一種B肝病毒感染者血清標誌物及其用途的製作方法

2023-09-16 22:01:15 1

專利名稱：一種B肝病毒感染者血清標誌物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫學領域。涉及一種新的B肝病毒感染者血清標誌物。 具體地說，本發明涉及可反映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A(CyClophilin A, CypA)，其血清含量的測定方法，及其在慢性B肝診斷和治療中的用途。
背景技術：
B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一種常見的傳染性疾病。據世界
衛生組織統計，全球約有3.5億人口由於無法清除病毒而發展為慢性攜帶者。隨著病情的 發展，在這些持續性感染患者中，每年有超過100萬人死於包括慢性活動性肝炎(chronic active hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)及原發性肝癌(primary liver cancer)等在內的各類 由B肝病毒感染引起的肝臟疾病。中國是B肝病毒最為流行的地區之一，全國有6.9億人 曾感染過B肝病毒，其中1.2億人長期攜帶B肝病毒，據估計，目前全國有慢性B肝病人 2000萬人。B肝病毒感染嚴重危害了人類的健康，同時也引發一系列社會問題，是我國 現階段最為突出的公共衛生問題之一。目前國內外對B肝病毒感染者診斷所採用的血清標誌物均為B肝病毒的蛋白抗 原及抗體(表面抗原及抗體，E抗原及抗體，核心抗體)，以及病毒的DNA。對於患者 的疾病是否活動則採用谷丙轉氨酶水平作為指標。此外還根據病情需要可作肝組織活檢 及超聲波或其他儀器輔助的檢測。B肝病毒感染者血清中，除完整的成熟病毒顆粒外，能檢測到大量由B肝病毒 表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)組成的球形或管狀亞病毒顆粒。在多數病 人血清中，HBsAg顆粒含量遠遠超過成熟病毒顆粒，HBsAg顆粒與病毒顆粒之比能高達 1000 1以上，甚至在檢測不到病毒複製的情況下，HBsAg仍能持續大量存在。如此大 量且持續性表達病毒包膜蛋白是B肝病毒獨有的特性，因此目前已被公認為是感染B肝 病毒的重要診斷指標。病人血清HBsAg持續陽性超過6個月仍未被清除即被認為罹患慢 性肝炎。此外，由於已知HBsAg誘生機體產生的抗體具有保護作用，因此HBsAg又是 製作預防性疫苗的主要組分。親環素A(cyclophilinA，CypA)是免疫抑制劑環孢菌素(cyclosporing A，CsA)
的受體，是免疫親和素家族(immunophilin，即PPIase酶)中的一員，也是細胞內的一種 伴侶蛋白，可影響細胞蛋白的摺疊。研究發現，CypA是一個多功能的細胞蛋白，參與了 多個重要的細胞生理活動，並在腫瘤發生、炎症反應的免疫調節、HIV病毒感染以及心 血管疾病等諸多方面都起到了重要的作用。近年來發現免疫親和素家族中的CypB可作 用於C型肝炎病毒NS5B亞基因片段，利用該基因片段作為藥靶，已開發研製抗C型肝炎 藥物。HBsAg在細胞內表達具有多種效應。近來有研究發現HBsAg在細胞內的表達和 分泌能顯著促進CypA的分泌。迄今，國內外尚無以CypA作為一種B肝病毒感染者的血 清標誌物。
與本發明有關的文獻Braaten, D.，and J.Luban.2001.Cyclophilin A regulates HIV—1 infectivity, asdemonstrated by gene targeting in human T cells.Embo J 20 1300—9.Castro, A.P., T.M.Carvalho, N.Moussatche, and C.R.Damaso.2003.Redistribution of cyclophilin A to viral factories during vaccinia virusinfection and its incorporation into mature particles.J Virol 77 9052-68.Jin, Z.G., M.G.Melaragno, D.F.Liao，C.Yan, J.Haendeler, Y.A.Suh, J.D.Lambeth, and B.C.Berk.2000.Cyclophilin A is a secreted growth factorinduced by oxidative stress.Circ Res 87 789-96Sokolskaja, E., D.M.Sayah, and J.Luban.2004.Target cell cyclophilin Amodulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.J Virol78 12800—8.Watashi, K., and K.Shimotohno.2007.Chemical genetics approach tohepatitis C virus replication cyclophilin as a target for anti-hepatitis C virusstrategy.Rev Med Virol 17 245—52Zhao, C., C.Y.Fang, X.C.Tian, L.Wang, P.Y.Yang, and Y.M.Wen.2007. Proteomic analysis of hepatitis B surface antigen positive transgenic mouseliver and decrease of cyclophilin A.J Med Virol 79 1478-8
