細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑...的製作方法

2023-05-13 22:48:46 3

專利名稱：：細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品。
背景技術：
：作為伴隨年齡增加而出現的皮膚彈性降低或老年斑及肥胖的這種老化症狀的原因，可列舉細胞功能降低、膠原等細胞外基質成分的減少或變性、紫外線引起的黑色素產生或色素沉著及細胞的氧化損傷、脂肪的蓄積等。為防止*改善這些老化症狀，目前已進行了對各種有效成分的篩查和組合的研究。作為細胞活化劑，已知櫳柑的精油(參見專利文獻1)，作為膠原產生促進劑，已知來自山毛櫸科山毛櫸屬植物的樹木的芽的提取物(參見專利文獻2)，作為膠原酶活性阻斷劑，已知選自草莓、丁香、枇杷、桑白皮、紫雲英中的1種以上的植物提取物(參見專利文獻3)，作為黑色素產生抑制劑，已知八角(大茴香)的精油(參見專利文獻4)，作為抗氧化劑，己知松蘿科松蘿屬植物的提取物(參見專利文獻5)，作為抗炎劑，已知茶多酚類(專利文獻6)，作為脂肪蓄積抑制劑，已知槲皮素(參見專利文獻7)。此外，未發現涉及以八寶樹的提取物作為有效成分的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品。專利文獻1:日本專利文獻特開2001—131045號公報專利文獻2:日本專利文獻特開平10—203952號公報專利文獻3:日本專利文獻特開2003—183122號公報專利文獻4專利文獻5專利文獻6專利文獻7曰本專利文獻特開平11一302149號公報日本專利文獻特開平10_182413號公報日本專利文獻特開平6—9391號公報日本專利文獻特開2000—344673號公報
發明內容發明要解決的課題目前使用的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品，實質效果有時也並不充分，期待開發更優異的有效成分。本發明是鑑於這些現有的問題點而完成的，目的在於提供由於來自天然而安全性高的、效果更優異的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食P叫o解決課題的手段本發明者們為解決上述課題，對各種天然物進行了研究，結果發現八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物具有優異的細胞活化作用、膠原產生促進作用、膠原酶活性阻斷作用、黑色素產生抑制作用、抗氧化作用、抗炎作用、脂肪蓄積抑制作用，從而完成了本發明。即，本發明提供含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品。作為八寶樹的提取物，利用選自水、生理鹽水、磷酸緩衝液、極性有機溶劑、超臨界流體以及亞臨界流體中的至少1種來提取八寶樹的提取物是適用的。其中，優選(1)常溫常壓下，用低級醇水溶液提取的提取物、(2)高溫高壓下，用水提取的提取物。用低級醇水溶液或水提取後，還可以進行冷凍乾燥除去水分。由於細胞活化、膠原產生促進、膠原酶活性阻斷、黑色素產生抑制、抗氧化、抗炎及脂肪蓄積抑制的效果更優異，作為八寶樹優選八寶樹幹燥粉碎物。八寶樹的提取物可被認為是通過作為DPPH自由基消除劑和SOD類活性劑(超氧化物消除劑)而發揮功能，產生抗氧化效果。另外，八寶樹的提取物可被認為是通過作為透明質酸酶活性阻斷劑及磷脂酶A2活性阻斷劑而發揮功能，產生抗炎效果。發明效果根據本發明，可提供具有優異效果的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑。另外，通過在皮膚外用劑中配合八寶樹的提取物，可提供在防止改善皺紋、鬆弛、皮膚緊繃、老年斑、晦暗這類皮膚老化症狀方面發揮優異效果的防止改善老化用外用劑或對黑色素產生抑制發揮優異效果的美白用皮膚外用劑、對抗炎性發揮優異效果的抗炎用皮膚外用劑、對脂肪蓄積抑制發揮優異效果的瘦身用皮膚外用劑。進而，通過在食品中配合八寶樹的提取物，可提供在美容、健康保持或營養補充方面發揮優異效果的食品o具體實施方式本發明中使用的八寶樹(Duabangagrandiflom)是海桑科八寶樹屬的植物。八寶樹(Duabangagrandiflora)是分布於從喜馬拉雅東部到紐幾內亞的落葉喬木，樹幹直立，高度為1040m。木材用於建築材料或茶具，果實有酸味，可被食用。八寶樹的提取物是提取八寶樹原料(作為提取對象稱作八寶樹)而得到的。提取時，可使用八寶樹的全草或其葉、杆、莖、枝、枝葉、果皮、果實、樹皮、樹葉、種子、根莖、根皮、根、花穗、頭狀花、花等的1或2處以上，但為使提取容易且效率高，可使用八寶樹的花、葉、莖或八寶樹樹皮。八寶樹可以直接提取，但考慮提取效率，優選先進行切細、乾燥、粉碎等處理再提取。作為提取方法，可適用在提取溶劑中浸漬的方法、或者採用超臨界流體或亞臨界流體的方法。為提高提取效率，也可以邊攪拌邊提取，或者在提取溶劑中一邊通過均質機或攪拌機使八寶樹原料均勻化一邊提取。