心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的製備方法及其用途的製作方法
2023-05-14 05:08:26
專利名稱：心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的抗體，尤其是與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單克隆抗體及其製備方法。
背景技術：
心血管類疾病歷來是人們健康的大敵。近年來，隨著生活水平的提高及工作社會壓力的不斷加大，心血管疾病的發病率歷年增加，心臟病已成為僅次於癌症的第二大死亡原因。在心臟病中尤其是心絞痛和心肌梗塞等缺血性心臟病的增加特別顯著，大約佔了因心臟病死亡的人數的4成。
脂肪酸結合蛋白(H-FABP)是一組至少由6種不同相對分子質量組成的蛋白質(14,000～15,000)。存在不同臟器中，心臟中的FABP和肝、小腸中的有明顯區別。它被認為是重要的脂肪酸載體蛋白，不僅在脂酸酸代謝中起作用，而且在心臟中的能量代謝中也起重要作用。心肌缺氧時，H-FABP釋放至細胞外，進入血液循環，使血中FABP含量升高。特別由於其分子量小和心肌中含量很高(0.46mg/g溼重)因而其特異性相對較高，在急性心肌梗塞(AMI)早期在血中就可查到其升高。肌紅蛋白(Mb)是另一種小分子(18KDa)蛋白質，其血漿動力學與FABP相似，可在心梗後2-3h出現於血中，也是急性心肌梗塞(AMI)早期檢測的有用指標，但由於Mb在骨胳肌中含量較高，因而缺乏特異性，其含量升高不能區分是來源於骨骼肌還是心肌。心臟肌鈣蛋白-I(cTnI)和肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB)對心肌損傷有較好的特異性，但對AMI早期診斷不佳，因其在AMI發生後6-8h才使血中濃度升高。
AMI最主要的搶救措施是溶栓治療，而溶栓治療成功的關鍵有賴於對AMI的早期診斷。對於急性心梗患者，搶救生命必須分秒必爭。目前最主要的搶救措施是溶栓治療，而溶栓治療者的存活率取決於壞死面積的大小，患者越快得到治療，存活的機率就越高。如果能在發病的4-6小時治療，患者康復的機會很大，如果過了6小時，往往再搶救也來不及了。
因此本領域迫切需要獲得與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的抗體，尤其是心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的一對單克隆抗體，從而可以開發出精準度高的早期診斷急性心梗的試劑盒。
發明內容
本發明的目的就是提供一種與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的抗體。
本發明的另一個目的就是提供一對與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單克隆抗體，並將其用於製備早期快速檢測急性心肌梗塞的試劑盒。
在本發明的第一方面，提供了一種單克隆抗體，它具有以下特性(a)特異性地與心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP結合；並且(b)所述抗體與抗原結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000。本發明提供的單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M。
在另一優選例中，所述的抗體可靈敏地檢測到ng/ml級的H-FABP(如1ng/ml的H-FABP)，並在1-200ng/ml範圍內呈線性。
本發明提供的單克隆抗體是一對配對的單克隆抗體，包括第一單克隆抗體和第二單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結合於H-FABP的不同表位。第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與H-FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。所述的單克隆抗體為IgG類型，包括IgGl、IgG2a和IgG3。
本發明提供的單克隆抗體重鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO1或3，輕鏈的胺基酸序列為SEQ ID NO2或4。
在本發明的第二方面，提供了一種製備所述的單克隆抗體的方法，它包括步驟(a)用心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合後，獲得雜交瘤細胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細胞中，選出產生的單克隆抗體與心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細胞中製得單克隆抗體。
在另一優選例中，所述的心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP是人的H-FABP蛋白。
在本發明的第三方面，提供了所述的單克隆抗體在製備快速檢測心肌梗塞的測試片或試劑盒中的應用。
所述的檢測心肌梗塞的測試卡，含有以下結構，從下至上依次為加入樣品的加樣區；金標抗體點樣區；讀取結果的測試區；吸收區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試卡的其他區域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區的樣品層析通過測試區。
在所述測試區有包被抗體點樣區，所述包被抗體點樣區包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試卡上設有金標抗體點樣區，所述的金標抗體沿樣品擴散方向擴散至包被抗體點樣區，最終被吸收區吸收，並且所述的金標抗體點樣區包含金標記的抗H-FABP的第一單克隆抗體，並且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結合於H-FABP，其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體是如權利要求1所述的單克隆抗體，並且結合於H-FABP的不同表位。
