預防人類沙眼衣原體感染的重組蛋白及其用途的製作方法

2023-05-13 12:14:56

專利名稱：預防人類沙眼衣原體感染的重組蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程領域，具體地涉及基因工程重組蛋白疫苗(下文有時也稱為「基因工程重組蛋白」)，特別是涉及一種預防人類沙眼衣原體感染，尤其是預防泌尿生殖系統感染的重組蛋白疫苗；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有時也稱為「基因」)；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，以及該重組蛋白疫苗的製備方法；本發明還涉及該基因工程重組蛋白在製備用於預防人類沙眼衣原體感染的疫苗製品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗製品。
沙眼衣原體(Chlamydia Trachomatis，下文有時簡稱為「CT」)根據感染宿主的不同可分為小鼠生物型和人生物型，小鼠生物型可致鼠肺炎而與人類無關，而人生物型有15個血清型A、B、Ba、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3，其都是以人類作為唯一宿主的病原體。
A、B、Ba和C的感染可導致沙眼，人類可通過反覆感染沙眼衣原體，出現嚴重的角膜血管翳和形成瘢痕，這種損傷可引起瞼內翻倒睫，角膜渾濁加重導致失明。沙眼是世界上致人類失明的最主要的原因。
D～K可導致包涵體性結膜炎、泌尿生殖系統疾病，其泌尿生殖道感染是性傳播疾病，流行病學調查顯示，美國每年有300-400萬受感染人群。由於衣原體本身具有不易感染鱗狀上皮細胞而易侵犯柱狀上皮細胞的特性，宮頸表皮為柱狀上皮細胞，因而宮頸為CT感染的常見部位，進而CT沿柱狀上皮上行，導致子宮內膜炎，輸卵管炎，盆腔炎，並可造成輸卵管性不孕及輸卵管異位妊娠，嚴重威脅婦女健康。
孕期對CT易感性的升高導致孕婦感染率為20-30％，而CT通過垂直傳播又可導致胎兒感染。有學者報導，胎兒通過感染的宮頸，約50-70％成為CT感染新生兒，患有CT包涵體性結膜炎和肺炎。
性病淋巴肉芽腫(LVG)主要也是通過性接觸傳播。男性以腹股溝橫痃為常見，女性以肛門直腸淋巴結腫多見，病變逐步擴及其他淋巴結，有的淋巴結腫脹化膿、穿孔形成瘻管、晚期病變為外生殖器橡皮腫及直腸狹窄。因此，CT感染的危害性是相當大的，正因為如此，沙眼衣原體疫苗的研製顯得尤為重要和迫切。
經過幾十年的研究，一直無理想的疫苗問世，其部分原因是由於介導生殖道黏膜抗衣原體感染的宿主的免疫機制尚不完全明了。但根據基因敲除鼠及T細胞克隆的一些實驗提供證據表明CD4+T細胞在對衣原體生殖道感染的保護中起主要作用，而CD8+T細胞和體液免疫的作用則次要一些。上述觀點在這一研究領域已取得共識。
目前沙眼衣原體疫苗的研究熱點集中在以下幾個方面DNA疫苗(DNA vaccine)，沙眼衣原體DNA疫苗目前還存在很多問題如僅能誘導部分保護，Thl免疫反應和抗體反應均較弱。
減毒活疫苗(live attenuated chlamydia vaccine)，Hua Su等(HuaSu，Qonald Messer，William Whitmire等，雌性小鼠生殖道的亞臨床衣原體感染產生強烈的保護免疫反應減毒活疫苗菌株開發的結論(SubclinicalChlamydial Infection of the Female Mouse Genital Tract Generates a PotentProtective Immune ResponseImplications for Development of LiveAttenuated Chlamydial Vaccation Strains)，感染與免疫(Infection andImmunity)，January 2000年，1月，P.192-196，vol.68.)用沙眼衣原體感染後用少量土黴素幹涉治療，使小鼠處於輕度感染的亞臨床狀態，以達到類似於減毒活疫苗的效果，其實驗結果表明與自然感染相比，這種輕度感染後機體產生良好的保護性免疫，由此推斷減毒活疫苗可能具有非常好的前景。但事實上，人們對沙眼衣原體的基因系統尚不完全明了，無法實現減毒突變(attenuating mutation)，因此目前這種疫苗可能會導致嚴重的自身免疫或免疫病理反應。
DC(Dendritic Cells)細胞的回輸(chlamydia-pulsed DC)，Hua Su等用熱滅活的衣原體-脈衝DC(Heat-killed chlamydia-pulse DC)自體回輸的辦法，發現產生非常好的免疫效果(Hua su，Ronald Messer，William，等，1998.用使用非活性的衣原體體外裝載的樹狀細胞免疫後的抗衣原體腔道感染的接種(Vaccination against Chlamydial Tract Infection afterImmunization with Dendritic Cells Pulsed Ex Vivo with NonviableChlamydiae).實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)Volume 188，Number 5，September 7，1998 809-818)。就目前來講，用這種方法來實現免疫保護是不現實的，但它提示非活菌感染的免疫一樣可以實現免疫保護。