作為提取溶劑，可使用水；甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、異丁醇、正己烷、甲基戊基醇、2—乙基丁醇、正辛醇等的低級醇(即碳原子數為6以下的醇)；甘油、乙二醇、乙二醇單甲醚、丙二醇單乙醚、雙丙甘醇、1,3—丁二醇、己二醇等的多元醇及其衍生物；乙醚、丙醚、異丙醚、正丁醚等醚；醋酸乙酯、醋酸異丙酯、醋酸丁酯等酯；丙酮、甲乙酮、甲基異丁基酮、甲基正丙基酮等的酮等的溶劑，從其中選擇使用1種或2種以上。此外，除水以外的上述提取溶劑相當於極性有機溶劑。作為提取溶劑也還可以使用角鯊烯、凡士林、石蠟、石蠟油等的烴；橄欖油、小麥胚芽油、米油、芝麻油、馬卡達姆堅果力夕'-、;7>於'乂7)(Macadamianuts)油、杏仁油、椰子油等的植物油脂；牛油、豬油、鯨魚油等的動物油脂；添加生理鹽水、磷酸緩衝鹽、磷酸緩衝生理鹽水等無機鹽類的極性溶劑或添加表面活性劑的溶劑。而且，也可以使用水或二氧化碳、乙烯、丙烯、乙垸、丙垸、一氧化二氮、二氟一氯甲垸、三氟一氯甲垸、氙、氨、甲醇、乙醇等的1種或2種以上的超臨界流體或亞臨界流體。即，也可以使用水或二氧化碳、乙烯、丙烯、乙垸、丙烷、一氧化二氮、二氟一氯甲烷、三氟一氯甲垸、氙、氨、甲醇、乙醇等進行八寶樹的超臨界提取或亞臨界提取。提取時的八寶樹原料與提取溶劑的比例沒有特別限定，但相對於1份原料優選0.11000質量倍的溶劑，考慮到使提取容易且有效率，更優選0.5100質量倍。作為提取溫度，從5'C左右到提取溶劑的沸點以下的溫度都適合。提取時間根據提取溶劑的種類或提取溫度的不同而不同，但適合的是1小時14天左右。另外，提取可以在常溫(室溫、例如104(TC)、常壓(1大氣壓=約100kPa)下進行，也可以使用高壓釜在高溫(例如50°C200°C，優選50150°C)高壓(例如100kPa500kPa，優選100kPa300kPa)下進行。進行超臨界提取、亞臨界提取時，優選在所用流體的臨界溫度以上且臨界壓力以上提取。例如，當使用二氧化碳作為超臨界流體時，優選在31。C以上且7.3MPa以上，當使用甲醇時，優選在239t:以上且8.1Mpa以上，當使用水時，優選在374"以上且22.1Mpa以上進行提取。作為八寶樹的提取特別優選的是，在常溫常壓下通過低級醇水溶液(例如甲醇水溶液或乙醇水溶液、特別是乙醇水溶液)來提取、在高溫(例如50200°C，優選50150°C，特別是120°C)高壓下通過水來提取。進行這樣的提取可以有效且確切地得到作為細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑或者脂肪蓄積抑制劑的功能優異的提取物。作為八寶樹的提取物，可列舉(1)八寶樹的提取液；(2)將八寶樹的提取液濃縮和/或乾燥後重新溶解於水或極性有機溶劑中所得的物質；(3)對八寶樹的提取液在不損害生理作用的範圍內進行脫色、除臭、脫鹽等精製處理或者通過柱色譜進行分級處理後的物質；(4)將八寶樹的提取液及進行了上述處理的八寶樹的提取液冷凍乾燥，在使用時再次溶解於水或極性有機溶劑中而成為使用狀態的物質等。這裡，所謂八寶樹的提取液，是指從八寶樹原料中提取的成分分散或溶解於提取溶劑中的狀態的物質。另外，作為上述極性有機溶劑，可列舉上述低級醇、多元醇、醚、酯、酮等。八寶樹的提取物具有優異的細胞活化作用、膠原產生促進作用、膠原酶活性阻斷作用、黑色素產生抑制作用、抗氧化作用、抗炎作用及脂肪蓄積抑制作用，可以用作細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品。以八寶樹的提取物為有效成分的細胞活化劑，對各種細胞具有細胞活化作用，特別是對真皮纖維芽細胞發揮出優異的細胞活化效果。細胞活化劑中八寶樹的提取物的含量，以細胞活化劑總量為基準，優選為0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。以八寶樹的提取物為有效成分的膠原產生促進劑，具有膠原產生促進作用，特別對於真皮纖維芽細胞中的I、III及IV型膠原產生發揮出優異的膠原產生促進效果。膠原產生促進劑中八寶樹的提取物的含量，以膠原產生促進劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量%。以八寶樹的提取物為有效成分的膠原酶活性阻斷劑，具有膠原酶(膠原分解酶)活性阻斷作用，特別是通過抑制I型膠原酶對I型膠原的分解，發揮優異的抗老化效果。膠原酶活性阻斷劑中八寶樹的提取物的含量，以膠原酶活性阻斷劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。以八寶樹的提取物為有效成分的黑色素產生抑制劑，具有黑色素產生抑制作用，對於老年斑雀斑這種色素沉著症狀發揮優異的黑色素產生抑制效果。黑色素產生抑制劑中八寶樹的提取物的含量，以黑色素產生抑制劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。以八寶樹的提取物為有效成分的抗氧化劑，具有抗氧化作用，特別是通過基於DPPH自由基消除作用、SOD樣活性作用(超氧化物消除作用)及過氧化脂質耐受性作用的抗氧化作用發揮優異的效果。