新四季網

一種B肝病毒感染者血清標誌物及其用途的製作方法

2023-09-16 22:01:15 1

專利名稱:一種B肝病毒感染者血清標誌物及其用途的製作方法
技術領域:
本發明屬於生物技術和醫學領域。涉及一種新的B肝病毒感染者血清標誌物。 具體地說,本發明涉及可反映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A(CyClophilin A, CypA),其血清含量的測定方法,及其在慢性B肝診斷和治療中的用途。
背景技術:
B型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一種常見的傳染性疾病。據世界
衛生組織統計,全球約有3.5億人口由於無法清除病毒而發展為慢性攜帶者。隨著病情的 發展,在這些持續性感染患者中,每年有超過100萬人死於包括慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)及原發性肝癌(primary liver cancer)等在內的各類 由B肝病毒感染引起的肝臟疾病。中國是B肝病毒最為流行的地區之一,全國有6.9億人 曾感染過B肝病毒,其中1.2億人長期攜帶B肝病毒,據估計,目前全國有慢性B肝病人 2000萬人。B肝病毒感染嚴重危害了人類的健康,同時也引發一系列社會問題,是我國 現階段最為突出的公共衛生問題之一。目前國內外對B肝病毒感染者診斷所採用的血清標誌物均為B肝病毒的蛋白抗 原及抗體(表面抗原及抗體,E抗原及抗體,核心抗體),以及病毒的DNA。對於患者 的疾病是否活動則採用谷丙轉氨酶水平作為指標。此外還根據病情需要可作肝組織活檢 及超聲波或其他儀器輔助的檢測。B肝病毒感染者血清中,除完整的成熟病毒顆粒外,能檢測到大量由B肝病毒 表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)組成的球形或管狀亞病毒顆粒。在多數病 人血清中,HBsAg顆粒含量遠遠超過成熟病毒顆粒,HBsAg顆粒與病毒顆粒之比能高達 1000 1以上,甚至在檢測不到病毒複製的情況下,HBsAg仍能持續大量存在。如此大 量且持續性表達病毒包膜蛋白是B肝病毒獨有的特性,因此目前已被公認為是感染B肝 病毒的重要診斷指標。病人血清HBsAg持續陽性超過6個月仍未被清除即被認為罹患慢 性肝炎。此外,由於已知HBsAg誘生機體產生的抗體具有保護作用,因此HBsAg又是 製作預防性疫苗的主要組分。親環素A(cyclophilinA,CypA)是免疫抑制劑環孢菌素(cyclosporing A,CsA)
的受體,是免疫親和素家族(immunophilin,即PPIase酶)中的一員,也是細胞內的一種 伴侶蛋白,可影響細胞蛋白的摺疊。研究發現,CypA是一個多功能的細胞蛋白,參與了 多個重要的細胞生理活動,並在腫瘤發生、炎症反應的免疫調節、HIV病毒感染以及心 血管疾病等諸多方面都起到了重要的作用。近年來發現免疫親和素家族中的CypB可作 用於C型肝炎病毒NS5B亞基因片段,利用該基因片段作為藥靶,已開發研製抗C型肝炎 藥物。HBsAg在細胞內表達具有多種效應。近來有研究發現HBsAg在細胞內的表達和 分泌能顯著促進CypA的分泌。迄今,國內外尚無以CypA作為一種B肝病毒感染者的血 清標誌物。
與本發明有關的文獻Braaten, D.,and J.Luban.2001.Cyclophilin A regulates HIV—1 infectivity, asdemonstrated by gene targeting in human T cells.Embo J 20 1300—9.Castro, A.P., T.M.Carvalho, N.Moussatche, and C.R.Damaso.2003.Redistribution of cyclophilin A to viral factories during vaccinia virusinfection and its incorporation into mature particles.J Virol 77 9052-68.Jin, Z.G., M.G.Melaragno, D.F.Liao,C.Yan, J.Haendeler, Y.A.Suh, J.D.Lambeth, and B.C.Berk.2000.Cyclophilin A is a secreted growth factorinduced by oxidative stress.Circ Res 87 789-96Sokolskaja, E., D.M.Sayah, and J.Luban.2004.Target cell cyclophilin Amodulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.J Virol78 12800—8.Watashi, K., and K.Shimotohno.2007.Chemical