC53e3.6序列為模板設計如下三對引物:BAC53F1:5-GAAGCTTGGATCCGCATGCGTCGACCTCGAGCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3 (劃線部分為加入的部分多克隆酶切位點，依次為Hind III，BamH I，Bsiw I，Sal I和Xho I )BAC53R1:5-TTGGTACCTCTAGAACGCGTGGCTTCGCCCTGTCGCTCG-3 (劃線部分為限制內切酶酶切位點，Kpn I和Mlu I，其中MluI為引入的酶切位點)BAC53F2:5~GGACGCGTTGAGCGAGGAAGCACCAGGGAAC~3 (劃線部分為人為加入的限制內切酶酶切位點Mlu I)BAC53R2:5~TGAATATGAAGATCTGGTACCCATCCGTGA~3 (劃線部分為限制內切酶酶切位點 Kpn I)BAC53F3:5~GGACGCGTCCTCAATGTATCACGGATGGGTACCAGATCT~3 (劃線部分為限制內切酶酶切位點，Mlu I和Kpn I，其中其中MluI為引入的酶切位點)BAC53R3:
5-GGAAGCTTGGCGCCGGCGCGCCGCTAGCGCGGCCGCAGCGACACACTTGCATCGGATGC-3 (劃線部分為加入的部分多克隆酶切位點，依次為Hind III，Kas I , Asc I和Not I )取2μ I pBAC53e3.6 質粒 DNA 為模板，分別用引物 BAC53F1 和 BAC53R1、BAC53F2 和BAC53R2、BAC53F3和BAC53R3配對擴增相應的PCR片段，分別命名為BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3。所用DNA聚合酶為美國NEB公司的PhusioiV超保真DNA聚合酶，擴增條件為:980C 2min 預變性；98°C 10sec,58°C 15sec,72°C 1.5min,30 循環；72°C IOmin0 擴增的 DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA進行加A反應:10 X LA buffer I μ I, dNTPl μ I, DNA7.5 μ 1，LA 0.5 μ I, 72。。30min.反應結束，直接與PR0MEGA公司的pGEM-T easy載體進行連接反應。2XRapid ligation buffer 5 μ I, pGEM-T easyl μ I,加 A 的 PCR 產物 3 μ 1，T4DNA ligase I μ 1，4°C連接過夜。連接產物轉化感受態細胞T0P10，鋪於含有100ug/ml的氨苄青黴素LB平板，次日，挑取無色菌落增菌培養，抽提質粒進行測序鑑定。將測序正確的上述三個片段的克隆分別用限制內切酶HindIII和Mlul、MluI和 Kpnl、KpnI 和 HindIII 酶切消化，回收片段 BAC53-P1、BAC53-P2、BAC53-P3, T4DNAIigasel μ I, 4°C連接過夜。連接產物轉化感受態細胞DH10B，鋪於含有25ug/ml氯黴素的LB平板，次日，挑取無色菌落增菌培養，抽提質粒進行測序鑑定，命名為BAC53，經測序，其序列如SEQ ID N0.1所示。用限制內切酶HindIII和Kpn I進行酶切驗證，如圖1所示，酶切圖譜和理論一致。二、JEV減毒株SA14-14-2病毒cDNA的製備(I) JEV減毒株SA14-14-2病毒RNA的抽提JEV疫苗病毒(SA14-14-2株)由成都生物製品研究所有限責任公司生產，按說明書復溶，取400 μ I病毒液用Roche公司生產的RNA抽提試劑盒(Highpure viral RNA kit)進行RNA的抽提(按說明書進行)，RNA保存於-80°C備用。(2 )病毒cDNA的逆轉錄將提取的病毒RNA (分別取11 μ I)分別用兩條引物RR5 (5』 -GACTGCTTCCTGTGATTGCA-3』)和 RRl3 (5』 -AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3』)逆轉錄病毒 cDNA,所用試劑盒為 Invitrogen 公司 SuperS criptTMIII Reverse Transcriptase,引物由上海英濰捷基生物技術有限公司合成,方法參照試劑盒說明書進行。