在另一優選例中，所述的金標抗體點樣區位於加樣區和測試區之間。
在另一優選例中，所述檢測卡還具有一基片，加樣區、金標抗體點樣區、測試區和吸收區位於基片上，加樣區、金標抗體點樣區、測試區和吸收區的厚度分別為0.05-5毫米，基片厚度為0.05-10毫米。
在另一優選例中，加樣區為濾血膜；金標抗體點樣區為玻璃纖維膜；檢測區為硝酸纖維素膜；吸收區為吸水材料；基片為PVC底板或紙板。
在另一優選例中，所述包被抗體點樣區中抗H-FABP的第二單克隆抗體的數量為0.01-50μg；金標抗體點樣區中抗FABP的第一單克隆抗體的數量為0.02-50μg。
在另一優選例中，用於此診斷試劑盒的兩個抗體HF2和HF10分別為IgGl和IgG2a亞型。
優選例中，至少有一個單抗是膠體金包被。
在本發明的第四方面，提供了一種檢測試劑盒，它含有上述的測試卡和說明書。
本發明提供的與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的抗體，尤其是心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的一對單克隆抗體，使得開發出的早期診斷急性心梗的試劑盒精準度高。
圖1顯示了Protein A純化的抗H-FABP的單克隆抗體HF2和HF10(經臨床檢測，HF2和HF10為最佳配對)。其中各泳道如下泳道1-3單克隆抗體HF2；泳道4-6單克隆抗體HF10；泳道M蛋白質標準物。
圖2顯示了夾心ELISA測試中H-FABP的濃度曲線。其中，HF2為包被抗體，HF10為標記抗體。H-FABP標準液用不含H-FABP的血清配製而成。
圖3顯示了本發明一種測試條的結構，其中箭頭方向為樣品流動方向。
圖4顯示了H-FABP金標快速診斷試劑盒對不同濃度H-FABP蛋白的檢測結果。圖片下方為檢測樣本中H-FABP的含量(ng/ml)。C處為質控線，T處為檢測線。當血清中H-FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現微弱條帶；隨著H-FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。
圖5顯示HF10重鏈的測序結果。
圖6顯示HF10輕鏈的測序結果。
圖7顯示HF2重鏈的測序結果。
圖8顯示HF2輕鏈的測序結果。
圖9A和9B分別顯示了抗體HF10的重鏈和輕鏈的胺基酸序列和DNA序列。
圖10A和10B分別顯示了抗體HF10的重鏈和輕鏈的胺基酸序列和DNA序列。
具體實施例方式
本發明人經過多年廣泛而深入的研究，針對臨床上對急性心梗早期診斷的需求，以心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)為靶點，獲得了兩個識別心臟型脂肪酸結合蛋白不同表位(抗原決定簇)的、高特異性的抗H-FABP單克隆抗體，並以此用雙抗體夾心法為原理製備了金標快速診斷測試片和試劑盒。在此基礎上完成了本發明。
心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)是一種已知蛋白，其胺基酸序列和核苷酸序列都是本領域已知的(見公知的GenBank資料庫)。
生產H-FABP的方法也是已知的。例如，通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用H-FABP的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的H-FABP蛋白。一般來說有以下步驟(1).用編碼人H-FABP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
對於本發明與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單抗V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR同與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab』)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明還提供了編碼單抗的DNA。本發明的與心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)特異性結合的單抗的抗原的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據FABP的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，按本領域技術人員已知的常規方法製備模板，通過擴增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以如上用常規技術，此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
此外，本發明還提供了一種檢測急性心梗的試劑盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶聯物，或其活性片段。
另一方面，製備抗H-FABP蛋白抗體的技術也是本領域中眾所周知。優選用於本發明的抗體是對人H-FABP具有特異性的單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人H-FABP蛋白或其片段。較佳地，指那些能與人H-FABP蛋白或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人H-FABP蛋白的分子，也包括那些並不影響人H-FABP蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人H-FABP基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人H-FABP基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人H-FABP蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。