表位疫苗(Epitopes vaccine)，主要外膜蛋白(MOMP)是沙眼衣原體的最主要的一種外膜蛋白，很多實驗表明沙眼衣原體的MOMP能產生一定的保護性的免疫。在MOMP中已發現了20多個具有免疫原性的表位(Linette Ortiz，Karen P.Demick，Jean W.Petersen等，1996.激活來自感染的人的II型HLA-限制性T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白(Chlamydiatrachomatis Major Outer Membrane Protein(MOMP)Epitopes That ActivateHLA Class II-Restricted T Cells from infected Humans)，免疫學雜誌(TheJournal of Immunology)，1996，1574554-4567.)，從而為表位疫苗的設計奠定了一定的基礎。
目前的工作核心是如何提高疫苗的免疫原性和保護能力，延長免疫保護的時間。將熱休克蛋白65與已發現的MOMP上的一些表位相連為達到上述目的提供了一種可能性。
熱休克蛋白(heat shock protein，下文有時簡稱為「HSP」)是存在於多種生物體內的一個分子伴侶蛋白質家族。在免疫應答的過程中，熱休克蛋白可表現如下三種基本的功能1、協助抗原性物質進入包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞；2、在抗原提呈細胞中和加工處理的抗原物質相互作用使之進入MHC I類抗原提呈途徑，進而激活抗原特異性CTL；3、刺激樹突狀細胞表達協同刺激分子(如B7等)和分泌細胞因子等(SuzueK，Zhou X，Eisen HN，Young RA.Heat shock fusion proteins as vehicles forantigen delivery into the major histocompatibility complex class I presentationpathway.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 Nov 25；94(24)13146-13151)。由於具有上述特點，將熱休克蛋白65與已發現的MOMP上的一些表位相連形成融合蛋白以達到提高免疫原性和保護能力，以及延長免疫保護的時間的目的。
本發明之二是提供一種編碼這種重組蛋白的核苷酸序列。
本發明之三是提供一種含有該核苷酸序列的表達載體。
本發明之四是提供一種含有該表達載體的宿主細胞。
本發明之五是提供一種製備該重組蛋白疫苗的方法。
本發明之六涉及該基因工程重組蛋白在製備用於預防人類沙眼衣原體感染的疫苗製品中的用途。
本發明之七涉及含有該基因工程重組蛋白的疫苗製品。
因此，正是本發明人經過長期的大量的研究，解決了現有的技術難題，首次開拓性地將卡介苗熱休克蛋白65與沙眼衣原體MOMP上的一些表位相連形成了全新的基因工程重組蛋白，從而提高了抗衣原體感染的疫苗的免疫原性和保護能力，並延長了其免疫保護的時間。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內容的基礎上，本發明的其它具有實質性特點的方面和創造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是顯而易見的。


圖1是HSP65-Chlamy構建於PET28(a+)的模式圖。
圖2是三輪PCR結果瓊脂糖凝膠電泳照片，Line1DL2000 DNA marker2第一輪PCR 3第二輪PCR 4第三輪PCR。
圖3是pMD18T-chlamy重組質粒用EcolRI和HindIII酶切鑑定的瓊脂糖凝膠電泳照片，Line1DL2000 DNA marker 2重組質粒的酶切鑑定。
圖4是HSP65編碼基因克隆入pET28(a+)的重組質粒用NcoLI和EcoRI酶切鑑定瓊脂糖凝膠電泳照片Line1重組質粒的酶切鑑定2 DL2000DNA marker。
圖5是pET28(a+)-HSP65-chlamy重組質粒用EcolRI和HindIII酶切鑑定瓊脂糖凝膠電泳照片Line1DL2000 DNA marker 2重組質粒的酶切鑑定。
圖6是Hela單層細胞上接種CT-D 48～72小時後可見大量包涵體生長(20x)照片，白色箭頭所指為沙眼衣原體包涵體。
圖7是重組蛋白疫苗的表達及純化SDS照片1為蛋白質marker，2為目的蛋白的表達，3、4、5為目的蛋白的純化。
圖8是沙眼衣原體感染疫苗免疫後小鼠陰道組織輕度炎症照片白色線圈內示固有層血管擴張充血，散在淋巴細胞浸潤，纖維組織增生。
圖9是沙眼衣原體感染後小鼠陰道組織中度炎症照片白色線圈內示固有層血管有較多淋巴細胞浸潤。
圖10是沙眼衣原體感染後小鼠陰道組織3度炎症白色線圈內示固有層血管有大量淋巴細胞浸潤。
圖11是證明疫苗免疫組的抗體效價明顯高於PBS免疫組的用ELISA法檢測的C57小鼠抗體效價的直方圖1空白對照；2PBS免疫；3疫苗免疫；標本1-10。
「卡介苗熱休克蛋白65」是指來源於卡介苗的分子量為65kDal的熱休克蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO4所示。
「能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽」是指來源於沙眼衣原體主要外膜蛋白的9個表位相連接而形成的多肽，其胺基酸序列如SEQ ID N02所示。