genetics approach tohepatitis C virus replication cyclophilin as a target for anti-hepatitis C virusstrategy.Rev Med Virol 17 245—52Zhao, C., C.Y.Fang, X.C.Tian, L.Wang, P.Y.Yang, and Y.M.Wen.2007. Proteomic analysis of hepatitis B surface antigen positive transgenic mouseliver and decrease of cyclophilin A.J Med Virol 79 1478-8
發明內容
本發明的目的是提供一種新的B型肝炎病毒感染者血清標誌物。尤其涉及可反 映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A(CyClophilinA,CypA),其血清含量的測
定方法。由於CypA蛋白在B肝病毒表面抗原的作用下可自細胞內分泌至細胞外,進入血 液,從而可以在感染者血清中檢測CypA蛋白;鑑於細胞外的CypA蛋白具有吸引炎症細 胞的作用,因此血清中的CypA蛋白可反映感染者肝臟內炎症的嚴重程度。本發明建立 了在B肝病毒感染機體的血清中檢測CypA的方法,並進一步採用以CypA為血清標誌物 為判斷B肝病情發展嚴重程度提供參考標準。本發明的進一步目的是提供CypA在研製慢性B肝診斷製劑和治療藥物中的用途。本發明的進一步目的是提供一種慢性B肝診斷試劑盒,該試劑盒包含針對抗親 環素A的抗體和應用酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)檢測血清
蛋白水平的試劑盒所含的常規組份。本發明所述的CypA蛋白,其對應的核苷酸序列以及胺基酸序列均可從公開發布的GenBank資料庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得,其核苷酸序列的收錄號為 NM_021130.3,其胺基酸序列的收錄號為NP_066953.1。本發明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化,其包括
下述步驟1)採集標本採集慢性B肝病人血液或者實驗動物(小鼠)血液;2)分離血清室溫8000轉/分鐘條件下,離心10分鐘分離血清;3)檢測血清CypA含量其中,
Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標本血清蛋白分離後,用轉 膜儀以200mA恆流1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,經5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時後,用抗CypA抗體4°C孵育過夜,然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵 育2小時後,用市售的通用型電化學發光液(electrochemiluminescence,ECL)檢測膜上血 清CypA的含量;ELISA法用不帶標記物的抗CypA抗體包板,加入病人血清或者小鼠血清, 37°C孵育1小時後,洗板,再加入另一種帶有標記物(如辣根過氧化物酶)的CypA抗體 37°C孵育30分鐘,洗板後加入顯色液反應,用酶標儀在波長450nm處讀取OD值後計算
血清CypA含量。 4)分析CypA含量結果比較實驗組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與B肝病人血清CypA含量的 不同,並分析CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎症反應程度的相關性。本發明通過高壓尾靜脈注射技術在動物實驗中證明,HBsAg表達與CypA分泌 及肝內炎症反應具有相關性,而且使用藥物環孢菌素AfcyclosporineA,CsA)處理小鼠阻 斷CypA功能後即可降低炎症反應。並且這一現象也已在B肝患者的血清標本中得到證 實。本發明利用血清CypA蛋白的檢測技術,通過檢測B肝患者血清CypA的含量, 觀察感染者肝臟中的炎症程度,對B肝病人病程發展及預後可進行輔助診斷和監測。所 述的CypA蛋白可作為藥靶,研發與之作用的抗B肝藥物。在藥物研發中可採用CypA作 為標誌物篩選抗B肝的藥物,並以此作為判斷治療效果和評價藥物療效的標誌物。由於 每個個體CypA蛋白表達水平可有差異,還可採用CypA作為個體化治療的參考,以及作 為判斷病人對藥物敏感性以及有效性的標誌物。本發明的特點為不用肝穿刺等損傷性技術,通過檢測血清CypA水平的變化,了 解B肝感染者肝內的炎症反應變化,可簡便快捷的診斷慢性B肝病人的病情發展過程, 是一種新的對現有B肝患者血清標誌物的重要補充。