抗氧化劑中八寶樹的提取物的含量，以抗氧化劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。以八寶樹的提取物為有效成分的抗炎劑，具有抗炎作用，特別是通過基於透明質酸酶活性阻斷作用及磷脂酶A2活性阻斷作用的抗炎作用發揮優異的效果。抗炎劑中八寶樹的提取物的含量，以抗炎劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。以八寶樹的提取物為有效成分的脂肪蓄積抑制劑，具有脂肪蓄積抑制作用，特別是對皮下脂肪細胞蓄積的中性脂肪發揮優異的脂肪蓄積抑制效果。脂肪蓄積抑制劑中八寶樹的提取物的含量，以脂肪蓄積抑制劑總量為基準，優選0.0001100質量％，更優選0.00150質量％。另外，通過將八寶樹的提取物配合在皮膚外用劑中，可以得到在皮膚老化症狀的防止改善方面發揮優異效果的防止改善老化用的皮膚外用劑或對黑色素產生抑制發揮優異效果的美白用皮膚外用劑、對抗炎性發揮優異效果的抗炎用皮膚外用劑、對脂肪蓄積抑制發揮優異效果的瘦身用皮膚外用劑。在皮膚外用劑中配合時的八寶樹的提取物的配合量，可根據皮膚外用劑的種類或使用目的進行調整，但一般地，以皮膚外用劑總量為基準，為0.00000110.0質量％，從效果或穩定性等方面來看，優選0.000015.0質量％，更優選0.00011.0質量％。配合八寶樹的提取物的皮膚外用劑(可用作細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑等的皮膚外用劑)的劑型是任意的，例如可作為洗劑(lotion)等的可溶化類、乳膏或乳液等的乳化類、爐甘油(carminelotion)等的分散系來提供。進而，可以以與噴射劑共同填充的氣霧劑、軟膏、顆粒、散劑、固狀等的各種劑型來提供。形態也是任意的，例如可以以化妝水、乳液、美容液、保溼霜等的基礎化妝品；防曬霜、防曬露、防曬油、爐甘油等的防曬商品；粉底(foundation)，眼線，睫毛膏，眼影(eyecolor),腮紅(cheekcolor),口紅等的化妝品；洗面奶、沐浴露、洗髮香波等的洗潔用品；染髮劑(rinse)、護髮素(treatment)、發膏(haircream)、髮油(hairoil)、整發劑等的毛髮用化妝品；香水或防臭抑汗劑等的形態來提供。另外，在配合八寶樹的提取物的皮膚外用劑中，除八寶樹的提取物以外，根據需要可適當地配合通常藥品、準藥品、皮膚化妝品、毛髮用化妝品及洗潔用品所能添加的油性成分、表面活性劑、保溼劑、顏料、粉體、色素、乳化劑、可溶化劑、洗潔劑、紫外線吸收劑、增粘劑、藥劑、香料、樹脂、防菌防蟎劑、酒精類等。此外，在不損害本發明的效果的範圍內，也可以與其他的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑或脂肪蓄積抑制劑合用。進而，八寶樹的提取物也可以用於以美容、健康保持或營養補給為目的的食品、飲料及藥品中。配合八寶樹的提取物的食品、飲料及藥品的劑型是任意的，例如可以以酊劑或點滴劑等的液體製劑、膠或飴等的固體製劑、或者膠囊、粉末、顆粒、片劑等的一般劑型來提供。此外，在配合八寶樹的提取物的食品、飲料及藥品中，除八寶樹的提取物以外，根據需要可適當地配合通常食品、飲料、藥品及準藥品所能添加的糖類、鹽類、醇類、胺基酸、著色劑、香料、甜味料、酸味料、防腐劑、增粘劑、藥劑等。此外，在不損害本發明的效果的範圍內，也可以與其他的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑或脂肪蓄積抑制劑合用。實施例下面對於八寶樹的提取物的製造例及用於評價各種作用的實驗，進行更詳細地說明，但本發明並不受這些實施例的任何限定。[製造例1]在八寶樹的花、葉、莖或樹皮的乾燥粉碎物100g中加入2.0kg的50容量％乙醇水溶液，室溫下邊攪拌邊提取2小時後，經過濾除去不溶物。將過濾得到的提取上清液減壓濃縮後，進行冷凍乾燥，得到八寶樹的提取物。在八寶樹的花、葉、莖或樹皮的乾燥粉碎物100g中加入2.0kg精製水，使用高壓釜在12(TC下加熱提取20分鐘後，經過濾除去不溶物。將過濾得到的提取上清液進行冷凍乾燥處理，得到八寶樹的提取物。利用通過上述製造例得到的八寶樹的提取物，進行用於評價各種作用的實驗。真皮纖維芽細胞活化作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104個接種正常人真皮纖維芽細胞。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加1質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加1質量。/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液，再孵育24小時。48小時孵育後，將樣品培養液換成調製成含有40(Vg/mL的MTT試劑的培養基，進一步孵育2小時。