大瀧六線魚單核苷酸多態性位點及引物的製作方法

2023-05-13 12:43:26 2

本發明屬於分子生物學領域，具體涉及大瀧六線魚單核苷酸多態性位點。
背景技術：
：大瀧六線魚(學名：hexagrammosotakii)為六線魚科六線魚屬的魚類。分布於朝鮮、日本以及中國東海、黃海、渤海等海域，系冷溫性近海底層魚類。大瀧六線魚的食性很廣，以底棲生物為主，也攝食小蝦、小魚。大瀧六線魚素以其味道鮮美肉質細膩而聞名，素有「北方石斑」之稱，與其它魚類相比大瀧六線魚的含水量較低(73.85％)，可食部分比值高，蛋白質含量極高(18.50％)，必需胺基酸含量高(7.25％)(kangbin)。大瀧六線魚是一種十分具有發展潛力的經濟魚種，但大瀧六線魚生長發育十分緩慢，體長一般約為15-25釐。大瀧六線魚性成熟較早，性成熟時間一般在2～3齡，雄魚早於雌魚，性成熟後體重增長放緩，體重拐點在3.6齡。目前，國內外有關大瀧六線魚的研究報導還比較少，主要集中在生物學地位、生態分布以及種群資源量，還有一些學者對其生理、生化等方面進行了研究。對於大瀧六線魚遺傳學方面的研究相對較少，目前國外只有habib等人基於coi、coiii-nd3-nd4l和cytb對黃海和日本海附近群體遺傳結構進行研究，國內的研究有劉奇和李瑩等人關於大瀧六線魚遺傳多樣性的研究，但取樣地都集中在黃渤海海域，且只使用了d-loop序列進行遺傳多樣性與遺傳結構的分析，並未使用cytb或coi基因進行對比分析。未見大瀧六線魚單核苷酸多態性方面的研究。單核苷酸多態性標記(snp：simplenucleotidepolymorphism)，是一種廣泛應用的遺傳學領域的dna分子標記。snp是廣泛存在真核生物基因組中的單核苷酸突變，一般有轉換、顛換、缺失、插入四種形式，其中動物體中以轉換顛換最為常見。單核苷酸多態性具有多態性高，提供的遺傳信息多，pcr擴增效果重複性好，以及在基因組中分散分布等優點，常用於生物的遺傳多樣性分析，遺傳圖譜和雜交育種等。由於單核苷酸多態性研究所用dna的數量少，對樣品要求低，因此，單核苷酸多態性分析在遺傳學領域具有廣泛的應用性。作為中國重要的漁業資源之一，開發大瀧六線魚與生長發育經濟性狀相關的snp標記研究是十分重要的。技術實現要素：本發明的目的在於提供與大瀧六線魚生長發育相關的單核苷酸多態性位點，本發明提供的單核苷酸多態性位點選自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因為a/t，seqnoid：2所示序列第228位等位基因為g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/t，seqnoid：4所示序列第269位等位基因為a/g。本發明提供的單核苷酸多態性位點，其中與大瀧六線魚體長增長關聯顯著的單核苷酸多態性位點選自：seqnoid：1所示序列第177位等位基因為a/t，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/tseqnoid：4所示序列第269位等位基因為a/g。本發明提供的單核苷酸多態性位點，其中與大瀧六線魚體重增長關聯顯著的單核苷酸多態性位點選自：seqnoid：2所示序列第228位等位基因為g/a，seqnoid：3所示序列第228位等位基因為c/t。本發明還提供所述單核苷酸多態性位點用於評估大瀧六線魚生長發育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種的用途。本發明提供一種大瀧六線魚單核苷酸多態性的檢測方法，包括以下步驟：1)基因組dna的提取：採用天根海洋動物組織dna提取試劑盒2)單核苷酸多態性pcr擴增：利用assaydesign3.1軟體設計單核苷酸多態性引物擴增大瀧六線魚基因組dna，獲得其擴增產物。3)擴增產物檢測：啟動massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將純化後的產物進行點樣，並用maldi-tof質譜儀分析，檢測結果使用typer4.0軟體進行分析。4)遺傳多樣性分析：根據每個個體鹼基類型取定基因型，利用popgene32計算遺傳多樣性參數。本發明體用提供能擴增出所述單核苷酸多態性位點的的引物對，引物對具有選自以下序列對所示的序列：seqidno：5和seqidno：6；seqidno：7和seqidno：8；seqidno：9和seqidno：10；seqidno：11和seqidno：12。本發明提供所述引物對在大瀧六線魚單核苷酸多態性位點檢測中的用途。本發明提供了所述引物對在評估大瀧六線魚生長發育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種的用途。