圖1是.HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎症反應的相關性,其中,用高壓尾靜脈注射技術將HBsAg表達質粒注入小鼠肝臟後,檢測血清 HBsAg和CypA含量,以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結果;(A)血 清HBsAg含量;(B)血清CypA含量;(OD)注射HBsAg的小鼠肝臟組織免疫組化染色 和蘇木精-伊紅染色結果,C中箭頭所示為HBsAg陽性肝細胞,D中箭頭所示為炎症浸 潤灶;(E-F)注射空載體質粒的對照組小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結^ ο圖2.是CsA處理後HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎症反應的相關 性,其中,用藥物CsA(CypA的抑制劑)先腹腔注射小鼠再如圖1處理小鼠,檢測小 鼠血清HBsAg和CypA含量,以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結果; (A)血清HBsAg含量;(B)血清CypA含量;(OD) CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結果;(E-F)未經CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結果;(G-H)注射空載體質粒的對照組小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精_伊紅染色結果。圖3是慢性B肝病人和健康正常人血清CyPA含量比較,其中,可見慢性B肝患者的血清CypA含量高於正常健康成人。圖4是肝移植病人手術前後血清CyPA含量比較,其中,可見同一個體在肝移植前血清CyPA含量高,而移植後多數血清CyPA下降;同時顯示個體間血清CyPA變化有所不同。
具體實施例方式實施例1動物實驗研究(1)構建HBsAg真核表達質粒根據GenBank 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開發表的 HBV 全基因組序 列C8(GenBank收錄號為AF461363)為模板,用已知技術設計PCR引物(上遊引物為 ctaggatccatggagagcacaacatcag,下遊引物為 gccgaattctcaaatgtatacccaaagac),應用 PCR 技 術擴增完整的HBsAg編碼序列。將擴增的HBsAg基因片段插入至Invitrogen公司的 pcDNA3.1質粒載體的多克隆位點區域的BamHI和EcoRI酶切位點之間,HBsAg基因表 達受CMV啟動子控制,可在真核細胞中表達。(2)利用已知的高壓尾靜脈注射技術使HBsAg在小鼠肝臟中表達將10 μ g HBsAg真核表達質粒稀釋於Ringer,s等滲緩衝液(154mM NaCl, 5.63mM KCl, 2.25mM CaCl2)後在5秒內由尾靜脈快速注入C57BL/6J小鼠體內。等滲 液體積為小鼠體重的10%。實驗用小鼠為6-8周,體重在18-20g左右。在注射後第4 天,摘眼球採血法收集小鼠血液並分離血清,隨後以脫頸椎法處死小鼠。取小鼠肝臟組 織,置於10%福馬林溶液中固定,用於免疫組化及HE染色實驗。(3)環孢菌素A或其衍生物藥物抑制實驗所述的CypA抑制實驗可用環孢菌素A或由環孢菌素A改造的各類衍生物藥物 進行,本發明中,選用藥物環孢菌素AfcyclosporineA,CsA)為CypA的抑制劑(目前作 為免疫抑制劑廣泛用於臨床),可與CypA結合併抑制其功能。將CsA用生理鹽水稀釋 至1.5mg/ml的濃度後以15mg/kg的劑量通過腹腔注射打入注射過HBsAg表達質粒的實
驗小鼠中。(4)血清HBsAg以及CypA含量檢測用上海科華生物工程有限公司的B型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒以ELISA的 方法檢測血清HBsAg的含量。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法分離血清蛋白後,以200mA恆流轉膜 1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,經5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2小時後,用 抗CypA抗體4°C孵育過夜,然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小時後,用市 售的通用型ECL電化學發光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。分析HBsAg血清含量與CypA血清含量的相關性。(5)蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色染色和免疫組化染色