MTT(3—(4,5—二甲基一2—噻唑)一2,5二苯基四氮唑溴鹽)通過被細胞內的脫氫酶還原，四氮唑環開環生成藍紫色不溶性的甲簪(formazan)。因此，將生成的甲簪用2—丙醇提取，利用酶標儀測定550nm的吸光度。同時作為濁度測定650nm的吸光度，通過兩測定值的差評價真皮纖維芽細胞活化作用。另外，除樣品培養液以外，作為陰性對照使用添加l質量n/。FBS的DMEM培養基，作為陽性對照使用添加5質量y。FBS的DMEM培養基。樣品培養液中的真皮纖維芽細胞活化作用，是以當陰性對照(control)中的真皮纖維芽細胞活化作用定為100時的相對值來評價。表l顯示該評價結果。試tableseeoriginaldocumentpage11如表1所示，在樣品培養液中，可看出呈試樣濃度依賴性的真皮纖維芽細胞活化作用。由此明確可知，八寶樹的提取物具有真皮纖維芽細胞活化作用。I型膠原產生作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例2所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104個接種正常人真皮纖維芽細胞。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加0.5質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加0.5質量n/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液，再孵育24小時。培養上清液中分泌的I型膠原的量採用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來測定。首先，將培養上清液中的I型膠原與兔抗人I型膠原多克隆抗體(CIIEMICON)進行反應，然後使用經過氧化物酶標記的抗兔IgG多克隆抗體(HISTOFINE;日冷Nichierei)作為二次抗體進行標記。接著，對於標記的過氧化物酶添加2,2，_聯氮雙(3_乙基苯並噻唑啉一6—磺酸)二銨鹽(ABTS)及過氧化氫進行反應後，利用酶標儀測定405nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit測定各孔的蛋白量，通過每單位蛋白量的I型膠原產生量來評價I型膠原產生促進作用。另外，除樣品培養液以外，作為陰性對照使用添加0.5質量。/。FBS的DMEM培養基，作為陽性對照使用含有50pM的L一抗壞血酸磷酸酯鎂鹽(VCPMg)的添加0.5質量。/。FBS的DMEM培養基。I型膠原產生促進作用，是以當陰性對照(control)中的每單位蛋白量的I型膠原產生量定為100時的相對值來評價的。表2顯示該評價結果。tableseeoriginaldocumentpage12如表2所示，在樣品培養液中，可發現與對照組相比的顯著的I型膠原產生促進作用。由此明確可知，八寶樹的提取物具有I型膠原產生促進作用。ni型膠原產生作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例i所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104個接種正常人真皮纖維芽細胞。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加0.5質量。/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液，再孵育24小時。培養上清液中分泌的III型膠原的量採用酶聯免疫吸附測定法(ELisA)來測定。首先，將培養上清液中的ni型膠原與兔抗人m型膠原多克隆抗體(CIIEMICON)進行反應，然後使用經過氧化物酶標記的抗兔IgG多克隆抗體(HISTOFINE;日冷Nichierei)作為二次抗體進行標記。接著，對於標記的過氧化物酶添加2,2，一聯氮雙(3_乙基苯並噻唑啉_6—磺酸)二銨鹽(ABTS)及過氧化氫進行反應後，利用酶標儀測定405nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit測定各孔的蛋白量，通過每單位蛋白量的III型膠原產生量來評價III型膠原產生促進作用。另外，使用添加0.5質量y。FBS的DMEM培養基作為對照。m型膠原產生促進作用，是以當對照中的每單位蛋白量的III型膠原產生量定為100時的相對值來評價。表3顯示該評價結果。試樣濃度(mg/mL)相對值(％)Control1000.13229如表3所示，在樣品培養液中，可發現與對照組相比的顯著的m型膠原產生促進作用。由此明確可知，八寶樹的提取物具有m型膠原產生促進作用。IV型膠原產生作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例2所述的製造方法得到的八寶樹的花的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔微滴定板以每1孔2.0乂104個接種正常人真皮纖維芽細胞。