單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的單克隆抗體可以利用人H-FABP基因產物或片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人H-FABP基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
特別優選的抗體是與H-FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M的抗體(即當抗體濃度為1×10-6-1×10-12M時，可以與1μg/ml H-FABP抗原有明顯結合(OD405nm大於0.5))。較佳地，與H-FABP的相對親合力為1×10-7-1×10-11M。更佳地，與H-FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M，最佳地為1×10-9-1×10-11M。
如本文所用，術語「測試片」、「測試條」或「測試卡」可互換使用，其含義相同。
參見圖3，本發明的測試片包括可加入樣品的加樣區30(較佳地，加樣區還包括覆蓋在上方的濾血膜40)；與加樣區側鄰的測試區20；
吸收區50，吸收區50的位置與加樣區30相對而且吸收區50相對測試片的其他區域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區30的樣品擴散通過測試區；其中，在所述測試區有包被抗體點樣區60，所述包被抗體點樣區包含固定化的抗H-FABP的第二單克隆抗體，在測試片上設有金標抗體點樣區62，所述的金標抗體點樣區位置是沿樣品擴散方向的在包被抗體點樣區的上遊，並且所述的金標抗體點樣區包含金標記的抗H-FABP的第一單克隆抗體。在圖1所示的優選例中，金標抗體點樣區62可位於加樣區。當然，金標抗體點樣區還位於加樣區和測試區之間，或者位於測試區中。
圖3中，80為血樣，當血樣滴在點樣區上後，會被吸收區吸引向箭頭方向擴散，先與金標抗體點樣區62中金標記的抗H-FABP的第一單克隆抗體結合，形成「第一單克隆抗體-H-FABP」複合物。該複合物繼續向吸收區擴散，進入測試區，然後與測試區中包被抗體點樣區60中固定化的抗H-FABP的第二單克隆抗體，形成「第一單克隆抗體-H-FABP-第二單克隆抗體」複合物，並停留在包被抗體點樣區，並顯出檢測結果(見圖4)。此外，血樣樣品會繼續向吸收區擴散，與對照區72中固定化的抗金標抗體的抗體(如羊抗鼠抗體)或FABP結合，作為測試條的質控對照。
由於本發明首次採用對H-FABP有高親和力(相對親合力為1×10-6-1×10-12M)，且識別不同表位的單克隆抗體，因此不僅靈敏度非常高，而且可以極其快速地檢測出血液中H-FABP，將現有技術中需數小時才能獲得檢測結果縮短到數分鐘(通常5分鐘即能讀到結果)，這對於救治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言具有極其重大的意義。
本發明的主要優點在於(a)本發明的抗體對H-FABP有極其優異的特異性，裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000或更高。
(b)本發明的一對抗體可靈敏地檢測到ng/ml級的FABP，並在1-100ng/ml範圍內呈線性。這一結果為金標試劑盒的開發奠定了基礎。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1雜交瘤細胞法製備單克隆抗體A.抗體的製備1.用常規的方法對BalB/C小鼠進行免疫，免疫原為人心臟組織中分離純化而得的天然H-FABP蛋白(購自美國Life Diagnostic公司)；2.初次免疫將100微克抗原與福氏完全佐劑充分乳化後，腹腔或皮下多點注射。以後每隔兩周，將50微克抗原與不完全佐劑混合後注射，共免疫四次；3.融合前3天加強免疫一次，然後取出脾臟，製備成脾細胞懸液；4.在PEG融合劑作用下與SP2/0細胞融合，並在HAT選擇培養基上篩選單克隆；5.經幾次融合，得到15株抗H-FABP特異的單克隆抗體株。
B.抗體的配對用於雙抗體夾心法進行免疫檢測的一對抗體必須識別抗原上不同的表位才能配對。在夾心ELISA法中，如包被抗體和標記抗體識別抗原上同一位點，則呈陰性結果；如包被抗體和標記抗體識別抗原上不同位點，則呈陽性結果。本實施例中，對HF10抗體用辣根過氧化酶進行標記，以HF2為包被抗體，以不同濃度的天然的H-FABP為夾心抗原，進行雙抗體夾心法檢測。
結果顯示，HF2和HF10在夾心ELISA試驗中配對良好，對H-FABP濃度的檢測在2ng/ml-100ng/ml範圍內呈線性(圖2)。
C.抗體的質量控制1.骨髓瘤細胞SP2/0，本身不合成或不分泌免疫球蛋白，來源歷史明確，保存條件符合要求。
2.細胞融合末次免疫後第三天取脾製成細胞懸液，與骨髓瘤細胞按1∶6到1∶10的比例混合，在PEG作用下進行細胞融合。
3.克隆化用Elisa法篩選出分泌目的抗體的雜交瘤，經有限稀釋法對其進行克隆，直至獲得具有穩定分泌單克隆抗體能力的雜交瘤細胞系。
D.雜交瘤細胞的鑑定抗體分泌穩定性經克隆化及連續傳代檢查，連續克隆化至檢測單克隆抗體的陽性率達100％。並在體外傳代三個月以上細胞株能保持穩定的分泌抗體。
E.單克隆抗體的鑑定1.亞型分類用Sigma鼠單抗亞型分類試劑盒(MouSe Monoclonalantibody Isotyping reagents)通過Elisa法確定單克隆抗體的亞型。篩到的兩個抗體HF2和HF10分別為IgGl和IgG2a亞型。圖12.親和力的測定Elisa法進行相對親和力的測定用1ug/ml FABP抗原包板，將抗體作系列稀釋，以抗體濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，以曲線上趨於平坦段的OD值為100％，查出其OD值為50％點的抗體濃度，此濃度值越低，親和力越高。
HF2和HF10單抗在此體系中測定的相對親和力均達0.5ug/ml.