將經福馬林固定過夜的肝臟組織用石蠟包埋,切片,隨後經脫蠟和抗原修復 後用10%正常羊血清室溫封閉15分鐘。切片中加入1 100稀釋的抗HBsAg單克隆抗 體,4°C溼盒孵育過夜。隨後用生物素標記的二抗,溼盒37°C孵育1小時。最後加入 DAB-H2O2顯色15分鐘左右,水洗終止顯色。用蘇木精復染後,封片,鏡檢觀察。觀 察小鼠肝臟細胞HBsAg的表達水平和炎症浸潤情況。(6)結果分析對實驗結果進行分析,研究HBsAg表達、CypA分泌以及炎性細胞浸潤三者的 相關性。結果表明,HBsAg能促進CypA的分泌,與對照組小鼠相比,HBsAg陽性的實 驗組小鼠血清CypA含量明顯上升。胞外CypA蛋白具有趨化因子的功能,能吸引炎症細 胞至HBsAg陽性的肝細胞周圍,造成局部的炎症浸潤現象。免疫組化和HE染色實驗結 果顯示,在HBsAg陽性的肝細胞常伴隨有炎症細胞浸潤的現象(圖1)。此外,CsA抑 制實驗顯示,用CsA處理小鼠後,CypA的趨化功能受到抑制,肝臟炎症浸潤現象明顯減 少(圖2)。結果表明CypA血清含量與HBsAg表達以及肝臟炎症反應具有相關性。CypA 可作為反映肝臟炎症反應和病毒蛋白表達情況的血清標誌物。CsA抑制實驗的結果表明 細胞蛋白CypA是潛在的HBV治療的靶點,可利用CypA作為篩選抗B肝藥物的標誌物, 以此判斷治療效果和評價藥物療效。實施例2慢性B肝病人血清CypA含量研究1.收集慢性B型肝炎病人和健康正常人的血清慢性B肝診斷的標準為血清HBsAg持續陽性至少6個月,血清轉氨酶水平升高 至少2倍以上,同時伴有其他相應的症狀。相應的對照組為沒有B肝病毒感染且血清轉 氨酶水平正常的將抗人群。所有樣品均排除了C型肝炎(hepatitis Cviras,HCV)、丁型 肝炎(hepatitis D virus, HDV)以及人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus 1, HIV-1)共感染的可能性。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法進行分離後,以 200mA恆流轉膜1小時,將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,經5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 小時後,用抗CypA抗體4°C孵育過夜,然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小 時後,用ECL化學發光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。結果顯示,與正常人相比, 慢性B肝患者的血清CypA含量顯著升高(圖3)。2.收集因B型肝炎而進行肝移植手術病人移植前後的血清 所有病人在肝移植手術前均為HBsAg陽性,手術後至少6個月內為HBsAg陰性 並且檢測不出HBV病毒DNA。所有樣品均排除了 HCV、HDV以及HIV共感染的可能 性。取Iul血清用western blot的方法用抗CypA抗體檢測血清蛋白CypA的含量。結果顯 示,與移植前相比,絕大多數病人在肝移植手術後HBV被清除的情況下,其血清CyPA 含量發生了明顯下降(圖4)。上述實驗結果表明血清CypA的含量與B肝病毒感染緊密相關,可以採用血清 CypA含量作為慢性B肝病情診斷的標誌物。
權利要求
1.一種B型肝炎感染者血清標誌物,其特徵在於,其具有親環素A蛋白的胺基酸序 列;其對應的核苷酸序列以及胺基酸序列為GenBank資料庫登錄,其核苷酸序列的收錄 號為NM_021130.3,其胺基酸序列的收錄號為NP_066953.1。
2.—種檢測權利要求1所述的B型肝炎感染者血清標誌物的方法,其特徵在於,通過 下述步驟1)採集標本採集慢性B肝病人血液或者實驗動物小鼠血液;2)分離血清室溫8000轉/分鐘條件下,離心10分鐘分離血清;3)血清CypA蛋白的含量測定採用Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標本血清蛋白分離後,用轉 膜儀以200mA恆流1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上,經5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時後,用特異性的抗CypA抗體4°C孵育過夜,然後用辣根過氧化物酶標記的二 抗室溫孵育2小時後,用ECL化學發光液檢測膜上血清CypA的含量;或,採用ELISA法用一種不帶標記物的抗CypA抗體包板,加入B型肝炎感染者血清 或者小鼠血清,37°C孵育1小時後,洗板,再加入另一種帶有標記物辣根過氧化物酶的 CypA抗體37°C孵育30分鐘,洗板後加入顯色液反應,用酶標儀讀取波長在450nm處的 OD值後計算血清CypA含量;4)分析CypA含量結果比較實驗組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與B型肝炎感染者血清CypA含量 的不同,並分析血清CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎症反應程度的相關性。
3.親環素A在製備治療慢性B肝藥物中的用途。
4.按權利要求3所述的用途,其中所述的藥物是環孢菌素A或其衍生物。
5.親環素A在製備慢性B肝診斷製劑中的用途。
6.按權利要求5所述的用途,其中所述的診斷試劑是用於診斷慢性B肝患者肝臟炎症 情況的診斷試劑盒,該試劑盒包含針對抗親環素A的抗體和應用酶聯免疫法檢測血清蛋 白水平的試劑盒所含的常規組份。
全文摘要
本發明屬於生物技術和醫學領域。涉及一種新的B肝病毒感染者血清標誌物。具體涉及可反映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A,其血清含量的測定方法,及其在慢性B肝診斷和治療中的用途。本發明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化,經實驗表明,所述的CypA蛋白在慢性B肝病人血清中顯著升高,並與肝臟炎症反應相關,可作為一種無創傷性、簡便、迅速的B肝病程發展的血清標誌物,進一步製備B肝診斷試劑盒和抗病毒藥物。建立的檢測技術可用於B肝感染者病程與預後的判斷、療效考核以及開發新型抗B肝病毒藥物。
文檔編號G01N21/76GK102023218SQ20091019575
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優先權日2009年9月16日
發明者田曉晨, 聞玉梅 申請人:復旦大學