發明內容
本發明的目的是提供一種新的B型肝炎病毒感染者血清標誌物。尤其涉及可反 映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A(CyClophilinA，CypA)，其血清含量的測
定方法。由於CypA蛋白在B肝病毒表面抗原的作用下可自細胞內分泌至細胞外，進入血 液，從而可以在感染者血清中檢測CypA蛋白；鑑於細胞外的CypA蛋白具有吸引炎症細 胞的作用，因此血清中的CypA蛋白可反映感染者肝臟內炎症的嚴重程度。本發明建立 了在B肝病毒感染機體的血清中檢測CypA的方法，並進一步採用以CypA為血清標誌物 為判斷B肝病情發展嚴重程度提供參考標準。本發明的進一步目的是提供CypA在研製慢性B肝診斷製劑和治療藥物中的用途。本發明的進一步目的是提供一種慢性B肝診斷試劑盒，該試劑盒包含針對抗親 環素A的抗體和應用酶聯免疫法(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)檢測血清
蛋白水平的試劑盒所含的常規組份。本發明所述的CypA蛋白，其對應的核苷酸序列以及胺基酸序列均可從公開發布的GenBank資料庫中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得，其核苷酸序列的收錄號為 NM_021130.3，其胺基酸序列的收錄號為NP_066953.1。本發明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化，其包括
下述步驟1)採集標本採集慢性B肝病人血液或者實驗動物(小鼠)血液；2)分離血清室溫8000轉/分鐘條件下，離心10分鐘分離血清；3)檢測血清CypA含量其中，
Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標本血清蛋白分離後，用轉 膜儀以200mA恆流1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時後，用抗CypA抗體4°C孵育過夜，然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵 育2小時後，用市售的通用型電化學發光液(electrochemiluminescence，ECL)檢測膜上血 清CypA的含量；ELISA法用不帶標記物的抗CypA抗體包板，加入病人血清或者小鼠血清， 37°C孵育1小時後，洗板，再加入另一種帶有標記物(如辣根過氧化物酶)的CypA抗體 37°C孵育30分鐘，洗板後加入顯色液反應，用酶標儀在波長450nm處讀取OD值後計算
血清CypA含量。 4)分析CypA含量結果比較實驗組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與B肝病人血清CypA含量的 不同，並分析CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎症反應程度的相關性。本發明通過高壓尾靜脈注射技術在動物實驗中證明，HBsAg表達與CypA分泌 及肝內炎症反應具有相關性，而且使用藥物環孢菌素AfcyclosporineA，CsA)處理小鼠阻 斷CypA功能後即可降低炎症反應。並且這一現象也已在B肝患者的血清標本中得到證 實。本發明利用血清CypA蛋白的檢測技術，通過檢測B肝患者血清CypA的含量， 觀察感染者肝臟中的炎症程度，對B肝病人病程發展及預後可進行輔助診斷和監測。所 述的CypA蛋白可作為藥靶，研發與之作用的抗B肝藥物。在藥物研發中可採用CypA作 為標誌物篩選抗B肝的藥物，並以此作為判斷治療效果和評價藥物療效的標誌物。由於 每個個體CypA蛋白表達水平可有差異，還可採用CypA作為個體化治療的參考，以及作 為判斷病人對藥物敏感性以及有效性的標誌物。本發明的特點為不用肝穿刺等損傷性技術，通過檢測血清CypA水平的變化，了 解B肝感染者肝內的炎症反應變化，可簡便快捷的診斷慢性B肝病人的病情發展過程， 是一種新的對現有B肝患者血清標誌物的重要補充。