3.特異性分析將所得到的單克隆抗體與系列無關抗原進行Elisa反應，檢測所得抗體是否與無關免疫原產生交叉反應。檢測結果，本實施例製得的抗體與其他抗原沒有交叉反應。
實施例2小鼠腹水法製備單克隆抗體A.抗體的製備1.製備腹水用的小鼠均為SPF級小鼠，生產小鼠均經過檢查並有合格證明，生產過程中如發生動物不健康、咬傷或感染則立即廢棄。
2.動物設備設施動物試驗均在上海第二醫科大學動物中心進行，為SPF級動物房，符合國家規定。
3.細胞庫的建立為了保證長期穩定地生產出符合要求的高質量單抗，首先要建立高標準的細胞庫，包括原始細胞庫、種子細胞庫和生產細胞庫，細胞管的位置、代數、管數、凍存、復甦的情況均有專人負責，每次生產腹水時取生產細胞管一支復甦擴增及生產，不再回凍。
4.細胞接種製備腹水的過程均在無菌條件下完成，注射雜交瘤細胞之前每隻小鼠腹腔注射降植烷(Sigma)0.5ml，一周後每隻小鼠注射雜交瘤細胞3x106。
5.腹水的採集注射細胞後一般7至10天一次性採集腹水，離心分離出上清即為粗提抗體，註明批號、採集日期，置-20°保存。
6.粗製抗體檢測用Elisa法測定抗體的效價，達到106以上為合格，可用於抗體純化。
B.抗體純化和鑑定一般用Protein A或protein G親和層析法純化，親和柱填料為美國Sigma公司產品，純化方法參照產品說明書。經純化後的抗體需經過一下檢測1.活性檢測用Elisa法測定抗體與抗原的反應活性2.純度測定SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定抗體純度，必要時還可用HPLC法測定。
3.蛋白含量測定Biorad BCA蛋白定量試劑盒，並以IgG標準品作標準曲線進行比較定量。
4.特異性的確定用Elisa法檢測與無關蛋白的反應以確定抗體的反應特異性。
實施例3抗體的測序目前應用的快速序列測定技術是Sanger等(1977)提出的酶法。首先合成互相獨立的若干組帶螢光標記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都有固定的起點，但卻隨機終止於特定的一種或者多種殘基上。由於DNA上的每一個鹼基出現在可變終止端的機會均等，因此，上述每一組產物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定鹼基在原DNA全片段上的位置所決定。然後在可以區分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣於測序凝膠中若干個相鄰的泳道這上，即可從凝膠的螢光機上直接讀出DNA上的核苷酸順序。測序結果見圖5-8。
HF10的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO1所示，DNA序列如SEQ ID NO5所示。
HF10的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，DNA序列如SEQ ID NO6所示。
HF2的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO3所示，DNA序列如SEQ ID NO7所示。
HF2的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO4所示，DNA序列如SEQ ID NO8所示。
實施例4膠體金法檢測H-FABP的方法和試劑盒根據臨床資料，H-FABP在正常人血清中的濃度高限為6.5ng/ml，一旦急性心梗發作，H-FABP的濃度馬上升高，甚至可達幾百到上千ng/ml。故將6.5ng/ml設為本試劑盒的臨界值。
(a)膠體金顆粒的製備(1)將HauCl4先配製成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。
(2)攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.0ml。
(3)繼續加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入後很快變灰色，續而轉成黑色，隨後逐漸穩定成紅色。全過程約2～3min。
(4)冷卻至室溫後用去離子水恢復至原體積。
用分光光度計掃描λmax來測量金顆粒的粒徑及均勻度。結果表明，製備的膠體金的可見光區最高吸收峰在525nm，估測製備的膠體金顆粒的直徑在35nm。吸收峰的峰形表明膠體金的均勻度較好。
(b)金標抗體的製備(1)在電磁攪拌下，將1ml抗體溶液(HF2或HF10，濃度為1mg/ml)加入50ml膠體金溶液中，加入抗體時應逐滴加入，繼續攪拌10分鐘。
(2)在磁性攪拌下加入牛血清白蛋白(BSA)，冰箱過夜。以保持標記膠體金的穩定。
(3)標記好的金標抗體溶液在4℃，10000xg，離心30min。吸取沉澱金復溶至5ml，在可見光區吸收峰為520nm處測得OD值。製備不同OD值的金標抗體(OD＝30，35，40)供金標抗體濃度的優化實驗用。
(c)抗體濃度的優化實驗分別把OD值為20、30、40、50的金標抗體溶液取1ul噴在玻璃纖維膜上，把濃度為0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml抗體溶液取1ul噴在硝酸纖維素膜上，用正交法決定出0.4mg/ml符合檢測靈敏度的抗體濃度為金標抗體OD值為30，檢測線上的抗體濃度為0.4mg/ml。
(d)試劑盒的製備檢測試劑盒的主要結構包括上樣區，測試區和吸收區。上樣區由全血濾膜和帶有金標記抗體的玻璃纖維膜組成，測試區為硝酸纖維膜，上有檢測線和質控線，吸收區由吸水濾紙組成(見圖3)。三區按順序裝配在塑料底板上並經切割包裝即完成。
(e)實驗室檢測結果用不含H-FABP的血清為稀釋液配成含不同濃度的H-FABP蛋白的標準溶液，用本金標試劑盒進行檢測。
結果如圖4所示，C處為質控線，T處為檢測線。當血清中FABP濃度為2ng/ml(接近正常人平均值)時，結果呈陰性；6.5ng/ml(即正常人高限)時，在T處出現微弱條帶；隨著FABP濃度(10和20ng/ml)升高，T處紅色加深。H-FABP含量越高，信號越強。
