孕馬血清促性腺激素雙抗體夾心elisa試劑盒的製作方法

2023-05-14 05:44:36

專利名稱：孕馬血清促性腺激素雙抗體夾心elisa試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種ELISA檢測試劑盒，具體地說是一種檢測孕馬血清促性腺激素的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
背景技術：
孕馬血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotrophin PMSG)又稱馬絨毛膜促性腺激素(equine chorionic gonadotropin, eCG)。PMSG 是從懷孕 40-120 天母馬血液中提純的一種糖蛋白激素，是一種經濟實用的促性腺激素，在生產上常用以代替較昂貴的促卵泡素(FSH)而廣泛應用於動物的誘發發情、超數排卵或增加排卵率(如提高雙羔率)；對卵巢發育不全或雄性生精能力衰退等也都可收到一定療效。由於孕馬血清中PMSG的含量受多種因素的影響，不同妊娠期、不同品種、同一品種不同年齡及胎次等都對其影響較大。因此在用血清提純PMSG之前，能對血清中PMSG效價進行檢測，對於生產提純具有重 要的指導意義。綜合生殖激素的檢測方法有多種多樣，主要有放射性免疫分析法、免疫膠體金檢測法、酶聯免疫分析法(ELISA)、反向間接血凝法、色譜技術、化學發光技術及生物傳感器技術等。目前，我國關於PMSG的檢測有3種方法。其一是大鼠卵巢增重法，該法是依據《中華人民共和國獸藥規範》(1993)血促性素(孕馬血清促性腺激素PMSG)生物檢定法，採用PMSG能促進大鼠卵巢增長的原理，將不同濃度的標準品注入相同來源的大鼠體內，根據卵巢增重情況繪製標準曲線，再將同體積待檢樣品注入同系相同生理狀況的大鼠體內，測定其卵巢增重從而確定激素含量。由於該法靈敏度低、實驗周期長、飼養實驗動物變數大、影響因素較多，不易於生產與科研中推廣應用。其二是反向間接血凝法，該法的原理是將純化的PMSG抗體吸附到雙醛化得羊紅血球表面，遇到相應抗原，血球即被動凝集，按完全凝集孔樣本的稀釋倍數即可得到抗原的血凝效價。此法雖達到快速檢測目的，但不同批次醛化紅血球差異大，且抗體純度要求高，質量要求均一，導致測定結果的差異大，也不適於生產應用。其三是放射性免疫檢測法，使放射性標記抗原和未標記抗原(待測物)與不足量的特異性抗體競爭性地結合，反應後分離並測量放射性而求得未標記抗原的量。此法快速準確，樣品需要量少，但由於此種方法具有高度放射性，對操作人員健康有害，同時檢測所需的儀器較昂貴，也不利於推廣應用。另外免疫膠體金檢測法只能實現定性和半定量檢測，目前階段不宜推廣使用。色譜技術、化學發光技術及生物傳感器技術同樣也可以用於激素檢測，但由於其檢測條件的限制性，在試驗室中作為科研檢測方法可以應用，但不適合於野外檢測，對實際生產的指導意義不大。ELISA憑藉其高度的靈敏度、良好的特異性、檢測速度及低檢測成本等優勢已被廣泛應用於生物、化學、醫學、環境科學等學科的分析檢測中。近年來，隨著生物醫學的研究進展，免疫學以其獨特的優勢有力的推動了醫學和生物學中各個領域的發展。目前美國DRG公司生產的孕馬血清促性腺激素快速檢測試劑盒，能夠在短短幾個小時內完成多個樣品的檢測，準確省時。但由於進口價格昂貴，一個96孔檢測板需要花費180(Γ2000元，同時由於DRG公司生產的試劑盒檢測範圍為0-80IU，國內有些馬種的最高含量達到140IU，超出了其檢測範圍，因此急需建立一種快速、準確、省時、簡便易操作的檢測PMSG含量的方法並研製試劑盒，解決進口昂貴、檢測範圍窄的問題。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種孕馬血清促性腺激素單克隆抗體。本發明的目的之二在於提供一種用於檢測孕馬血清促性腺激素的雙抗體夾心ELISA試劑盒，以克服上述不足。本發明提供一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細胞株D-3，其保藏編號為 CGMCC No. 6450。本發明提供一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細胞株A-4，其保藏 編號為 CGMCC No. 6449。雜交瘤細胞株D-3和A-4已於2012年9月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為雜交瘤細胞，保藏號分別為CGMCC No. 6450和CGMCCNo. 6449。本發明提供的一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體，是由雜交瘤細胞株D-3或A-4分泌獲得，所述雜交瘤細胞株D-3的保藏編號為CGMCC No. 6450，所述雜交瘤細胞株A-4的保藏編號為CGMCCNo. 