「人沙眼衣原體感染」是指沙眼衣原體通過某種途徑進入人體並感染人的多種器官(如泌尿生殖系統、呼吸系統、眼瞼結膜等)的狀態，包括急性感染和慢性感染以及無症狀攜帶狀態。
「嚴緊的雜交條件」是指為避免反應體系中非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交複合物而採用的雜交條件，如較高的反應溫度和低離子強度。
″治療″或″預防″包括(1)預防疾病，也就是使疾病的臨床症狀不會在哺乳動物中發展，所述的哺乳動物可能與該疾病的病原體接觸或易患有該疾病但不曾經歷或顯現出疾病的該症狀，(2)抑制疾病，也就是阻止或減輕該疾病或其臨床症狀的發展，或(3)緩解疾病，也就是引起疾病或其臨床症狀的退化。
本發明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白，其中，所述的能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的多肽可為任何能激活人T細胞的主要外膜蛋白表位的胺基酸序列，優選地具有SEQID NO2所示的胺基酸序列或其功能等價物。在本發明的重組蛋白疫苗中，卡介苗熱休克蛋白65可為來源於卡介苗的分子量為65kDal的熱休克蛋白，其胺基酸序列優選地為SEQ ID NO4所示，或其功能等價物。其可以位於該融合蛋白的氨基端，能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位位於該融合蛋白的羧基端。
本發明的重組蛋白疫苗具有選自如下的任一胺基酸序列1)SEQ ID NO4所示的胺基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的胺基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
本發明還提供了編碼本發明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列，該核苷酸序列可以具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示或其功能等價物。
卡介苗熱休克蛋白65是一種來源於卡介苗的蛋白質，它和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位多肽相連融合形成的融合蛋白(序列如SEQ ID NO4所示)在進入人體後均可刺激人體DC細胞上調MHC(I類和II類)和共刺激分子(B7.2)的水平，分泌細胞因子，卡介苗熱休克蛋白65還有一獨特之處，它可以協助與它形成融合蛋白表位多肽進入包括樹突狀細胞在內的抗原提呈細胞，並進入MHC I類途徑加工提呈，進而激活抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)對病原菌進行特異性攻擊和殺傷，而且誘導這種CTL無須藉助於外源佐劑或CD4+細胞的參與。
本發明的重組蛋白疫苗可通過本領域已知的方法，例如按照MolecularCloning一書(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecularcloning，1989)所述進行生產，以下的實施例詳細地例舉了一種生產本發明的重組蛋白疫苗的方法。
因此，本發明還提供了含有上述編碼本發明的重組蛋白疫苗的核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，其可以為本領域常規的各種原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞；以及該重組蛋白疫苗的基因工程製備方法。
另外，本發明還涉及該基因工程重組蛋白在製備用於預防人類沙眼衣原體感染的疫苗製品中的用途以及含有該基因工程重組蛋白的疫苗製品。本領域技術人員可以理解的是，這些疫苗製品可用本領域周知的各種常規方法製備。
本發明的重組蛋白疫苗可通過皮下注射的方式給人接種，接種的劑量為100-500μg。為了加強效果，可進行2-3次的加強免疫。時間間隔可為2周-2月。
下面結合具體的製備實施例和生物學效果實施例，並參照附圖進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
在如下實施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標明一次。在其後所用相同試劑如無特殊說明，不在贅述上述內容。實施例1 表位基因的人工構建將主要外膜蛋白上所選定的表位基因串連在一起，並在氨基端構建EcoRI的酶切位點，在羧基端構建HindIII的酶切位點，獲取可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的編碼基因(以下稱之為「chlamy」)。
具體方法是通過3輪PCR循環對所選定的表位基因進行人工構建。引物3與引物4互為模板及引物，進行第一輪PCR；再以第一輪PCR產物為模板，以引物2及引物5為引物，進行第二輪PCR；再以第二輪PCR產物為模板，以引物1及引物6為引物，進行第三輪PCR。