實施例一、單核苷酸多態性位點篩選首先採用2b-rad技術與高通量測序結合，對大瀧六線魚進行簡化基因組測序，共發現158,733個snp，分布在27,404個序列標籤中。通過blast比對篩選其中與生長發育相關且位於編碼區域的snp位點，共得到21個snp位點。通過sequenom實驗平臺採用iplexgold技術及massarray系統檢測了21個snp位點在四個地理群體中的多樣性。四個地理群體所使用的樣本分別採自大連(n39°25′，e122°51′，野生群體，29尾)，舟山(n30°03′，e122°37′，野生群體，20尾)，琅琊臺(n35°30′，e119°58′，野生群體，30尾)，即墨(即墨山東省海洋生物研究院養殖場，養殖群體，60尾)，取尾鰭和肌肉組織，存放於95％的無水乙醇中，放於-80℃冰箱中備用。基因組dna的提取：使用北京天根生化科技有限公司的海洋動物組織基因組dna提取試劑盒提取大瀧六線魚樣品基因組dna。具體流程如下：首先採用assaydesigner3.1軟體進行引物設計，通過在四個地理群體120個樣本中進行pcr擴增，而後擴增產物去鹽後4000rpm離心4分鐘，在晶片上點樣，再點calibrant，並將晶片放到scout板上並放回compact中，使用massarray進行分析、質量控制及報告輸出。報告結果採用popgene1.32計算等位基因數(observednumberofalleles，na)、有效等位基因數(effectivenumberofalleles，ne)、觀望雜合度(observedheterozygosity，ho)、期望雜合度(expectedheterozygosity，he)、nei』氏多樣性指數(nei′sgenediversityindex，nei)。多態信息含量(polymorphisminformationcontent，pic)計算公式為(式中pi和pj是第i和第j個等位基因頻率，n是等位基因數目)。分析結果顯示17個位點具有多態性，平均等位基因數為1.9524，平均有效等位基因數是1.4571，平均觀望雜合度0.2158，平均期望雜合度為0.2432，平均多態信息含量為0.2517。二、snp位點與生長發育性狀關聯性研究在關聯性研究中將多態性位點與大瀧六線魚體重體長增量的生長發育性狀進行關聯。在即墨樣品中選取30尾魚體重體長相近，年齡約在1齡左右的大瀧六線魚進行螢光魚體t型外掛標籤標記，分別記錄初體重與初體長數據，在山東省海洋生物研究院即墨鰲山衛基地進行為期125天的養殖，期間每天餵食兩次與養殖池內的海水保持循環，記錄養殖結束後每個個體體重與體長數據。檢測養殖群體中具有多態性的snp位點，利用統計軟體spss對snp位點在30尾即墨養殖大瀧六線魚在不用基因型個體間的性狀進行多重比較(lsd)，去除出現少於3次的基因型，保證每個位點分析價值。4個與生長相關的單核苷酸多態性位點pic值範圍從0.3457～0.6084，平均為0.4600，有限等位基因數範圍從1.8000～3.0958，平均為0.8682；觀測雜合度0.2933～0.5115，平均值0.4089；期望雜合度0.4444～0.6770，平均值0.5554。4個位點均未偏離h-w平衡(p＞0.05)，最小等位基因頻率均大於0.05，說明4個位點均未受到非隨機交配的影響，且突變率較高，適合進行遺傳學方面的研究，具有進一步研究的價值。與生長發育具有顯著性關係的snp位點及其兩翼序列如表1所示。位點單核苷酸多態性序列正向引物序列反向引物序列hos10seqidno：1seqidno：5seqidno：6hos13seqidno：2seqidno：7seqidno：8hos14seqidno：3seqidno：9seqidno：10hos17seqidno：4seqidno：11seqidno：124個單核苷酸多態性位點的多樣性結果如表2所示。具有顯著性的位點計算結果如表3所示，hos10中tt基因型的體長增長比較顯著。hos13中gg基因型與其他基因型相比，與體重增量有著較為顯著的關係。位點hos14中，體重增量上，位點缺失與其他基因型都沒有明顯差距：基因型tt比基因型cc、ct體重增長更快，差別極其顯著；體長增量上，與其餘幾種基因型相比，tt基因型具有極其顯著的影響。hos17位點中ga基因型的體長增量明顯高於aa基因型，具有極顯著的影響。總體來看hos13對於體重增長有著顯著性影響，hos10與hos17對體長增長有著顯著性影響，hos14則對體重體長增長都用影響。一個標記與多個性狀相關聯可能與體重與體長本身就具有一定聯繫有關。開發出的多態性位點與生長發育相關的位點在今後大瀧六線魚的生長發育、人工繁殖等研究提供參考價值。