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加5質量。/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液，再孵育5天。培養上清液中分泌的IV型膠原的量採用三明治ELISA法來測定。首先，將培養上清液中的IV型膠原與對IV型膠原的單克隆抗體(識別部位a2鏈)進行反應，然後與生物素化多克隆抗體反應。接著，添加親和素化辣根過氧化物酶，使其與生物素化多克隆抗體的生物素部結合。添加形成過氧化物酶的基質的3,3'，5,5'—四甲基聯苯胺使其發色，利用酶標儀測定650nm的吸光度。利用PIERCE公司制BCAProteinReagentAssaykit測定各孔的蛋白量，通過每單位蛋白量的IV型膠原產生量來評價IV型膠原產生促進作用。另外，使用添加5質量y。FBS的DMEM培養基作為對照。IV型膠原產生促進作用，是以當對照中的每單位蛋白量的IV型膠原產生量定為IOO時的相對值來評價。表4顯示該評價結果。_tableseeoriginaldocumentpage14如表4所示，在樣品培養液中，可發現呈試樣濃度依賴性的IV型膠原產生促進作用。由此明確可知，八寶樹的提取物具有IV型膠原產生促進作用。膠原酶活性阻斷作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的樹皮的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向Tris鹽酸緩衝液中添加試樣，調製各種濃度的樣品溶液。在樣品溶液中，添加I型膠原酶標準品和0.25mg/mL的異硫氰酸螢光素(FITC)標識的I型膠原，在37°。下孵育2小時。向其中添加酶反應終止液，在37"C下孵育30分鐘。通過醇沉澱法，得到含有分解後的膠原的上清液。利用螢光分光光度計測定上清液的螢光強度(激發波長495nm、螢光波長520nm)。以使用未添加試樣的Tris鹽酸緩衝液時的螢光強度作為對照螢光強度，以使用樣品溶液時的螢光強度作為樣品螢光強度，由下式求得的值作為膠原酶活性阻斷率。通過膠原酶活性阻斷率來評價膠原酶活性阻斷作用。表5顯示該評價結果。{(對照螢光強度_樣品螢光強度)/對照螢光強度}X100(%)tableseeoriginaldocumentpage14如表5所示，膠原酶活性阻斷率呈試樣濃度依賴性增加。由此明確可知，八寶樹的提取物具有膠原酶活性阻斷作用。[實施例6]黑色素產生抑制作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向90mm培養皿中以每1皿18000個接種B16小鼠黑素瘤(B16F0)細胞。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加5質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加5質量c/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液，再孵育5天。另外，除樣品培養液以外，作為陰性對照使用未添加試樣的添加5質量。/。FBS的DEME培養基，作為陽性對照使用含有50mM濃度的乳酸鈉的添加5質量n/。FBS的DEME培養基。培養結束後，利用胰蛋白酶處理回收細胞，轉移至1.5mL微型管中進行離心操作得到細胞沉澱物。用肉眼目測判斷所得到的沉澱物的黑化狀況。表6顯示目測判定標準。以陰性對照為判定5，以陽性對照為判定6，作為目測判定的基準。另外，向上述得到的沉澱物中添加組織溶解劑(商品名Solvable)並煮沸後，冷卻至室溫，通過分光光度計(日立產分光光度計U—3010)測定500nm的吸光度。通過上述判定及500nm吸光度來評價黑色素產生抑制作用。表7顯示該評價結果。tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage15tableseeoriginaldocumentpage16如表7示，在使用添加10mg/mL試樣的樣品培養液時，與陽性對照組相比僅有微小的黑化。由此明確可知，八寶樹的提取物具有黑色素產生抑制作用及以此為基礎的美白作用。DPPH自由基消除作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔微滴定板以每孔100mL添加用50容量％乙醇調製成各試樣濃度的樣品溶液。進而向其中以每孔100mL添加0.2mM的1,1—二苯基苦基苯肼(DPPH)乙醇溶液。充分混合後，在室溫下暗處靜置24小時後，測定來自於DPPH自由基的516nm的吸光度。以代替樣品溶液而僅添加50容量％乙醇時的吸光度為(A)，添加樣品溶液時的吸光度為(B)，根據下式求得的值作為DPPH自由基消除率。通過DPPH自由基消除率評價DPPH自由基消除作用。表8顯示該評價結果。{1—(B)/(A)}X100(%)tableseeoriginaldocumentpage16由表8明確可知，八寶樹的提取物具有基於DPPH自由基消除作用的抗氧化作用。