圖1是.HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎症反應的相關性，其中，用高壓尾靜脈注射技術將HBsAg表達質粒注入小鼠肝臟後，檢測血清 HBsAg和CypA含量，以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結果；(A)血 清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD)注射HBsAg的小鼠肝臟組織免疫組化染色 和蘇木精-伊紅染色結果，C中箭頭所示為HBsAg陽性肝細胞，D中箭頭所示為炎症浸 潤灶；(E-F)注射空載體質粒的對照組小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結^ ο圖2.是CsA處理後HBsAg陽性小鼠血清CypA含量及其與肝臟炎症反應的相關 性，其中，用藥物CsA(CypA的抑制劑)先腹腔注射小鼠再如圖1處理小鼠，檢測小 鼠血清HBsAg和CypA含量，以及肝臟組織的免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色的結果； (A)血清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD) CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結果；(E-F)未經CsA處理組HBsAg陽性小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精-伊紅染色結果；(G-H)注射空載體質粒的對照組小鼠肝臟 組織免疫組化染色和蘇木精_伊紅染色結果。圖3是慢性B肝病人和健康正常人血清CyPA含量比較，其中，可見慢性B肝患者的血清CypA含量高於正常健康成人。圖4是肝移植病人手術前後血清CyPA含量比較，其中，可見同一個體在肝移植前血清CyPA含量高，而移植後多數血清CyPA下降；同時顯示個體間血清CyPA變化有所不同。
具體實施例方式實施例1動物實驗研究(1)構建HBsAg真核表達質粒根據GenBank 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開發表的 HBV 全基因組序 列C8(GenBank收錄號為AF461363)為模板，用已知技術設計PCR引物(上遊引物為 ctaggatccatggagagcacaacatcag，下遊引物為 gccgaattctcaaatgtatacccaaagac),應用 PCR 技 術擴增完整的HBsAg編碼序列。將擴增的HBsAg基因片段插入至Invitrogen公司的 pcDNA3.1質粒載體的多克隆位點區域的BamHI和EcoRI酶切位點之間，HBsAg基因表 達受CMV啟動子控制，可在真核細胞中表達。(2)利用已知的高壓尾靜脈注射技術使HBsAg在小鼠肝臟中表達將10 μ g HBsAg真核表達質粒稀釋於Ringer，s等滲緩衝液(154mM NaCl, 5.63mM KCl, 2.25mM CaCl2)後在5秒內由尾靜脈快速注入C57BL/6J小鼠體內。等滲 液體積為小鼠體重的10%。實驗用小鼠為6-8周，體重在18-20g左右。在注射後第4 天，摘眼球採血法收集小鼠血液並分離血清，隨後以脫頸椎法處死小鼠。取小鼠肝臟組 織，置於10%福馬林溶液中固定，用於免疫組化及HE染色實驗。(3)環孢菌素A或其衍生物藥物抑制實驗所述的CypA抑制實驗可用環孢菌素A或由環孢菌素A改造的各類衍生物藥物 進行，本發明中，選用藥物環孢菌素AfcyclosporineA，CsA)為CypA的抑制劑(目前作 為免疫抑制劑廣泛用於臨床)，可與CypA結合併抑制其功能。將CsA用生理鹽水稀釋 至1.5mg/ml的濃度後以15mg/kg的劑量通過腹腔注射打入注射過HBsAg表達質粒的實
驗小鼠中。(4)血清HBsAg以及CypA含量檢測用上海科華生物工程有限公司的B型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒以ELISA的 方法檢測血清HBsAg的含量。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法分離血清蛋白後，以200mA恆流轉膜 1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2小時後，用 抗CypA抗體4°C孵育過夜，然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小時後，用市 售的通用型ECL電化學發光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。分析HBsAg血清含量與CypA血清含量的相關性。(5)蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin，HE)染色染色和免疫組化染色