實施例5臨床初試結果用實施例3製備的心肌梗塞試劑盒，對26例病人的126個血清(含發病後的不同時間點)和12個正常人的血樣進行檢測。
26個心梗病人的120個血樣進行測試後，陽性符合率超過99％，僅一個病人的發病後1.5小時樣品未見明顯陽性，其它陽性標本全部符合。而其他現有試劑盒如CK-MB和肌鈣蛋白I和T等在發病3小時前幾乎不能測出。12個正常人的血樣11個顯示陰性，一個顯示為極弱陽性。這些數據初步提示了FABP診斷盒在臨床上的靈敏度和準確性。
此外，本發明試劑盒只需5分鐘即能讀到結果，這對於診治急性心肌梗塞這種爭分奪秒的疾病而言優勢是顯而易見的。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海單抗製藥技術有限公司120心臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的製備方法及其用途1300579781608170PatentIn version 3.12101211138212PRT213小鼠(Mus Musculus)4001Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ser20 25 30Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Lys Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Ser Leu65 70 75 80Gln Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr85 90 95Arg Ile Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Leu Asp Val Trp Gly100 105 110Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser115 120 125Val Tyr Pro Leu Ala Leu Glu Ser Leu Gly130 1352102211131212PRT
213小鼠(MuS Musculus)4002Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Val Glu Lys115 120 125Ser Leu Gly1302103211148212PRT213小鼠(Mus Musculus)4003Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr20 25 30Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Asp Trp Val35 40 45Ala Ser Ile Ser Arg Asp Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Ash Ile Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Ser Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Phe Asp Val Trp100 105 110Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro115 120 125Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Glu Ala Trp Glu Ser Arg Gly Leu Ala130 135 140Ala Gly Ser Met1452104211132212PRT213小鼠(Mus Musculus)4004Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg85 90 95Glu Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Glu Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala100 105 110Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Val Asp Lys
115 120 125Leu Gly Asn His1302105211414212DNA213小鼠(Mus Musculus)4005gaagtgaaac tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt acttctgtca tgtcttgggt tcgtcaaact120ccaaagaaaa ggctggagtg ggtcgcatcc attagtgatg gtggttacat ttattatcct180gacagtgtga agggccgatt caccatgtcc agagacaatg ccaggaacat cctgtccctt240caaatgagcc gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtacaag aatctcttat300tactacggta gtagtccgtc cctcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc360tcagccaaaa cgacaccccc atcagtctat cccttggccc tggaaagctt ggga 4142106211393212DNA213小鼠(Mus