SOD樣活性作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。在含有0.25mM的WST—1和lmM的Hypoxanthine的HANK，s(+)溶液75)^L中，添加用HANK，s(+)溶液調製成各試樣濃度的樣品溶液25pL。進而，添加Xanthine0xidase25^L(0.0075單位)，在37"C下反應15分鐘後，測定450nm的吸光度。以代替樣品溶液而僅添加HANK's(+)溶液時的吸光度為(A)，添加樣品溶液時的吸光度為(B)，根據下式求得的值作為超氧負離子消除率。通過超氧負離子消除率評價SOD樣活性作用。表9顯示該評價結果。{1—(B)/(A》X100(%)_tableseeoriginaldocumentpage17如表9所示，超氧負離子消除率呈試樣濃度依賴性的增加。由此明確可知，八寶樹的提取物具有基於SOD樣活性作用的抗氧化作用。[實施例9]過氧化脂質耐受性的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的花的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔板以每1孔2.0X104個接種人表皮細胞株HaCaT。接種培養基採用在達爾伯克改良依格爾培養基(Dulbcco，sModifedEagleMedium,DMEM)中添加10質量％的牛胎兒血清(FBS)的培養基。24小時孵育後，將培養基換成用添加10質量n/。FBS的DMEM培養基調製成各試樣濃度的樣品培養液。再孵育24小時後，將培養液換成含有任意濃度的t一叔丁基過氧化氫的Hanks(+)溶液。孵育2小時後，將溶液換成含有150pg/mL的中性紅的PBS(-)，在37'C下孵育2小時。將PBS(-)換成含有1容量％醋酸的50容量％乙醇水溶液，提取細胞內攝取的中性紅(二二一卜，》^:yK)。通過測定提取液的540nm的吸光度，並求出細胞生存率來評價過氧化脂質耐受性。另外，使用添加10%FBS的DMEM培養基在不添加試樣及叔丁基過氧化氫下進行培養的作為對照。過氧化脂質耐受性是以當陰性對照的細胞生存率設定為IOO時的相對值來評價。表10顯示該評價結果。_tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18如表10所示，細胞生存率呈試樣濃度依賴性的增加。由此明確可知，八寶樹的提取物具有過氧化脂質耐受性及基於此的抗氧化作用。透明質酸酶活性阻斷作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。將市售的透明質酸鉀鹽(來源於人臍帶)以0.9mg/mL溶解於0.1M磷酸緩衝液(pH7.0)中，作為基質溶液。將市售的透明質酸酶(來源於牛精巢)以5300單位/mL溶解於0.1M磷酸緩衝液(pH7.0)中，作為酶溶液。另外，酶溶液為臨用時調製。向試管中加入用0.1M磷酸緩衝液(pH7.0)調製成各試樣濃度的樣品溶液O.lmL和酶溶液0.3mL，在37"C下反應20分鐘。然後加入活化劑0.06mL，在37。C下反應20分鐘。再加入基質溶液0.15mL，在37。C下反應1小時。加入0.4NNaOH0.06mL使反應停止後立即用冰冷卻，添加硼酸緩衝液(pH9.1)0.06mL，煮沸3分鐘後再用冰冷卻。添加p—DABA溶液(Ehrilich試藥)2.0mL，在37"C下反應20分鐘後，從各試管移至96孔微滴定板中，利用酶標儀測定585nm處的吸光度。透明質酸酶的活性如果被阻斷，則作為透明質酸分解產物的N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)減少，由於Morgan—Elson反應的吸光度將降低。以使用未添加試樣的0.1M磷酸緩衝液時的吸光度為對照吸光度，以使用樣品溶液時的吸光度為樣品吸光度，將根據下式求得的值作為透明質酸酶活性阻斷率。通過透明質酸酶活性阻斷率來評價透明質酸酶活性阻斷作用。表ll顯示該評價結果。{(對照吸光度一樣品吸光度)/對照吸光度}X100(%)tableseeoriginaldocumentpage18如表11所示，透明質酸酶活性阻斷率呈試樣濃度依存賴性增加。由此明確可知，八寶樹的提取物具有透明質酸酶活性阻斷作用及基於此的抗炎作用。磷脂酶A2活性阻斷作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例1所述的製造方法得到的八寶樹的花的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。調製各濃度的試樣及含有20ng/mL的磷脂酶A2(PLA2)和3.3mM的DTNB(5，5—二硫代雙(2—硝基苯甲酸))的溶液，室溫下靜置10分鐘。向其中添加作為PLA2的基質的二庚醯基硫代一PC(1，2—雙(庚醯硫基)甘油膽鹼磷酸)至1.66mM，室溫下反應45分鐘。該反應中，由於PLA2分解基質而產生的硫醇，還原DTNB而生成5一巰基一2—硝基苯甲酸。然後，觀澱在5_巰基_2_硝基苯甲酸的最大吸收波長414nm處的吸光度。