表3不同位點的不同基因型個體間生長性狀的增量及多重性比較註：同列中不同字母數值間差異顯著(p＜0.05)，大寫字母表示差異及其顯著(p＜0.01)。三、單核苷酸多態性位點引物本發明根據基於簡化基因組測序(rad)利用二代測序技術所開發出的snp文庫，根據blast中生長相關鹼基序列的比對結果，並根據相關位點，設計了50對的篩選引物，在大瀧六線魚的20個個體中進行驗證。單核苷酸多態性引物的驗證擴增位於兩端已知序列之間的dna區域。每個pcr循環，反應混合體系都在模板變性、引物退火和引物延伸三種不同溫度下依序溫育。該過程可使用一種可編程序的溫度熱循環儀而達到自動化。5μl體系：模板1μl，pcrmastermix4μl(water1.850μl，pcrbuffer0.625μl，mgcl20.325μl，dntp0.1000μl，primermix1.000μl，hotstartaq0.100μl)。將pcr產物用sap(shrimpalkalinephosphatase，鹼性磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dntps。反應程序：94℃30s，[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)5cycles，72℃3min]40cycles，4℃保存，產物用樹脂進行純化。啟動massarraynanodispenserrs1000點樣儀，將樹脂純化後的延伸產物移至384-wellspectrochipbioarray上。將點樣後的spectrochip晶片使用maldi-tof質譜儀分析，檢測結果使用typer4.0軟體獲取原始數據及基因分型圖，檢查數據文件的完整性和正確性，將結果保存入相應存儲媒介並遞交生物信息室分析。使用軟體popgene32進行遺傳指標(等位基因(na：observednumberofalleles)、有效等位基因(ne：effectivenumberofalleles)、觀測雜合度(observedheterozygosity)、期望雜合度(expectedheterozygosity)、香農遺傳指數(shannon′sinformationindex(i))、nei氏多樣性指數(nei′sgenediversityindex(nei))、多態信息含量(polymorphisminformationcontent(pic)))計算。4個單核苷酸多態性位點的多樣性及引物見表4。表4其中tm是單核苷酸多態性的退火溫度，na為等位基因數，ne為有效等位基因數，obs_het觀望雜合度，exp-het為期望雜合度。pic為多態信息含量，i是香農指數，nei為nei氏多樣性指數，pic為多態信息含量。本發明的4對引物對20個大瀧六線魚基因組dna進行擴增，遺傳多樣性分析結果表明每個單核苷酸多態性位點平均等位基因數為2.75，平均有效等位基因數是2.3381，平均觀望雜合度0.4089，平均期望雜合度為0.5554。遺傳雜合度(geneticheterozygosity)包括了觀望雜合度和期望雜合度，表示群體某一特定基因位點上雜合子的比例，反應了群體遺傳變異程度的大小。觀測雜合度是指一個群體中觀察到的雜合子所佔的比例；期望雜合度則是指在哈溫平衡假設下雜合度的期望值，也稱為基因多樣度(genediversity)，僅取決於等位基因頻率。雜合度的數值越低，遺傳一致性越高，遺傳多樣性越低，4個位點的雜合度處於相對較高的水平。4個位點均未偏離hw平衡，偏離hw平衡的原因可能是由於這些位點在繁殖時會受到選擇的壓力，進而影響不同等位基因產生的頻率，或是由於非隨機交配所導致的平衡偏離。4個位點的最小等位基因頻率(minorallelefrequency，maf)均高於0.05突變率相對較高，較小的maf將會是統計效能降低，從而造成假陰性的結果，故而造成關聯性研究的偏差根據計算結果得出，4對單核苷酸多態性引物可用於大瀧六線魚遺傳多樣性檢測，數量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖做圖、以及家系和個體鑑定。本發明提供的4個單核苷酸多態性位點：seqnoid：1序列第177位等位基因a/t，seqnoid：2序列第228位等位基因g/a，seqnoid：3序列第228位等位基因c/t，seqnoid：4序列第269位等位基因a/g，均與大瀧六線魚生長發育性狀顯著性相關。同時驗證了2b-rad技術開發大瀧六線魚單核苷酸多態性位點的可行性。本發明提供的snp位點能與大瀧六線魚生長發育相關，能有效用於大瀧六線魚評估大瀧六線魚生長發育、大瀧六線魚選種或大瀧六線魚育種。當前第1頁12