Musculus)4006gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac120caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct180ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat240cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gctttacacg300ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc360ttcccaccat ccagtgtcga aaaaagtttg ggg 3932107211444212DNA213小鼠(Mus Musculus)4007gaagtgaaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt acttatgtca tgtcttgggt tcgtcagact120ccagaaaaga gactggactg ggtcgcatcc attagtcgtg atggtggtta catttattat180cctgacactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa catcctgtac240ctgcaattga gcagtctgag gcctgaggac acggccatgt attactgttc aagagtctct300tattactacg gtagtagtcc gtccttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc360tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccattgg cccctgaagc ttgggaatcc420
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1.一種單克隆抗體，其特徵在於，它具有以下特性(a)特異性地與心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP結合；並且(b)所述抗體與抗原結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體，其特徵在於，它是一對配對的單克隆抗體，包括第一單克隆抗體和第二單克隆抗體，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結合於H-FABP的不同表位。
3.如權利要求1所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述的單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-6-1×10-12M。
4.如權利要求3所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述第一單克隆抗體和第二單克隆抗體與FABP的相對親合力為1×10-8-1×10-11M。
5.如權利要求3所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述的單克隆抗體重鏈的胺基酸序列為SEQID NO1或3，並且輕鏈的胺基酸序列為SEQID NOID NO2或4。
6.如權利要求3所述的單克隆抗體，其特徵在於，所述的單克隆抗體為IgG類型，包括IgG1、IgG2a和IgG3。
7.一種製備權利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特徵在於，它包括步驟(a)用心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP免疫小鼠；(b)將免疫小鼠的脾細胞和鼠骨髓瘤細胞融合後，獲得雜交瘤細胞(c)從步驟(b)的雜交瘤細胞中，選出產生的單克隆抗體與心臟型脂肪酸結合蛋白H-FABP結合的裸鼠腹水效價為1∶50000-1∶1000000的雜交瘤細胞；(d)從步驟(c)的雜交瘤細胞中製得單克隆抗體。
8.如權利要求1所述的單克隆抗體在製備快速檢測心肌梗塞的測試片或試劑盒中的應用。
9.一種檢測心肌梗塞的測試卡，其特徵在於，該測試卡含有以下結構，從下至上依次為加入樣品的加樣區；金標抗體點樣區讀取結果的測試區；吸收區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試卡的其他區域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區的樣品層析通過測試區；其中，在所述測試區有包被抗體點樣區，所述包被抗體點樣區包含固定化的抗FABP的第二單克隆抗體，在測試卡上設有金標抗體點樣區，所述的金標抗體沿樣品擴散方向擴散至包被抗體點樣區，最終被吸收區吸收，並且所述的金標抗體點樣區包含金標記的抗H-FABP的第一單克隆抗體，並且所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體可同時結合於H-FABP，其中，所述的第一單克隆抗體和第二單克隆抗體是如權利要求1所述的單克隆抗體，並且結合於H-FABP的不同表位。
10.一種檢測試劑盒，其特徵在於，它含有權利要求9所述的測試卡和說明書。
全文摘要
本發明的目的就是提供一種與心臟型脂肪酸結合蛋白(H－FABP)特異性結合的單克隆抗體，尤其是能與心臟型脂肪酸結合蛋白(H－FABP)特異性結合的一對配對的單克隆抗體，可以開發出特異性好、精準度高的早期診斷急性心梗的試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK1978465SQ200510111160
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月6日 優先權日2005年12月6日
發明者陳克勤, 勞燁, 黃大慶, 包維麗, 朱亞, 鄭健紅 申請人:上海單抗製藥技術有限公司