另外，測定代替PLA2而添加緩衝液時的吸光度，求出兩測定值的差。以未添加試樣時的值為(A)，添加試樣時的值為(B)，將根據下式求得的值作為PLA2活性阻斷率。通過PLA2活性阻斷率評價PLA2活性阻斷作用。表12顯示該評價結果。__tableseeoriginaldocumentpage19如表12所示，PLA2活性阻斷率呈試樣濃度依賴性增加。由此明確可知，八寶樹的提取物具有PLA2活性阻斷作用及基於此的抗炎作用。[實施例12]脂肪蓄積抑制作用的評價實驗在該評價實驗中，使用通過製造例2所述的製造方法得到的八寶樹的葉的提取物作為試樣。按照以下步驟進行評價。向96孔板以每1孔5.0X103個接種來自於皮下脂肪的正常人前體脂肪細胞CryoHPRAD—SQ(三光純藥株式會社)。接種培養基使用含有10質量％的FBS、2mM的L一谷醯胺、100單位/mL的青黴素、及100嗎/mL的鏈黴素的PGM培養基。培養2天後，進行培養基更換。新培養基使用在含有lOpG的胰島素、I)liM的地塞米松、200pM的吲哚美辛、及500nM的3—異丁基一1一甲基黃嘌呤的PGM—分化用培養基中添加各濃度的試樣的培養基。使用未添加試樣的PGM—分化用培養基作為對照。利用該培養基開始從前體脂肪細胞到脂肪細胞的分化誘導，直至對照組的細胞成熟且細胞內許多脂肪滴蓄積，培養10天14天。回收細胞，使用10容量％中性緩衝甲醛液固定細胞，用PBS(-)洗淨。向細胞中添加0.5質量比容量％的油紅0溶液，在37"C下培養2小時，染色脂肪。用PBS(-)洗淨細胞後，通過甲醇提取色素。對於提取液，利用酶標儀測定550nm處的吸光度。同時測定650nm的吸光度作為濁度，利用兩測定值的差求出中性脂肪細胞蓄積量。添加試樣的培養基中的中性脂肪細胞蓄積量，是以當對照組中的中性脂肪細胞蓄積量設定為100時的相對值來評價。表13顯示該評價結果。tableseeoriginaldocumentpage20如表13所示，脂肪細胞蓄積量隨著試樣濃度越高越減少。由此明確可知，八寶樹的提取物具有脂肪細胞蓄積抑制作用。下面例舉配合了本發明所述的八寶樹的提取物的皮膚外用劑(可作為細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑而適用的皮膚外用劑)及飲料的處方例。另外，以下只要沒有特別明示，各個成分的配合量均是指質量％。化妝水tableseeoriginaldocumentpage20tableseeoriginaldocumentpage21製法將(1)(14)的油相成分及(15)(18)的水相成分分別加熱到8(TC，混合均勻化後，將油相添加到水相中。加入(19)並利用均質機乳化。邊攪拌邊冷卻，在4(TC下預混合，添加溶解的(20)、(21)，攪拌、均勻化。[處方例3]美容液tableseeoriginaldocumentpage22製法將(1)(5)及(6)(9)的成分分別加熱至7CTC混合、溶解後，混合兩成分並利用均質機乳化。邊攪拌邊冷卻，在4(TC下添加(10)的成分，混合，均勻化。化妝水__tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23製法在(1)的成分中加入預先混合的成分(2)和(3)，依次添加(4)(10)的成分，混合、溶解、均勻化。[處方例5]潔膚霜(cleansingcream)[表18]tableseeoriginaldocumentpage23製法混合(1)(8)的油相成分，加熱溶解至7(TC。另一方面混合(9)(12)的水相成分，溶解並加熱至70°C。向該水相成分中慢慢添加上述油相成分後，添加(13)並用均質機均勻乳化。乳化後，冷卻至4(TC後，添加(14)並混合。W/0乳化型霜tableseeoriginaldocumentpage23tableseeoriginaldocumentpage24製法向混合(1)(5)的油相中，一邊攪拌一邊慢慢添加(6)(9)的水相，用均質機進行乳化。乳化後，添加(10)並混合。[處方例7]潔面凝膠[表20]tableseeoriginaldocumentpage24製法將(3)、(7)添加到(11)中並均質化後，在(1)和(2)中溶解(4)(6)並加入，加熱至7(TC並均勻地使其溶解。然後冷卻至40。C時添加(9)、(10)，最後加(8)進行中和。染髮劑(hairrinse)tableseeoriginaldocumentpage24tableseeoriginaldocumentpage25製法在(9)中加入(5)、(7)，加熱至70°C。另一方面混合(1)(4)並溶解，加熱至70。C。一邊攪拌該油相一邊慢慢加入事先調製好的水相進行預乳化，加入均質機進行均勻化後冷卻，在4(TC下添加(6)、(8)。護髮素(hairtreatment)tableseeoriginaldocumentpage25製法混合(1)(8)的油相成分，並加熱至80°C。另一方面，混合(9)(11)的水相成分，並加熱至85°C，將其添加到上述油相中並乳化，冷卻後在4(TC下添加(12)。