同类文章

一種新型多功能組合攝影箱的製作方法

一種新型多功能組合攝影箱的製作方法【專利摘要】本實用新型公開了一種新型多功能組合攝影箱,包括敞開式箱體和前攝影蓋,在箱體頂部設有移動式光源盒,在箱體底部設有LED脫影板,LED脫影板放置在底板上;移動式光源盒包括上蓋,上蓋內設有光源,上蓋部設有磨沙透光片,磨沙透光片將光源封閉在上蓋內;所述LED脫影

壓縮模式圖樣重疊檢測方法與裝置與流程

本發明涉及通信領域,特別涉及一種壓縮模式圖樣重疊檢測方法與裝置。背景技術:在寬帶碼分多址(WCDMA,WidebandCodeDivisionMultipleAccess)系統頻分復用(FDD,FrequencyDivisionDuplex)模式下,為了進行異頻硬切換、FDD到時分復用(TDD,Ti

個性化檯曆的製作方法

專利名稱::個性化檯曆的製作方法技術領域::本實用新型涉及一種檯曆,尤其涉及一種既顯示月曆、又能插入照片的個性化檯曆,屬於生活文化藝術用品領域。背景技術::公知的立式檯曆每頁皆由月曆和畫面兩部分構成,這兩部分都是事先印刷好,固定而不能更換的。畫面或為風景,或為模特、明星。功能單一局限性較大。特別是畫

一種實現縮放的視頻解碼方法

專利名稱:一種實現縮放的視頻解碼方法技術領域:本發明涉及視頻信號處理領域,特別是一種實現縮放的視頻解碼方法。背景技術: Mpeg標準是由運動圖像專家組(Moving Picture Expert Group,MPEG)開發的用於視頻和音頻壓縮的一系列演進的標準。按照Mpeg標準,視頻圖像壓縮編碼後包

基於加熱模壓的纖維增強PBT複合材料成型工藝的製作方法

本發明涉及一種基於加熱模壓的纖維增強pbt複合材料成型工藝。背景技術:熱塑性複合材料與傳統熱固性複合材料相比其具有較好的韌性和抗衝擊性能,此外其還具有可回收利用等優點。熱塑性塑料在液態時流動能力差,使得其與纖維結合浸潤困難。環狀對苯二甲酸丁二醇酯(cbt)是一種環狀預聚物,該材料力學性能差不適合做纖

一種pe滾塑儲槽的製作方法

專利名稱:一種pe滾塑儲槽的製作方法技術領域:一種PE滾塑儲槽一、 技術領域 本實用新型涉及一種PE滾塑儲槽,主要用於化工、染料、醫藥、農藥、冶金、稀土、機械、電子、電力、環保、紡織、釀造、釀造、食品、給水、排水等行業儲存液體使用。二、 背景技術 目前,化工液體耐腐蝕貯運設備,普遍使用傳統的玻璃鋼容

釘的製作方法

專利名稱:釘的製作方法技術領域:本實用新型涉及一種釘,尤其涉及一種可提供方便拔除的鐵(鋼)釘。背景技術:考慮到廢木材回收後再加工利用作業的方便性與安全性,根據環保規定,廢木材的回收是必須將釘於廢木材上的鐵(鋼)釘拔除。如圖1、圖2所示,目前用以釘入木材的鐵(鋼)釘10主要是在一釘體11的一端形成一尖

直流氧噴裝置的製作方法

專利名稱:直流氧噴裝置的製作方法技術領域:本實用新型涉及ー種醫療器械,具體地說是ー種直流氧噴裝置。背景技術:臨床上的放療過程極易造成患者的局部皮膚損傷和炎症,被稱為「放射性皮炎」。目前對於放射性皮炎的主要治療措施是塗抹藥膏,而放射性皮炎患者多伴有局部疼痛,對於止痛,多是通過ロ服或靜脈注射進行止痛治療

新型熱網閥門操作手輪的製作方法

專利名稱:新型熱網閥門操作手輪的製作方法技術領域:新型熱網閥門操作手輪技術領域:本實用新型涉及一種新型熱網閥門操作手輪,屬於機械領域。背景技術::閥門作為流體控制裝置應用廣泛,手輪傳動的閥門使用比例佔90%以上。國家標準中提及手輪所起作用為傳動功能,不作為閥門的運輸、起吊裝置,不承受軸向力。現有閥門

用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法

專利名稱:用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置的製作方法背景技術:1-本發明所屬領域本發明涉及一種用來自動讀取管狀容器所載識別碼的裝置,其中的管狀容器被放在循環於配送鏈上的文檔匣或託架裝置中。本發明特別適用於,然而並非僅僅專用於,對引入自動分析系統的血液樣本試管之類的自動識別。本發明還涉及專為實現讀