引物序列如下primer1(chlamy-1)5』GAATTCCCGGCATACGGTCGTCATATGCAGGATGCTGAGATGTTCACCAACGCTGCTTGCATGGCT3』primer2(chlamy-2)5』AACGCTGCTTGCATGGCTCTCAACATTTGGGACGAGCTCAACGTACTGTGCAACGCTGCTGAGTTT 3』primer3(chlamy-3)5』TGCAACGCTGCTGAGTITACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTG 3』primer4(an-chlamy-3)5』CTGCCATTCGTGGTAGTCGATAGATGCGTCCTTAGTACCGGTAGCTGCGTCCAGAGCCAGCGGAAATTC 3』primer5(an-chlamy-2)5』GATGTACGGGGTAAACATGTTCAGACGATAAGACAGTGCCAGAGAAGCCTGCCATTCGTGGTAGTC 3』primer6(an-chlamy-1)5』AAGCTTGTAGGTGTCTGCGTCGAAAGAAGCACGAGACCATTTAACACCGATGTACGGGGTAAACAT 3』由引物3和引物4互為模板和引物進行第一輪PCR反應如下在一個500ul微量離心管中加入下列試劑引物3 2.5ul(10u mol/L)引物4 2.5ul(10u mol/L)10x PCR緩衝液(TakaRa公司，成分見產品說明)5μldNTPs(10mmol/L)1μlTaq DNA聚合酶(TakaRa公司)(5u/μl)0.5μl加去離子水至終體積50μl混合後加入礦物油3滴反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30個循環周期後，72℃延伸10min。形成第一輪PCR產物(產物1)如下(未寫出其互補鏈)TGCAACGCTGCTGAGTTTACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTGGACGCAGCTACCGGTACTAAGGACGCATCTATCGACTACCACGAATGGCAG第二輪PCR循環以產物1為模板，分別以引物2和引物5為5′端引物和3′端引物，反應體系如下產物1 1ul10(PCR緩衝液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl引物2和引物5各2.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.3μl加去離子水至終體積50μl混合後加入礦物油3滴反應條件94℃，1′；55℃，1′；72℃，1′，30個循環周期後，72℃延伸10min。形成第二輪PCR產物(產物2)如下(未寫出其互補鏈)AACGCTGCTTGCATGGCTCTCAACATTTGGGACGAGCTCAACGTACTGTGCAACGCTGCTGAGTTTACCATTAACAAGCCGAAAGGTTACGTAGGCAAAGAATTTCCGCTGGCTCTGGACGCAGCTACCGGTACTAAGGACGCATCTATCGACTACCACGAATGGCAGGCTTCTCTGGCACTGTCTTATCGTCTGAACATGTTTACCCCGTACATC第三輪PCR循環以產物2為模板，分別以引物1和引物6為5′端引物和3′端引物，反應體系如下產物2 1ul10×PCR緩衝液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl引物l和引物6各2.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.3μl加去離子水至終體積50μl混合後加入礦物油3滴反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，30個循環周期後，72℃延伸10min。形成第三輪PCR產物(終產物)SEQ ID No1。
三輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見附圖2。實施例2 表位基因的TA克隆採用TA克隆方法(J.Sambrook，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)克隆PCR產物，TA克隆的載體為PMD 18-T Vector(TakaRa公司)。具體方法如下一DNA的回收1.將第三輪PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE，150-200mA，0.5小時)；2.從瓊脂糖凝膠上切下含DNA片段的凝膠，放入一離心管中；3.加入3倍體積的溶膠液(北京鼎國公司)，45-55℃水浴5-10min使膠完全融化；
4.加入10ul玻璃奶(北京鼎國公司)，輕彈管底混勻，然後在45-55℃水浴5-10min，期間每2-3min混勻一次；5. 5000g離心60sec，棄上清；6.加400ul漂洗液，輕彈管底混勻玻璃奶，然後同上離心，棄上清；7.再加入400ul漂洗液，輕彈管底混勻玻璃奶，然後同上離心棄上清，並用加樣器儘量除淨漂洗液；然後室溫晾乾玻璃奶；8.加10-30ul無菌雙蒸水將玻璃奶懸浮起來，45-55℃水浴5-10min；9. 10000g離心2min，回收上清備用。二連接反應1.取3ul上清液電泳，並在紫外燈下觀察電泳帶，與marker相比較，估計回收DNA濃度；2.