[處方例]摩絲(Hairfoam)[表23]原液處方tableseeoriginaldocumentpage26tableseeoriginaldocumentpage27製法混合溶解(1)(10)形成油相。另一方面，將(11)(15)添加到(16)中，溶解形成水相。然後，在75"C下將油相添加到水相，用均質機均勻地乳化。然後進行冷卻，4(TC下添加(17)並混合。[處方例12]髮膠(hairgel)[表26]tableseeoriginaldocumentpage27(7)香料0.20(8)乙二胺四乙酸三鈉0.05(9)提取物(製造例l)0.10(10)氫氧化鈉(10質量％水溶液)0.50合計100.00製法在(1)中溶解(2)及(3)。然後依次添加(4)(9化後，添加(10)進行中和。[處方例13]湯尼水(tonic)[表27]成分配合量(質量％)(1)乙醇60.00(2)L一薄荷醇7.50(3)對羥基苯甲酸酯0.05(4)提取物(製造例l)1.00(5)辣椒酊0.70(6)香料0.30(7)聚氧乙烯硬化蓖麻油0.20(8)甘油1.50(9)精製水餘量合計100.00製法混合(1)(6)的醇相，均勻化備用。向5(TC下溶解的成分(7)中加入醇相，在加入預先均勻化的成分(8)和(9)並混合後，過濾。洗面奶[表28]成分配合量(質量％)(1)硬脂酸10.00(2)棕櫚酸10.00(3)肉豆蔻酸12,00(4)月桂酸4.00(5)油醇1.50(6)羊毛脂醇1.00tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31製法將(11)(15)在(7)中混煉，再將其添加到(6)(9)的水相中，混合，加熱至70°C。另一方面，混合(1)(5)的油相成分，加熱至7(TC。一邊攪拌油相，一邊添加到已加(10)的水相中，乳化。冷卻至4(TC後，添加(16)。W/0乳化型粉底(foundation)tableseeoriginaldocumentpage31製法均勻混合(8)(11)的油相成分，在均質機中添加(1)(7)使其分散調製油相分散液。將加熱溶解的(12)(14)添加到油相分散液中進行乳化。最後添加(15)並均勻混合。[處方例19]兩用粉底(twowayfoundation)__tableseeoriginaldocumentpage31tableseeoriginaldocumentpage32製法將(1)(9)的粉體相在錘式粉碎機中粉碎後，再在捏合機中混合均勻化。將(10)(15)的油相在8(TC下溶解並均勻化後，添加到粉體相中進行混煉。然後，用錘式粉碎機進行粉碎，將過篩的大部分(bulk)在金屬器皿中壓縮成型。工業實用性如上所述，根據本發明，可提供具有優異效果的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑及脂肪蓄積抑制劑。另外，通過在皮膚外用劑中配合八寶樹的提取物，可提供在防止改善皺紋、鬆弛、皮膚緊繃、老年斑、晦暗這類皮膚老化症狀方面發揮優異效果的防止改善老化用外用劑或對黑色素產生抑制發揮優異效果的美白用皮膚外用劑、對抗炎性發揮優異效果的抗炎用皮膚外用劑。進而，通過在食品中配合八寶樹的提取物，可提供在美容、健康保持或營養補充方面發揮優異效果的食品、飲料及藥品。權利要求1.一種細胞活化劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。2.—種膠原產生促進劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。3.—種膠原酶活性阻斷劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。4.一種黑色素產生抑制劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。5.—種抗氧化劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。6.—種抗炎劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。7.—種脂肪蓄積抑制劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。8.—種皮膚外用劑，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。9.一種食品，其特徵在於含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。全文摘要本發明提供的細胞活化劑、膠原產生促進劑、膠原酶活性阻斷劑、黑色素產生抑制劑、抗氧化劑、抗炎劑、脂肪蓄積抑制劑、皮膚外用劑及食品中含有八寶樹(Duabangagrandiflora)的提取物。文檔編號A61P17/18GK101516329SQ20078003480公開日2009年8月26日申請日期2007年9月4日優先權日2006年9月19日發明者三舛祐美,小路哲生,山村達郎,淺野陽子申請人:諾薇雅株式會社