將經福馬林固定過夜的肝臟組織用石蠟包埋，切片，隨後經脫蠟和抗原修復 後用10%正常羊血清室溫封閉15分鐘。切片中加入1 100稀釋的抗HBsAg單克隆抗 體，4°C溼盒孵育過夜。隨後用生物素標記的二抗，溼盒37°C孵育1小時。最後加入 DAB-H2O2顯色15分鐘左右，水洗終止顯色。用蘇木精復染後，封片，鏡檢觀察。觀 察小鼠肝臟細胞HBsAg的表達水平和炎症浸潤情況。(6)結果分析對實驗結果進行分析，研究HBsAg表達、CypA分泌以及炎性細胞浸潤三者的 相關性。結果表明，HBsAg能促進CypA的分泌，與對照組小鼠相比，HBsAg陽性的實 驗組小鼠血清CypA含量明顯上升。胞外CypA蛋白具有趨化因子的功能，能吸引炎症細 胞至HBsAg陽性的肝細胞周圍，造成局部的炎症浸潤現象。免疫組化和HE染色實驗結 果顯示，在HBsAg陽性的肝細胞常伴隨有炎症細胞浸潤的現象(圖1)。此外，CsA抑 制實驗顯示，用CsA處理小鼠後，CypA的趨化功能受到抑制，肝臟炎症浸潤現象明顯減 少(圖2)。結果表明CypA血清含量與HBsAg表達以及肝臟炎症反應具有相關性。CypA 可作為反映肝臟炎症反應和病毒蛋白表達情況的血清標誌物。CsA抑制實驗的結果表明 細胞蛋白CypA是潛在的HBV治療的靶點，可利用CypA作為篩選抗B肝藥物的標誌物， 以此判斷治療效果和評價藥物療效。實施例2慢性B肝病人血清CypA含量研究1.收集慢性B型肝炎病人和健康正常人的血清慢性B肝診斷的標準為血清HBsAg持續陽性至少6個月，血清轉氨酶水平升高 至少2倍以上，同時伴有其他相應的症狀。相應的對照組為沒有B肝病毒感染且血清轉 氨酶水平正常的將抗人群。所有樣品均排除了C型肝炎(hepatitis Cviras，HCV)、丁型 肝炎(hepatitis D virus, HDV)以及人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus 1， HIV-1)共感染的可能性。取Iul血清用SDS-PAGE凝膠電泳的方法進行分離後，以 200mA恆流轉膜1小時，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 小時後，用抗CypA抗體4°C孵育過夜，然後用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小 時後，用ECL化學發光液檢測膜上血清蛋白CypA的含量。結果顯示，與正常人相比， 慢性B肝患者的血清CypA含量顯著升高(圖3)。2.收集因B型肝炎而進行肝移植手術病人移植前後的血清 所有病人在肝移植手術前均為HBsAg陽性，手術後至少6個月內為HBsAg陰性 並且檢測不出HBV病毒DNA。所有樣品均排除了 HCV、HDV以及HIV共感染的可能 性。取Iul血清用western blot的方法用抗CypA抗體檢測血清蛋白CypA的含量。結果顯 示，與移植前相比，絕大多數病人在肝移植手術後HBV被清除的情況下，其血清CyPA 含量發生了明顯下降(圖4)。上述實驗結果表明血清CypA的含量與B肝病毒感染緊密相關，可以採用血清 CypA含量作為慢性B肝病情診斷的標誌物。
權利要求
1.一種B型肝炎感染者血清標誌物，其特徵在於，其具有親環素A蛋白的胺基酸序 列；其對應的核苷酸序列以及胺基酸序列為GenBank資料庫登錄，其核苷酸序列的收錄 號為NM_021130.3，其胺基酸序列的收錄號為NP_066953.1。
2.—種檢測權利要求1所述的B型肝炎感染者血清標誌物的方法，其特徵在於，通過 下述步驟1)採集標本採集慢性B肝病人血液或者實驗動物小鼠血液；2)分離血清室溫8000轉/分鐘條件下，離心10分鐘分離血清；3)血清CypA蛋白的含量測定採用Western Blot的方法用SDS-PAGE凝膠電泳方法將標本血清蛋白分離後，用轉 膜儀以200mA恆流1小時的條件將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉溶液室溫 封閉2小時後，用特異性的抗CypA抗體4°C孵育過夜，然後用辣根過氧化物酶標記的二 抗室溫孵育2小時後，用ECL化學發光液檢測膜上血清CypA的含量；或，採用ELISA法用一種不帶標記物的抗CypA抗體包板，加入B型肝炎感染者血清 或者小鼠血清，37°C孵育1小時後，洗板，再加入另一種帶有標記物辣根過氧化物酶的 CypA抗體37°C孵育30分鐘，洗板後加入顯色液反應，用酶標儀讀取波長在450nm處的 OD值後計算血清CypA含量；4)分析CypA含量結果比較實驗組與對照組小鼠血清CypA含量或正常人與B型肝炎感染者血清CypA含量 的不同，並分析血清CypA含量與血清HBsAg含量以及肝臟炎症反應程度的相關性。
3.親環素A在製備治療慢性B肝藥物中的用途。
4.按權利要求3所述的用途，其中所述的藥物是環孢菌素A或其衍生物。
5.親環素A在製備慢性B肝診斷製劑中的用途。
6.按權利要求5所述的用途，其中所述的診斷試劑是用於診斷慢性B肝患者肝臟炎症 情況的診斷試劑盒，該試劑盒包含針對抗親環素A的抗體和應用酶聯免疫法檢測血清蛋 白水平的試劑盒所含的常規組份。
全文摘要
本發明屬於生物技術和醫學領域。涉及一種新的B肝病毒感染者血清標誌物。具體涉及可反映B肝患者臟器炎症反應的血清標誌物親環素A，其血清含量的測定方法，及其在慢性B肝診斷和治療中的用途。本發明通過Western Blot或ELISA方法檢測血清CypA蛋白的含量變化，經實驗表明，所述的CypA蛋白在慢性B肝病人血清中顯著升高，並與肝臟炎症反應相關，可作為一種無創傷性、簡便、迅速的B肝病程發展的血清標誌物，進一步製備B肝診斷試劑盒和抗病毒藥物。建立的檢測技術可用於B肝感染者病程與預後的判斷、療效考核以及開發新型抗B肝病毒藥物。
文檔編號G01N21/76GK102023218SQ20091019575
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月16日 優先權日2009年9月16日
發明者田曉晨, 聞玉梅 申請人:復旦大學