連接反應體系Insert DNA(序列參見SEQ ID NO1) 0.05-0.3pmolpMD18-TVect(TakaRa公司) 0.5-1ulSolutionI(TakaRa公司)5ulDH2O up to 10ul16℃反應1h三轉化 感受態細胞的製備方法是將大腸桿菌JM109(Novagen公司)在LB瓊脂培養基上劃線，37℃培養12-16h；次日從瓊脂平板上取一單菌落於2ml LB培養基中，37℃以225r/min速度震蕩培養12-16h；取1ml上述培養物接種於100ml LB培養基中，37℃以225r/min的速度震蕩培養直至OD值為0.5左右(大約3h)；將菌液冰浴2h，然後2,500g，4℃離心20min收集菌體；加入100ml冰冷的Trituration緩衝液(100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L醋酸鈉，pH5.5)，混勻，置冰上45min；1,800g，4℃離心10min，棄上清，加入10ml冰冷的Trituration緩衝液懸浮細胞；按每份200ul分裝，4℃可保存1-2周。若需長期保存，可加甘油至終濃度為15％，置-70℃備用。
轉化的方法是將200ul感受態細胞置冰上融化，然後加入3ul DMSO或β-巰基乙醇，混合後，加入10μl連接反應液(含重組質粒)，溫和混勻，置冰上30min；42℃ 45sec，然後迅速放回冰中1-2min；加入2ml LB培養液，37℃以225r/min的速度振蕩培養1h；4,000g離心10sec，棄上清，用200ul LB培養液重懸菌體；將菌液鋪於含有適當抗生素的LB瓊脂培養板上，塗勻，室溫放置20-30min，倒置於37℃孵箱中培養12-16h。
四鑑定用限制性內切酶消化的方法初步鑑定重組克隆。並由北京鼎國生物技術發展中心進行DNA的測序。測序結果無誤(具體序列參見SEQ ID No.1)。重組的pMD-18-chlamy質粒用EcoRI和HindIII酶切後釋放出chlamy(300bp)片段見附圖3。
五菌種及保存重組質粒冰凍保存於-20℃。含重組質粒的菌株在含20％甘油培養液中保存於-20℃或-70℃。
提取結核分枝桿菌基因組DNA的方法參照Molecular Cloning一書(J.Sambrook，從哺乳動物分離高分子量DNA(Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。
通過PCR自結核分枝桿菌分離熱休克蛋白65(HSP65)結構基因。5′端引物序列為5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′，3′端引物序列為5′GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CAT GCC ACC CAT 3′。
所述PCR操作程序是在一個500μl微量離心管中加入下列試劑模板cDNA 5μl(mmol/L)10×PCR緩衝液(含氯化鎂)5μldNTPs(10mmol/L)1μl5′端和3′端引物(0.01 mmol/L)各0.5μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl加去離子水至終體積50μl混合後加入礦物油3滴反應條件94℃，30sec；55℃，1min；72℃，2min，30個循環周期後，72℃延伸10min。
採用TA克隆方法克隆PCR產物，DNA的提取、連接及轉化方法見實施例2用限制性內切酶NcoI(TakaRa公司)和EcoRI(TakaRa公司)消化含HSP65的重組pMD18-T載體和pET28a(+)(Novagen公司)，反應體系如下7μl質粒DNA1μl 10x緩衝液(TakaRa公司)1ul 0.1％BSA(TakaRa公司)0.5μl限制性內切酶NcoI(10單位/μl)0.5μl限制性內切酶EcoRI(10單位/μl)37℃4h提取HSP65DNA插入片段和酶切後的pET28a(+)線性載體(方法見實施例2。在電泳後紫外燈下估算這兩種DNA的濃度。建立連接反應體系如下pET28a(+)線性質粒DNA 5ulHSP65DNA插入片段3ul10x T4DNA連接酶緩衝液1ulT4DNA連接酶1ul 16℃12h連接後的轉化方法見實施例2。具體序列參見SEQ ID No3(1-1638bp)。酶切鑑定結果見附圖4。實施例4構建卡介苗熱休克蛋白65-可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因提取插入了HSP65基因的表達載體pET28a(+)質粒(見實施例3)，並用限制性內切酶EcoRI和HindIII(TakaRa公司)消化該重組質粒和插入了可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位基因(chlamy)的pMD18-T(見實施例2)，反應體系如下8μg質粒(重組HSP65的pET28a或重組chlamy的pMD 18-T)1μl 10x緩衝液(TakaRa公司)0.5μl限制性內切酶EcoRI(10單位/μl)0.5μl限制性內切酶HindIII(10單位/μl)混合後37℃溫育30-120min。
如上述，用同樣的方法提取酶切後的線性質粒pET28a(+)和chlamy插入片段。並將二者進行連接連接反應質粒DNA(0.5μg/μl)3μlDNA插入片段(序列參見SEQ ID NO.2)(300ng/μl)5μl10xT4DNA酶連接緩衝液1μlT4 DNA連接酶1μl混合後置14-16℃水浴6-12h。
將該重組pET-28a(+)質粒轉化JM109大腸桿菌。方法同前。