6449。本發明提供一種用於檢測PMSG的試劑、藥劑或試劑盒，其包括上述的PMSG單克隆抗體。本發明提供一種檢測PMSG的方法，包括使用上述的PMSG單克隆抗體。本發明還提供了上述PMSG單克隆抗體在製備檢測PMSG試劑盒中的應用。本發明提供了一種檢測孕馬血清促性腺激素PMSG的雙抗體夾心ELISA試劑盒，其包括(I)包被PMSG單克隆抗體的酶標板；(2)酶標記的PMSG單克隆抗體；其中，包被在酶標板的PMSG單克隆抗體與酶標記PMSG單克隆抗體分別針對PMSG蛋白不同的抗原決定簇。進一步地，本發明試劑盒中包被在酶標板的PMSG單克隆抗體與酶標記PMSG單克隆抗體分別為雜交瘤細胞株D-3或A-4分泌獲得。優選地，所述包被在酶標板的PMSG單克隆抗體為雜交瘤細胞株D-3分泌獲得，酶標記PMSG單克隆抗體為雜交瘤細胞株A-4分泌獲得。所述雜交瘤細胞株D-3的保藏編號為CGMCC No. 6450，所述雜交瘤細胞株A-4的保藏編號為CGMCC No. 6449。本發明提供的PMSG試劑盒，還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、酶標抗體稀釋液、底物顯色液、終止液、PMSG標準品。本發明的試劑盒中，酶標記PMSG單克隆抗體的標記酶為辣根過氧化物酶，具體標記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶於ImL三蒸水,加入新鮮配製的O. lmol/L NaIO4O. 2mL，室溫下避光攪拌20min，混勻後裝入透析袋中，以O. 001mol/L pH 4. 4醋酸鈉緩衝液4°C透析過夜，加20 μ L0. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸鹽緩衝溶液，使pH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg純化PMSG單克隆抗體IgG lmL，混勻後裝入預先活化的透析袋中，以O. 05mol/L pH9. 6碳酸鹽緩衝液4°C透析過夜，使辣根過氧化物酶與抗體充分結合，取出透析袋中的液體，加入4mg/mL的硼氫化鈉100 μ L，置4°C還原6_8小時，加入等體積的飽和硫酸銨，4°C放置過夜，3000rpm,離心IOmin,將所得的沉澱溶於Iml O. 01mol/L的PBS中，裝入透析袋中以
O.01mol/L的PBS透析過夜充分除去硫酸銨，透析24_36h，離心除去沉澱，即得純化酶標記抗體。本發明試劑盒中，PMSG單克隆抗體的包被方法是將12. 44 μ g/mL的單克隆抗體按ΙΟΟμ L/孔加入到酶標板中，37°C孵育2h，用含0. 05%吐溫-20和0. 05%疊氮化鈉，ph7. 4的0. 02M磷酸鹽緩衝液PBST溶液洗滌。本發明檢測孕馬血清促性腺激素試劑盒可以彌補國內生物檢定方法的不足。僅需要幾個小時就能測得結果，相對於生物檢定法需要5天左右時間具有明顯時間優勢；相對於操作過程來說，本試驗僅需要簡單加樣，而且一塊96孔微量板可以檢測80-90個樣品，遠 比生物法操作簡單易行；本試驗方案耗費材料少，用量都在微量水平，每個樣品檢測成本為1(Γ15元，更適合於生產應用。運用本發明檢測試劑盒檢測PMSG最低檢測限為30mIU/ml，檢測範圍在3(T200mIU。本發明為生產中PMSG的快速檢測提供了可靠的手段。本發明試劑盒便於操作、使用成本低、穩定性和重複性好，適合大規模推廣應用。


圖I為5隻BALB/c系小鼠免疫PMSG後的抗血清吸光度圖。圖2為不同酶標板條的標準曲線，其中橫坐標上的1-6分別代表標準品的濃度O、30、90、271、810、2430mIU,縱坐標為吸光度值。圖3為酶標抗體不同工作濃度的標準曲線圖。圖4標準曲線圖。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I孕馬血清促性腺激素單克隆抗體的製備及鑑定I 材料I. I實驗動物BALB/c小鼠購自北京維通利華試驗動物公司；小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0購自中科院動物所。I. 2主要儀器和試劑酶標儀MK3購自熱電公司；酶標板購自Nunc公司；細胞培養板購自Coster公司。弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)由北京勤邦生物技術有限公司提供；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司；PMSG純品、HAT和HT選擇培養基等購自Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；其他常規化學試劑購自北京化學試劑公司，除特殊說明外均為分析純。