(3)病毒cDNA片段的PCR擴增及測序取病毒cDNA 2 μ I為模板，分別引物Fl和RU F2和R3、F4和R4、F5和R6、F7和R8、F9和R10、F11和Rll配對擴增相應的cDNA片段(引物信息見表1)，所用DNA聚合酶為TaKaRa公司的PrimeSTAR，用降落PCR(Touch-down PCR)進行擴增，擴增條件為:98°C2min ；98 °C IOsec, 58.5 O — 53.5 °C IOsec 72 °C kb/min, 10 循環；98 °C IOsec 53.5 °C IOsec,720C kb/min, 20循環；72°C IOmin0擴增的DNA片段用TaKaRa公司的DNA聚合酶LA進行加A反應:10XLAbufferl μ 1，dNTP I μ I, DNA 7.5 μ I, LA 0.5 μ I, 72°C 30min.反應結束，直接與 TaKaRa 公司的 T 載體 pMD19-T 進行連接反應。2 X ligation buffer 5 μ 1，pMD19_Tl μ 1，加A的PCR產物3 μ 1，ligasely 1，4°C連接過夜。連接產物鋪於含有氨苄青黴素、IPTG和X-gal的LB平板，次日，挑取無色菌落增菌培養，抽提質粒進行酶切和測序鑑定。表I克隆所用引物
權利要求
1.一種乙腦病毒感染性克隆，其特徵在於:它是包含乙腦病毒減毒株SA14-14-2基因組全長cDNA的重組載體。
2.根據權利要求1所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:所述重組載體是重組pACNR質粒或者重組細菌人工染色體，細菌人工染色體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求2所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:所述全長cDNA的5』端具有原核啟動子。
4.根據權利要求3所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:所述啟動子為SP6。
5.根據權利要求2所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:所述全長cDNA的3』端的轉錄終止位點為限制性內切酶酶切位點。
6.根據權利要求5所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:所述限制性內切酶酶切位點為 XhoI 或 Sail。
7.根據權利要求Γ6任意一項所述的病毒感染性克隆，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 或者 SEQ ID N0.3 所示。
8.一種嵌合病毒，其特徵在於:它由權利要求Γ7任意一項所述乙腦病毒感染性克隆構建而成，其中prM-Ε基因為登革病毒prM-E基因。
9.根據權利要求8所述的嵌合病毒，其特徵在於:所述登革病毒prM-E基因是登革病毒1、2、3或4型的prM-E基因。
10.根據權利要求9所述的嵌合病毒，其特徵在於:所述登革病毒I型為登革病毒ThD0008-81株；所述登革病毒2型為登革病毒PU0-218株；所述登革病毒3型為登革病毒PaH881-88株；所述登革病毒4型為登革病毒814669株。
11.根據權利要求9所述的嵌合病毒，其特徵在於:所述登革病毒prM-E基因的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.4 7所示。
12.根據權利要求8 11任意一項所述的嵌合病毒,其特徵在於:其核苷酸序列如SEQID N0.8 11任意一項所示。
13.權利要求8 12任意一項權利要求所述的嵌合病毒在製備登革熱疫苗中的用途。
14.一種登革熱疫苗， 其特徵在於:它是由權利要求8 12任意一項權利要求所述的嵌合病毒製備而成。
15.核苷酸序列如SEQID N0.1所示的細菌人工染色體。
全文摘要
本發明公開了一種乙腦病毒感染性克隆，它是包含乙腦病毒減毒株SA14-14-2基因組全長cDNA的重組載體；本發明還公開了一種嵌合病毒，以及該嵌合病毒的用途；以及一種SEQ ID NO.1所示的細菌人工染色體。本發明嵌合病毒能在多種人用疫苗生產用細胞上生長繁殖，並且生長特性類似，可以用於四個血清型登革疫苗的生產，並且，免疫原性強，產生的抗體滴度高，具有良好的應用前景，有較強的工業應用價值。
文檔編號A61P31/14GK103205460SQ20121042074
公開日2013年7月17日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者李玉華, 吳永林, 楊會強, 李竹石, 楊健, 林華, 趙宇, 俞永新, 董關木 申請人:成都生物製品研究所有限責任公司, 中國食品藥品檢定研究院