卡介苗熱休克蛋白65-可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因的測序由北京鼎國生物技術發展中心承擔，結果表明，所得到的卡介苗熱休克蛋白65可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位多肽融合蛋白的基因和設計的完全一致。重組的pET-28a(+)-HSP65-chlamy質粒用EcoRI和HindIII酶切後釋放出chlamy(300bp)片段見附圖5。
7.加入磷酸鹽緩衝液來充滿柱，蓋上柱的上蓋，打開出口；8.讓柱開始以最小100個柱床體積/h流動，最短流動30min；9.如果柱中介質的容積需要調整，關閉柱的出口，打開柱的上蓋，加入更多的介質，然後應該再以最大流速衝洗柱至少30min。用金屬離子給介質充電在螯合介質能夠被用於純化過程以前，必須用所選擇的金屬離子為其充電。
1.用至少5個柱床體積的雙蒸水洗柱2.將3-5個柱床體積的20mM金屬離子溶液加到柱中；50mM鎳離子溶液的配製NiSO4.6H2O 13.1g雙餾水加到1000ml。
3.用5個柱床體積的洗脫緩衝液洗柱洗脫緩衝液20mM Tris，pH7.90.5M Nacl1M imidazole6M urea4.用10個柱床體積的結合緩衝液洗柱。
結合緩衝液20mM Tris，pH7.90.5M NaCl5mM imidazole6M urea吸附1.將樣品加到金屬螯合的柱中，並以預先確定的最佳流速讓其流過柱床；2.用含16mM咪唑的結合緩衝液洗柱，一直到流出物的吸收值回到基線水平。洗脫 用洗脫液洗脫時，會出現一個峰值，繼續洗脫直到吸收值不在下降為止，用容器接取不同時段的流出液，並進行SDS電泳，判定純化效果純度可達98％以上。純化後的SDS-PAGE見附圖7。
咪唑洗脫液20mM Tris，pH 7.9，0.5M NaCl，
1M imidazole，6M urea。實施例7 衣原體培養純化一培養1.在24孔板中加入Hela細胞(吉林大學新民校區基礎醫學院免疫教研室)1-2×105個/孔，1-2d融合成緻密的單層。
培養液用IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium，GIBCO)+10％的胎牛血清(天津TBD生物技術發展中心)100ug慶大黴素/ml。
2.棄取培養液，將菌種(北京協和醫院，D型沙眼衣原體)接種於細胞單層上，室溫下3000r/min/h，移去用於保存菌種的蔗糖-磷酸鹽運送液(簡稱SPGSucrose蔗糖75g，KH2PO40.52g，Na2HPO41.22g，glutamic acid 0.72g，H2O to 1 liter，pH7.4-7.6)。
3.加入衣原體生長液1ml IMDM+10％的胎牛血清100ug慶大黴素/ml 1ug/ml的放線菌酮。48-72h後倒置顯微鏡下可看到超過90％的細胞中長出衣原體，移去生長液，加入少許冷的SPG，用吸管反覆吹吸將細胞移下。胞懸液存於-70℃冰箱中。
純化(密度剃度離心法)1.細胞懸液用超聲波處理(20秒)2.懸液離心500g 15min 4℃取上清3.上清被平鋪在8ml 35％(vol/vol)腎造影劑(76％，上海淮海製藥廠)上.
35％腎造影劑65％0.01M HEPES含0.1M NaCl4. 4℃離心43000g 1h5.沉澱物被SPG重新懸起，集中在一起混勻.
6.混勻物被鋪在不連續的密度的造影劑上.
13ml 40％，8ml 44％，5ml 52％，4℃離心43000g 1h，EB位於44/52％的造影劑界面上。
7.收集3倍體積SPG稀釋，離心30000g 30min8.沉澱物用SPG重懸，儲存於-70℃。
Hela單層細胞接種沙眼衣原體48～72h後可見包涵體生長見附圖6。實施例8 疫苗免疫後，小鼠生殖道衣原體感染的保護性實驗一材料1.C57雌性小鼠(中國軍事醫學科學院)6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱」HSP65chlamy」)、PBS二方法1.將20隻小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組於0、14、21d每隻鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.在第21d每隻鼠注射5mg黃體酮3.在第28d陰道接種衣原體1.5×104IFU4.在第35d，將20隻鼠的陰道、子宮、輸卵管取出，進行組織病理學檢查。比較疫苗免疫組與PBS免疫組的病理情況。三 病理分級標準0正常1+最小反應(少量的炎症細胞)2+輕度反應(炎症細胞增加，伴有輕度間質增厚，並擴散到周圍脂肪組織)3+中等反應(炎症細胞顯著存在，伴有臨近脂肪組織的清除)4+嚴重反應(中度到嚴重的反應廣泛存在，伴受影響組織的清除，伴有臨近脂肪組織的多病灶壞死)。三實驗結果及結論PBS免疫組10例生殖系統標本卵巢和子宮內膜均正常；陰道的炎症反應7例為3+，3例為2+疫苗免疫組10例生殖系統標本卵巢和子宮內膜均正常；陰道的炎症反應2例為2+，8例為1+結論免疫了該疫苗後，小鼠的生殖系統的炎症減輕，疫苗產生了一定的保護作用。
各級炎症反應的病理切片見附圖8、9、10。實施例9 疫苗免疫後，小鼠足底實驗一材料1.C57雄性小鼠(中國軍事醫學科學院)，6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱「HSP65chlamy」)、PBS。二方法1.將20隻小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組於0、14、21d每隻鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.在第28d每隻小鼠左後腳掌足底皮下注射25ulPBS，右後腳掌皮下注射25ul 2×104IFU熱滅活的CT(56℃30min)。