2 方法2. I動物免疫取PMSG提純品作為免疫原，分別用PBS (O. 01mol/L, pH7. 2)稀釋至lmg/mL左右備用。免疫小鼠時，取免疫原與等量的弗氏佐劑，製成乳化劑，按照下表的免疫程序免疫6-8周齡BALB/c小鼠5隻(分別編號為I#、2#、3#、4#、5# )，每隻小鼠100 μ L，免疫間隔為2周。三免後第7天，小鼠尾部採血，室溫靜置Ih，4°C過夜，IOOOOrpm離心lOmin，收集血清，4°C保存。表IBALB/c小鼠的免疫方案
權利要求
1.一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細胞株D-3，其保藏編號為CGMCCNo.6450。
2.—種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體雜交瘤細胞株A-4，其保藏編號為CGMCCNo.6449。
3.一種孕馬血清促性腺激素PMSG單克隆抗體，其由雜交瘤細胞株D-3或A-4分泌獲得，所述雜交瘤細胞株D-3的保藏編號為CGMCCNo. 6450，所述雜交瘤細胞株A-4的保藏編號為 CGMCC No. 6449。
4.一種用於檢測PMSG的試劑、藥劑或試劑盒，其包括權利要求3所述的單克隆抗體。
5.—種檢測PMSG的方法，其特徵在於，使用權利要求3所述的單克隆抗體。
6.檢測孕馬血清促性腺激素ELISA試劑盒，其包括 (1)包被PMSG單克隆抗體的酶標板； (2)酶標記的PMSG單克隆抗體； 其中，包被在酶標板的PMSG單克隆抗體與酶標記PMSG單克隆抗體分別針對PMSG蛋白不同的抗原決定簇。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述包被在酶標板的PMSG單克隆抗體與酶標記PMSG單克隆抗體分別為雜交瘤細胞株D-3或A-4分泌獲得。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述包被在酶標板的PMSG單克隆抗體為雜交瘤細胞株D-3分泌獲得，酶標記PMSG單克隆抗體為雜交瘤細胞株A-4分泌獲得。
9.如權利要求6-8任一所述的試劑盒，其還包括以下試劑中的一種或多種洗滌液、酶標抗體稀釋液、底物顯色液、終止液、PMSG標準品。
10.如權利要求6-8任一所述的試劑盒，其特徵在於，所述酶標記PMSG單克隆抗體的標記酶為辣根過氧化物酶，具體標記方法包括如下步驟取5mg的HRP溶於ImL三蒸水，加入新鮮配製的O. lmol/L NaIO4O. 2mL,室溫下避光攪拌20min,混勻後裝入透析袋中，以O.001mol/L ρΗ4· 4醋酸鈉緩衝液4°C透析過夜，加20 μ L O. 2mol/L ρΗ9· 5碳酸鹽緩衝溶液，使PH升高到9. 0-9. 5，加入含有IOmg純化PMSG單克隆抗體IgGlmL，混勻後裝入預先活化的透析袋中，以0.05mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩衝液4°C透析過夜，使辣根過氧化物酶與抗體充分結合，取出透析袋中的液體，加入4mg/mL的硼氫化鈉100μ L，置4°C還原6_8小時，加入等體積的飽和硫酸銨，4°C放置過夜,3000rpm,離心IOmin,將所得的沉澱溶於Iml0.01mol/L的PBS中，裝入透析袋中以0. 01mol/L的PBS透析過夜充分除去硫酸銨，透析24-36h，離心除去沉澱，即得純化酶標記抗體。
全文摘要
本發明提供了一種孕馬血清促性腺激素(PMSG)單克隆抗體雜交瘤細胞株D-3和A-4，其保藏編號為CGMCC No.6450和CGMCCNo.6449。本發明還提供PMSG雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其包括包被PMSG單克隆抗體的酶標板、酶標記的PMSG單克隆抗體，捕獲抗體和檢測抗體分別針對PMSG蛋白不同的抗原決定簇。本發明檢測試劑盒具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測定性快、定量準、重現性好等特點，並能對成品製劑進行標準校對，與現有商品化PMSG檢測試劑盒相比，費用低、檢測靈敏度高，且檢測PMSG最低檢測限為30mIU/ml，檢測範圍在30~200mIU，適合推廣應用。
文檔編號G01N33/577GK102876634SQ20121035103
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者韓國才, 蘇曉倩, 鄧亮 申請人:中國農業大學