3.在72h測量腳掌的厚度。三 實驗結果及結論1.PBS組左腳平均厚度2.8±0.2cm，右腳平均厚度3.1±0.42.疫苗組左腳平均厚度2.95±0.3，右腳平均厚度6.7±0.2實驗結果表明疫苗免疫組的小鼠的右腳註射了CT-D後，其腫脹的程度要明顯高於注射了PBS的左腳，也明顯高於PBS免疫組。實施例10 疫苗免疫後，CTL殺傷實驗一材料1.C57雄性小鼠，6-8周齡2.D型衣原體3.抗原HSP65及可激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白表位的融合蛋白(以下稱「HSP65chlamy」)、PBS二方法1.將20隻小鼠隨機分兩組，一組為疫苗免疫組，一組為PBS免疫組，疫苗組於0、14、21d每隻鼠在四個腋窩處注射共注射50ug。而PBS組用同樣的方法等體積注射PBS。
2.條件培養基(condition medium)的製備取一隻正常小鼠，斷頸處死後，酒精消毒腹部，用經過消毒處理的器具取出脾臟，放入無菌平皿中，轉移入超淨臺，用毛玻璃研碎，用完全培養液懸浮脾細胞，紗布過濾，2500r/min，5min，除去上清，用0.83％氯化銨1ml重懸，冰上2min，2500r/min，5min，除去上清，用完全培養液懸浮脾細胞，將其移入培養瓶中，並加入25ug刀豆蛋白A(ConA)，再加入完全培養液至總體積為5ml。培養37℃24h，2500r/min，5min，收集上清即為條件培養基。
3.靶細胞的抗原裝載提呈及Na251CrO4的標記1)將已在100ml培養瓶中長成稀疏單層約2×106個細胞時，倒出培養液，加入無血清IMDM+10％條件培養基，培養16-24h。
2)1ml 5×106IFU熱滅活的CT EBs中加入5ul的lipofectin，混勻，5min，然後加入1)中，37℃ 4h。
3)倒出瓶中液體，用0.25％胰酶(華美生物工程公司)消化，加入5ml完全培養液，計數，1200r/min，10min，重懸於100ul完全培養液中，轉移至無菌塑料管中，並加入100ul Na251CrO4(含200uCi)(PerkinElmer公司)，震蕩培養1h。
4)完全培養液洗3-4次。
5)用完全培養液將細胞的濃度調成1×105個細胞/ml。
4.將疫苗免疫和PBS免疫鼠的脾和淋巴節取出，研磨，脾細胞的處理如上述，並將脾和淋巴節細胞計數，調成2×107個細胞/ml。向96孔板中加入脾和淋巴細胞100ul，均設3個濃度梯度分別為2×107，1×107，5×106，設3復孔。
5.將標記好的B16細胞100ul加入含有效應細胞的孔中，並另設3復孔的自發釋放(100ul的靶細胞+100ul完全培養液)和最大釋放(100ul的靶細胞+100ul 2mol鹽酸)。
6. 37℃ 5％CO2，12-16h。
7.將96孔培養板以150g離心5min。
8.取100ul上清，將其移至塑料管(用於γ計數)9.用γ計數儀測定各管的cpm值。
10.殺傷率的計算殺傷率＝(實驗孔值-自發釋放孔值/最大釋放孔值-自發釋放孔值)*100％三 實驗結果及結論實驗結果表明疫苗免疫組的脾細胞和淋巴細胞對靶細胞具有一定的殺傷作用，在效靶比為100∶1的情況下，殺傷率平均為50-60％。而對照組的殺傷率平均為5-10％。實施例11 ELISA檢測免疫疫苗後C57小鼠抗體效價一材料C57小鼠(雄性6-8周齡)、衣原體CT-D、PBS、包被緩衝液1％BSA、羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎國公司)、OPD-底物緩衝液(0.2M Na2HPO425.7ml；0.1M檸檬酸24.3ml)二方法1.將純化後的衣原體置於56℃水浴中，30min。經預實驗後，1∶80用包被緩衝液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g加水至1000ml)稀釋。
2.包被加入96孔板，100ul/孔。4℃，過夜。
3.洗滌洗液洗板3次，5min/次。
4.封閉加1％BSA封閉，200ul/孔。40℃，1h。
5.洗滌洗液洗板3次，5min/次。
6.加樣將PBS免疫及疫苗免疫鼠(免疫方法同前)各10隻的血清用樣品稀釋液做100倍稀釋，100ul/孔。設復孔。40℃，30min。
7.加酶標抗體將羊抗鼠IgG-HRP(北京鼎國生物，0.1ml，1∶1000)用洗液稀釋500倍，100ul/孔。40℃，30min。
8.洗滌洗液洗板三次，5min/次。
9.顯色新鮮配製OPD-底物緩衝液，100ul/孔。室溫避光反應5-10min。
10.終止加2mol/L H2SO4，50ul/孔。
11.測A490。
實驗結果及結論1 空白對照0.003±0.0008；2 PBS免疫組0.1038±0.0095；3 疫苗免疫組0.435±0.012。
實驗結果表明疫苗免疫組的抗體效價明顯高於PBS免疫組序列表110北京迪威華宇生物技術有限公司120預防人類沙眼衣原體感染的重組蛋白疫苗及其用途1301604170Patent Inversion 3.12101211312212DNA213Chlamydia trachomatis220221CDS222(1)..(312)2234001gaa ttc ccg gca tac ggt cgt cat atg cag gat gct gag atg ttc acc 48Glu Phe Pro Ala Tyr Gly Arg His Met Gln Asp Ala Glu Met Phe Thr1 5 10 15aac gct gct tgc atg gct ctc aac att tgg gac gag ctc aac gta ctg 96Asn Ala Ala Cys Met Ala Leu Asn Ile Trp Asp Glu Leu Asn Val Leu20 25 30tgc aac gct gct gag ttt acc att aac aag ccg aaa ggt tac gta ggc144Cys Asn Ala Ala Glu Phe Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly35 40 45aaa gaa ttt ccg ctg gct ctg gac gca gct acc ggt act aag gac gca192Lys Glu Phe Pro Leu Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Thr Lys Asp Ala50 55 60tct atc gac tac cac gaa tgg cag gct tct ctg gca ctg tct tat cgt240Ser Ile Asp Tyr His Glu Trp Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg65 70 75 80ctg aac atg ttt acc ccg tac atc ggt gtt aaa tgg tct cgt gct tct288Leu Asn Met Phe Thr Pro Tyr Ile Gly Val Lys Trp Ser Arg Ala Ser85 90 95ttc 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權利要求
1.一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白。
2.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其具有選自如下的任一胺基酸序列1)SEQ ID No4所示的胺基酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與編碼1)的胺基酸序列的核苷酸序列雜交的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
3.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述的能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位的多肽具有SEQ ID No2所示的胺基酸序列。
4.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中，卡介苗熱休克蛋白65位於該融合蛋白的氨基端，能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位位於該融合蛋白的羧基端。
5.按照權利要求1所述的重組蛋白疫苗，它具有SEQ ID No4所示的胺基酸序列。
6.編碼權利要求1至5中任意一項所述的重組蛋白疫苗的核苷酸序列。
7.按照權利要求6所述的核苷酸序列，其具有選自如下的任一序列1)SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；和2)由在嚴緊的雜交條件下與1)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
7.按照權利要求6所述的基因，它具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
8.含有權利要求5-7中任一項的核苷酸序列的表達載體。
9.含有權利要求10表達載體的宿主細胞。
10.按照權利要求9所述的宿主細胞，其為原核細胞，真核細胞或哺乳動物細胞。
11.一種製備權利要求1-5中任一項的重組蛋白疫苗的方法，包括培養如權利要求9或10所述的宿主細胞。
12.權利要求1-5中任一項所述的重組蛋白在製備用於預防人類沙眼衣原體感染的疫苗製品中的用途。
13.按照權利要求12所述的用途，其中所述的人類沙眼衣原體感染是泌尿生殖系統感染。
14.一種用於預防人類沙眼衣原體感染的疫苗製品，含有權利要求1-5中任一項所述的重組蛋白和載體或賦形劑。
15.按照權利要求12所述的疫苗製品，其中所述的人類沙眼衣原體感染是泌尿生殖系統感染。
全文摘要
本發明提供了一種重組蛋白疫苗，它是由卡介苗熱休克蛋白65和能激活人T細胞的沙眼衣原體主要外膜蛋白的表位相連接而形成的融合蛋白；編碼這種重組蛋白疫苗的核苷酸序列；含有該核苷酸序列的表達載體；含有該表達載體的宿主細胞，以及該重組蛋白疫苗的製備方法。本發明的融合蛋白在應用於人體後可有效地預防沙眼衣原體感染。
文檔編號C07K14/195GK1478549SQ0214197
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月29日 優先權日2002年8月29日
發明者王麗穎, 楊思睿, 於永利 申請人:北京迪威華宇生物技術有限公司